JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Высокая пропускная способность протокол для функциональной оценки ВИЧ эффективного возобновления и распродажа скрытой proviruses описано и применяется тестирование воздействия мероприятий по ВИЧ транскрипции и сплайсинга. Представитель результаты эффекта задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга предоставляются.

Аннотация

ВИЧ остается неизлечимой вследствие существования водохранилища клетки, который затаивает стабильной и скрытая форма вируса, который остается невидимым для иммунной системы и не является объектом текущего антиретровирусной терапии (корзину). Было показано, что транскрипция и сплайсинга укрепить задержки ВИЧ-1 в отдыха CD4 + Т-клеток. Реверсирование задержки с помощью задержки разворота агентов (МРВ) в «шока и убить» подход подробно изучена в попытке очистить этот водоем, но показал таким образом далеко не любой успех в клинических испытаниях из-за отсутствия развития адекватного малых молекул, которые могут эффективно возмущают это водохранилище. Представленные здесь протокол предоставляет метод для надежно и эффективно оценки задержка разворота агентов (МРВ) на транскрипцию ВИЧ и сплайсинга. Этот подход основан на использовании LTR-driven двойной цвет репортер, который может одновременно измерить эффект ЛРА на транскрипции и сплайсинга проточной цитометрии. Протокол, описанные здесь является адекватным для адэрентных клеток, а также клеток в суспензии. Это полезно для тестирования большое количество наркотиков в высокой пропускной способности системы. Метод является технически простой для выполнения и экономически эффективным. Кроме того использование проточной цитометрии позволяет оценить жизнеспособность клеток и таким образом наркотиков токсичности в то же время.

Введение

Несмотря на эффективную долгосрочную антиретровирусной терапии ВИЧ сохраняется в состоянии скрытой как комплексной Провирус в памяти клеток CD4 + T1. Структура хроматина ВИЧ-1 5' долго терминала повторить (LTR) промоутер и Эпигенетические модификации, такие как метилирование гистонов и диацетилморфина ДНК methyltransferases (DNMT) и гистонов комплексы (HDAC) являются важными механизмами, ведущих к транскрипционный анализ репрессий и, таким образом, задержка после интеграции2,3. Большое разнообразие задержка обратного агентов (МРВ) исследована для их эффективности побудить вирус производства в пробирке и в естественных условиях от латентно инфицированных отдыха CD4 + T клетки4,5,6,7 ,8. Среди МРВ испытания, HDACi (ингибиторы ГДАЦ) и ставка bromodomain ингибиторы (Бетис) вызвать decondensation хроматина и выпуска позитивные транскрипции удлинение фактор b (P-TEFb) соответственно, ведет к последующей освобождает от транскрипционный анализ репрессии на 5' LTR и активации ВИЧ выражение9,10,11,12,13. Однако масштабы оживления, достигнутый этими МРВ был ограничен, как было отмечено лишь незначительное увеличение связанные ячейки unspliced ВИЧ мРНК (нас РНК), свидетельствует о вирусных транскрипции, ex vivo14,15. Важно отметить, что эти МРВ также удалось вызвать снижение частоты латентно инфицированных клеток.

ВИЧ выражение может быть ограничено неэффективных сплайсинга16 , а также дефекты в ядерного экспорта умножить сращивания РНК ВИЧ (РНК MS)17. Таким образом необходимы выявления новых классов МРВ, которые являются более мощными и могут влиять на различные аспекты вируса производства после интеграции. Кроме того развитие новых анализов, которые помогают определение оптимального соединения эффективно обратить задержка не требуется.

Здесь представлен протокол, который использует подход высокой пропускной способностью для функциональной оценки воздействия мероприятий по ВИЧ LTR-driven транскрипции и сплайсинга. Короче говоря новой инициативе LTR двойной цвет репортер системы pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (рис. 1) используется для оценки ВИЧ реактивации проточной цитометрии. В этом флуоресцентные репортер выражение unspliced ВИЧ мРНК (4 КБ) приводит к расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) выражение, в то время как выражение mRNA сращивания (2 kb) приведет к выражению флуоресцентный белок Discosoma sp. красный (DsRed). Вкратце мы использовали флуоресцентный протеин сплавливания Env-EGFP, gp140unc. EGFP, где кодирующая последовательность EGFP был помещен в рамку с ООН рассеченного и усеченной форме конверта (Env). Изменения были введены к удалять сайт расщепления, предотвращая диссоциации Env в gp120 и gp41-EGFP и усечение гп160 белка до трансмембранного домена, создание растворимых Env аналог, который облегчает правильно складывать и выражение EGFP. Выражение в ячейке, Rev локализуется в ядро, где она является посредником при ядерной цитоплазматического экспорта 4 КБ env мРНК через взаимодействие с элементом гибкой rev (RRE). Усечение Env не компромисс RRE, который лежит между gp120 и gp41 и A7 3' сращивания сайта. В этой системе, сплайсинга ВИЧ-1 сращивания доноров 4 (SD4) и сращивания акцептора 7 (SA7) результатов в производстве 2 КБ мРНК кодирования нефункциональные Rev белка, усечены в аминокислоту 38 сливается с DsRed флуоресцентный белок, RevΔ38-DsRed. Вкратце DsRed был вставлен в 2-го экзона Rev на аминокислоты 38 путем перекрытия расширение18. Чтобы облегчить ядерного экспорта unspliced мРНК, млекопитающих выражение вектор кодирования Rev (NL4.3pCMV-Rev) была совместно transfected с помощью флуоресцентных репортер конструкции (рис. 2). Этот уникальный репортер конструкции, описанный здесь полезен в высок объём оценки ВИЧ транскрипции и сращивания, без необходимости использования вирусных векторов.

протокол

Примечание: Процедуры для клонирования, трансформации и последовательности, рассматриваются в других18,19. Протоколы здесь начинаются от трансфекции млекопитающих выражение векторов (рис. 3).

1. transfection клеток HEK293T с двойной цвет репортер построить

  1. Культивировать клетки HEK293T в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) в 5% CO2 инкубатора 37 ° c. После оттаивания, клетки HEK293T проход 2 - 3 раза перед их использованием в трансфекции экспериментов. Это даст время клетки, чтобы оправиться от размораживания процедуры.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Серьезной проблемой остается загрязнение микоплазмы клеточных культур. Существенно важное значение для снижения риска загрязнения микоплазмы и избежать распространения20надлежащей лабораторной практики и регулярное тестирование клеточных культур.
  2. Разделение клетки один день 1:2 до посева и перенести их в свежие DMEM среднего. Культивировать клетки для 24 h в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
  3. За день до трансфекции, удалить носитель из колбы стремлением и мыть клетки с Дульбекко фосфат буфер солевой раствор (DPBS) свободного кальция (Ca2 +) и магния (Mg2 +), чтобы удалить следы сыворотки.
  4. Обойтись 5 мл раствора (0,05% - 10 мм в PBS) трипсина ЭДТА в сосуд культуры и поместите его при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 2-5 мин.
  5. Когда клетки отсоединены, добавьте 5 мл DMEM дополнена 10% (v/v) FBS далее подавляют активность трипсина, которые могут повредить клетки.
  6. Нежно ресуспензируйте, закупорить суспензию клеток вверх и вниз, чтобы порвать пряди.
  7. Развести 1:10 клеток в Трипановый синий краситель (0,4%).
  8. Количество живых клеток, которые не занимают Трипановый синий с помощью микроскопа (10 x цель) и haemocytometer.
  9. Рассчитать количество жизнеспособных клеток на миллилитр, принимая среднее число ячеек и умножив его на 10000 и коэффициент разрежения (1:10) от Трипановый синий краситель.
  10. Пластина 2 х 104 клетки в 100 мкл DMEM среды с 10% FBS без антибиотиков в 96-луночных плоскодонные пластина для 24 h.
  11. Для каждой скважины, разбавить 400 нг pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 нг pCMV-RevNL4.3 и 100 нг pCMV-Tat101AD8-флаг ДНК в 50 мкл сыворотка бесплатно среды. Осторожно перемешать. Для экспериментов без ТАТ используйте соответствующий пустой pcDNA3.1 вектор ТАТ (-).
    Примечание: Настоятельно рекомендуется использовать эндотоксинов свободной ДНК. Для этого подготовьте с помощью midi или maxiprep комплект для очистки нуклеиновых кислот ДНК, эндотоксинов бесплатно. Определите чистоту ДНК путем измерения коэффициента ОД 260/280, который должен быть между 1.7 и 1.9.
  12. Перемешать Реагент липидов нежно перед использованием, а затем разбавляют 0,65 мкл в 50 мкл сыворотка бесплатно среды. Осторожно перемешать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Объединить разреженных ДНК с реактивом разреженных липидов.
  14. Осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Решение может появиться Облачно.
    Примечание: Перейдите к пункт 1.15. в течение 30 мин.
  15. Отказаться от 100 мкл на хорошо реагент ДНК комплексы липидов каплям на верхней части клетки.
  16. Смешайте нежно покачиваясь пластину и обратно.
  17. Инкубировать пластину для 5 h в 5% CO2 увлажненные инкубатора 37 ° c.
    1. Каждый микс реакции достаточно для transfection одной скважины (96-луночных). Настройте объем и количество компонентов в зависимости от количества наркотиков и комбинацию, которая будет испытываться и счета для дозирования вариации. Все условия обычно проверяются в triplicates.
    2. Transfect дополнительные скважины с 100 нг ЦМВ driven EGFP и DsRed-Экспресс ДНК плазмиды для целей компенсации.

2. Лечение Transfected HEK293T клеток с задержкой вспять агентов

Примечание: До калибровочных определите физиологического состояния каждого ЛРА путем измерения жизнеспособности клеток после воздействия высоких и низких доз препарата с распространением assay клетки.

  1. Разбавить каждый ЛРА на соответствующие рабочие концентрации с среднего роста (например, 1 мкм для JQ1(+)).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Воссоздать Лиофилизированные препараты с соответствующим растворителем до концентрации 10 мм. Хранить запас МРВ все на-80 ° C в одноразовых Алиготе (по 5 мкл) для того, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания.
  2. Тщательно аспирационная трансфекции средний с многоканальным и заменить 100 мкл носитель, содержащий соответствующие ЛРА (таблица 1). Добавьте средне очень аккуратно вдоль стены колодца во избежание отсоединения transfected клеток HEK293T, которые известны легко отсоединить от поверхности плиты культуры.
  3. Инкубировать пластину для 48 ч в 5% CO2 увлажненные инкубатора 37 ° c.

3. Окрашивание Transfected клеток с поправимо жизнеспособности краситель для потока Cytometry анализ

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Удаление омертвевших клеток и космического мусора имеет важное значение для ликвидации ложных срабатываний и получения результатов самого высокого качества.

  1. Отсоедините клетки в средствах массовой информации, с использованием 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS) за хорошо и аккуратно закупорить вверх-вниз (~ 5 раз) с многоканальный, избегая вспенивания средств массовой информации. При необходимости отсоедините клетки от пластины с использованием 35 мкл на хорошо раствор трипсина ЭДТА (0,05% - 10 мм в PBS) и инкубации 5 минут при 37 ° C, прежде чем нейтрализации со средой, содержащей сыворотку.
  2. Передать 96-луночных V-днище клетки.
  3. Спиновые клетки для 5 мин на 500 x g при 4 ° C, а затем тщательно аспирационная средне/PBS без касатьться клетки.
  4. Вымойте клетки по крайней мере 1 раз с 200 мкл белка/сыворотка бесплатно PBS.
  5. Центрифуга на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант, наклоняя тарелку и удаление буфера мыть без касатьться клетки.
  6. Приготовьте рабочий раствор красителя поправимо жизнеспособности путем разбавления 1: 1000 краситель жизнеспособность в белок/сыворотка бесплатно PBS. Подготовка 50 мкл разбавленного пятно на хорошо.
    Примечание: Жизнеспособность красителей доступны в диапазоне цветов, подходит для использования с голубой, красный и фиолетовый лазеров. Подготовьте раствор красителя поправимо жизнеспособность resuspending один флакон лиофилизированных краситель (компонент A) с 50 мкл безводный ДМСО (компонент Б). Хранить при-20 ° C в однократного использования аликвота (1 мкл каждого), защищенный от света.
  7. Добавьте 50 мкл разбавленного жизнеспособности красителя для каждой скважины и смешивать клетки, закупорить вверх и вниз с многоканальным.
  8. Пятно на 10-15 мин при температуре 4 ° C, защищенный от света.
  9. 1 - 2 раза промойте 150 мкл буфера мытья (PBS с 1% ЭДТА бычьего сывороточного альбумина и 2 мм).
  10. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  11. Исправьте клетки с 100 мкл свежеприготовленные 1% формальдегида в буфере мыть за 10-15 мин при температуре 4 ° C в темноте.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Формальдегид является весьма токсичным. Готовят раствор 1% формальдегида в Зонта избегать вдыхания при ношении перчатки и защитные очки для защиты.
  12. Вымойте клетки 1 - 2 раза с 100 мкл буфера мытья.
  13. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  14. Ресуспензируйте Пелле клеток в 70 мкл буфера мытья.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Фиксированные клетки могут храниться при температуре 4 ° C в темноте для анализа на следующий день на проточный цитометр.

4. EGFP и измерения DsRed проточной цитометрии и анализа данных

Примечание: Анализ на проточный цитометр ВИЧ транскрипции (% EGFP) и сплайсинга (% DsRed). Отбор образца до запуска с 70 мкм клеток сито или 100 мкм нейлоновая сетка, чтобы избежать засорения сопла.

  1. Вскакивать цитометр и компьютер по крайней мере 10 минут до использования для обеспечения лазеры согреться.
  2. Перед выполнением примеров и начала сбора данных, заполните бак платье с 0,9% физиологического раствора и убедитесь, что гипохлорит натрия таблетки добавляется в емкость для отходов.
  3. Проверка потока ячейки для воздушных пузырьков.
  4. Убедитесь, что детекторы и фильтры подходят для эксперимента.
    Примечание: Для EGFP, использование синего лазера (488 нм) и полосовой 530/30, в то время как DsRed Express оптимально обнаруживается с помощью желтый лазер (561 Нм) и полосовой 610/20. Синий лазер (488 нм) и полосовой 610/20 также может использоваться для обнаружения DsRed выражение.
  5. Проверьте производительность цитометр и чувствительности через детекторы, запустив калибровки бусины.
  6. Отрегулируйте вперед (FSC-A) и боковой (SSC-A) разброс напряжения с незапятнанное образец так, что основное население на экране и четко заметной.
    Примечание: FSC (рассеянном свете) является измерение света дифракции в плоский угол, который зависит от объема клетки (клеток поверхности или размер), а ККК (сторона рассеянный свет) является измерение света дифракции в прямым углом, который пропорциональн к Гранулярность клеток и внутренней сложности.
  7. Выполните ручной или автоматической компенсации с помощью сингл окрашенных образцов, обеспечении минимальных побочных EGFP + населения в DsRed детектор и наоборот.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Для целей компенсации Используйте образец клеток, выражая каждый из одного цвета флуоресцентных белков, а также поодиночке окрашенных краской поправимо жизнеспособность клеток. Не используйте FITC и PE компенсации бусы для компенсации флуоресцентные белки EGFP и DsRed из-за различных спектральных характеристик. Контроль компенсации должно быть достаточно ярким, чтобы разрешить положительных и отрицательных населения.
  8. Создание участков и установить ворота, используя флуоресценции минус один (FMO) элементов управления.
  9. Получить и записать как минимум 10 000 событий жизнеспособных клеток в образце. Запуск образцов на средней или низкой скорости, чтобы избежать Дуплеты, проходя через лазерный перехвата. Используйте импульсный геометрии стробирования такие как SSC-A по сравнению SSC-H для ликвидации Дуплеты. Проверьте стабильность выполнения путем построения время по сравнению SSC-A чтобы увидеть как даже поток это во время выполнения.
  10. В конце выполнения очистить fluidics цитометрия потоков с концентрированные чистящие средства, а затем воду на 5 мин.
  11. Выключение системы, сбросить отходы и заново заполнить бак платье после приобретения.
  12. Анализировать данные с помощью программного обеспечения анализа потока данных цитометрии. Исключить ячейки мусор и комок (Дуплеты), основанный на передней и боковых разброс, а затем устранить мертвые клетки, используя жизнеспособность краска пятно (отрицательные населения = живой клетки). Определить ячейки, выражая EGFP и DsRed (рис. 4), а также доля сращивания продукта DsRed /(DsRed + EGFP) (рис. 5).
  13. Определите влияние ЛРА на ВИЧ транскрипции и сращивания, сравнивая необработанных клетки и клетки подвергаются лица или сочетание МРВ (рис. 5).

Результаты

Представитель результаты показаны на рисунке 5 выражение ВИЧ-1 unspliced (EGFP) и сращивания продуктов (DsRed) после лечения с bromodomain ингибитор СВ1. JQ1(+) и ТАТ значительно увеличилась доля клеток, выражая EGFP (2.18 и 4.13 ФК над ДМСО соответственно; n = 3) свидетельствует о u...

Обсуждение

Учитывая трудности в области измерения реактивации вируса ex vivo, широкий спектр в пробирке, которые со временем были разработаны модели для изучения задержка ВИЧ, включая латентно инфицированных клеток T линии (J-латов, АЧ2, U1), основной модели латентной инфекции отдыха) O'Doherty, Левин, Грин и...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана проект Грант APP1129320 и Грант APP1052979 программы от NHMRC Австралии. Мы благодарим д-р Адам Wheatley, д-р Марина Александр, д-р Дженни л Андерсон и Мишель ю. ли за предоставление основных конструкций и советы для успешного завершения этой работы. Мы также благодарим сотрудников DMI потока объекта за их советы и щедрой помощи в поддержании проточный цитометр, используемые в данном исследовании.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)ATCCCRL-3216Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141Origin Australia
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070Serum free medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry reagents
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)LabcoSODHYPO-5LConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7xMPBioIM76670Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterileCorningCLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer capCorning35223512 x 75 mm style, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Micro test tubes, bulkBIO-RAD2239391microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without capCorning35200812x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test TubesCorning352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MicroscopeNikon TMS310528
Centrifuge 5810R refrigeratedEppendorf5811000487with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data AnalysisBMG LabtechMARSFLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7version 7.0c

Ссылки

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143EGFP DsRed

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены