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要約

HIV の効率的な再活性化の機能評価および潜在的な proviruses のクリアランスのための高いスループット プロトコル説明および HIV 転写の介入の影響をテストおよび選択的スプライシングによって適用しました。LTR 駆動の転写に対するエージェントの逆転と融着接続の遅延の効果の代表的な結果を提供しています。

要約

Hiv 感染細胞の貯水池、港湾の免疫システムには見えないままで、現在の抗レトロ ウイルス療法 (カート) では対象にならないウイルスの安定性と潜在的なフォームの存在により不治のまま。転写・ スプライシングは、静止 cd4 陽性 T 細胞の hiv-1 潜伏を補強するために示されています。「衝撃と殺す」アプローチにおける待機時間逆転剤 (LRAs) の使用による潜時の逆転この貯水池をパージする試みで広く研究されているが、ない十分な小型の開発の欠乏のための臨床試験にも成功を示しているこれまでのところ分子を効率的にこの貯水池を混乱させることができます。ここで提示されたプロトコルは、確実かつ効率的に HIV 転写待ち時間逆転エージェント (LRAs) の評価と選択的スプライシングのメソッドを提供します。このアプローチは、フローサイトメトリーによる転写、スプライシング、LRA の効果を同時に測定することができます LTR 駆動のデュアル カラー記者の使用に基づいています。ここで説明されているプロトコルは付着性のセルとして懸濁液の細胞に適しています。高スループットのシステムで多数の薬をテストするために便利です。シンプルに実装してコスト効果の高い方法は技術的にあります。また、フローサイトメトリーの使用セル実行可能性の評価を可能にし従って同時に毒性の薬物。

概要

効果的な長期的な抗レトロ ウイルス療法にもかかわらず HIV は潜伏状態でメモリー cd4 陽性 T 細胞1の統合 provirus として保持します。HIV 1 5 のクロマチン構造 ' 長いターミナル繰り返し (方向 LTR) のプロモーターとエピジェネティック修飾ヒストンのメチル化、脱アセチル化ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) し、DNA メチル基転移酵素 (DNMT) などにつながる重要なメカニズムは、転写抑制およびこうして統合後待機時間2,3。In vitro におけるウイルス産生を誘導するため待機時間逆転エージェント (LRAs) の大きい変化を調べたし、から生体内で潜在感染休憩 cd4 陽性 T 細胞4,5,6,7 ,8。LRAs 間テスト、HDACi (HDAC の抑制剤)、ベット ブロモ ドメイン阻害剤 (ベティス) クロマチン decondensation と正の転写伸長因子 b (P TEFb) のリリースをそれぞれ誘導する、転写の緩和以降につながる5' LTR の抑圧と HIV 式9,10、11,12,13の活性化。ただし、ex vivo14,15だけ細胞の, HIV mRNA (米国 RNA)、ウイルスの転写を示すものの緩やかな増加がみられたように、これら LRAs により再活性化量は限られていた。重要なは、これら LRAs も潜伏感染細胞の頻度の低下を誘導するために失敗しました。

HIV 式は、スプライシングは、乗算の HIV RNA (MS RNA)17の核外輸送の欠陥と同様、非能率的なスプライシング16によってさらに制限があります。したがってより強力なウイルス生産統合後の異なる側面に影響を与えることができます LRAs の識別の新しいクラスが必要です。さらに、効率的に待機時間を逆に最適な化合物の定義に役立つ新規アッセイの開発が必要です。

ここでは、プロトコルが表示され、HIV LTR 駆動転写、スプライシングの介入の影響の機能評価のための高スループット アプローチを利用します。簡単に言えば、新しい LTR 駆動のデュアル レポーター システム pLTR.gp140/EGFP を色します。RevΔ38/下流 (図 1) は、フローサイトメトリーによって hiv 感染の再活性化を評価するために使用されます。スプライシングは、mRNA (2 kb) の式はDiscosoma の sp赤 (下流) の蛍光蛋白質の表現につながるこの蛍光レポーターで, HIV mRNA (4 kb) の発現は強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式に します。簡単に言えば、蛍光の Env EGFP の融合蛋白質は、gp140unc を使用しました。EGFP、EGFP のコーディング シーケンスが封筒 (Env) の非劈開と切り捨てられた形でフレームに配置された場所。Gp120 と gp41 EGFP、Env の解離を防ぐ胸の谷間サイトをアブレーションする可溶性の Env のアナログは、正しい折り畳みが容易になりますを作成する膜貫通ドメイン前 gp160 タンパク質を切り捨てるため、変更が導入されたとEGFP の発現。それが 4 kb のenvの核細胞質の輸出を仲介する核に局在する Rev セル内の式、時 rev 応答要素 (RRE) との相互作用を介して mRNA。Env の切り捨て gp120 と gp41、A7 3' スプライス部位のある RRE 妥協をしません。このシステムは、HIV - 1 選択的スプライシング ドナー 4 (SD4) をスプライスし、スプライスの受容体 7 (SA7) 結果は 2 kb の mRNA Rev の非機能性タンパク質アミノ酸 38 で切り捨てをエンコード融合した DsRed 蛍光蛋白質、RevΔ38 下流に。簡単に言えば、下流は重複延長18アミノ酸 38 で Rev の 2ndエクソンに挿入されました。MRNA の核輸出を容易にするには、エンコード Rev (pCMV RevNL4.3) 哺乳類発現ベクターは蛍光レポーター構成 (図 2) と co transfected だった。ここで説明したこのユニークな記者のコンス トラクターは、HIV 転写とウイルスのベクトルを使用することがなく、スプライシングの高スループット評価に便利です。

プロトコル

注:クローン作成手順については、変換とシーケンスは、18,19を別の場所で説明します。本プロトコルは哺乳動物発現ベクター (図 3) の導入から開始します。

1. デュアル カラー記者と HEK293T 細胞のトランスフェクションを構築します。

  1. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン (100 U/mL)、37 ° C で 5% CO2インキュベーターでストレプトマイシン (100 μ g/mL) を添加した HEK293T 細胞を養う解凍後、トランスフェクションでそれらを使用する前に 2-3 回通過 HEK293T 細胞実験します。これは解凍の手順から回復する細胞の時間を与えるでしょう。
    注意:細胞培養のマイコ プラズマ汚染深刻な問題として残っています。よい実験室の練習および細胞培養の定期試験は、マイコ プラズマ汚染のリスクを減らすし、拡散20を避けるために不可欠です。
  2. 1:2 1 日播種前にセルを分割し、新鮮な DMEM 培地にそれらを転送します。37 ° C で 5% CO2インキュベーターで 24 h の細胞を養う
  3. トランスフェクション、前日吸引によりフラスコからメディアを取り出して、ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) ソリューションのカルシウム (Ca2 +) とマグネシウム (Mg2 +) 無料でセルを洗浄して血清のトレースを削除します。
  4. 培養容器にトリプシン-EDTA 溶液 (0.05% - PBS で 10 mM) 5 mL を分注、2 〜 5 分の 5% CO2インキュベーターで 37 ° c に置きます。
  5. セルを取り外したら、さらに細胞に損傷を与えるトリプシン活性を阻害する 10% (v/v) FBS 添加 DMEM の 5 mL を追加します。
  6. 上下を千切ってに細胞懸濁液をピペットで優しく再懸濁します。
  7. トリパン ブルー染色 (0.4%) で、セル 1:10 を希釈します。
  8. 占有しないトリパン ブルー顕微鏡 (対物レンズ 10 倍) と、haemocytometer を使用して生きているセルをカウントします。
  9. トリパン ブルー色素の希釈係数 (1:10) で染色し、細胞数の平均を取ることと、10,000 を掛け合わせることによって 1 ミリリットルあたりの生菌数を計算します。
  10. 2 x 10 の4セル 10 %dmem 培の 100 μ l をプレート 24 h の 96 ウェル平底プレートに抗生物質がない政府短期証券。
  11. 各ウェルの希釈 400 pLTR.gp140/EGFP の ng。RevD38/下流 20 pCMV RevNL4.3の 100 ng pCMV Tat101AD8の ng-50 μ L の血清の自由な媒体でフラグ DNA。優しく混ぜます。Tat なし実験、マッチの空 Tat ベクトル pcDNA3.1 (-) を使用します。
    注:エンドトキシン フリーの DNA を使用することを強くお勧めします。そのため、midi や maxiprep 核酸精製キットを用いたエンドトキシン フリー DNA を準備します。1.7 と 1.9 間べき 260/280 OD の比率を測定することによって DNA の純度を決定します。
  12. 使用前に軽く脂質試薬をミックスし、50 μ L の血清の自由な媒体で 0.65 μ L を希釈します。穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
  13. 希薄化後の脂質試薬と希釈した DNA を組み合わせます。
  14. 穏やかに混合し、室温で 20 分間インキュベートします。曇り、ソリューションが表示されます。
    注:1.15 のステップへ進みます。30 分以内
  15. セルの上に drop-wise 脂質試薬・ DNA 錯体のウェルあたり 100 μ L を分注します。
  16. ロッキング プレートを前後で軽く混ぜます。
  17. 37 ° C で 5% CO2加湿インキュベーターで 5 h 用プレートを孵化させなさい
    1. 各反作用の組合せは単一の井戸 (96 ウェル) の transfection のために十分です。量とピペッティング バリエーションのアカウントと薬と、テストされる組み合わせの数に従ってコンポーネントのボリュームを調整します。すべての条件は通常トリプリケートでテストされます。
    2. 100 追加の井戸を transfect 補償目的のための CMV 駆動の EGFP とした DsRed エクスプレス DNA プラスミドの ng。

2. Transfected HEK293T の治療細胞遅延剤を反転

注:各試験の前に細胞増殖アッセイと薬物の線量の高低に暴露後、細胞の生存率を測定することにより各 LRA の生理学的条件を決定します。

  1. 各 LRA 培地で適切な使用濃度に希釈 (例えば、 JQ1(+)) の 1 μ M。
    注意:10 mM の濃度に適切な溶媒と凍結乾燥医薬品を再構築します。シングルユース因数 (各 5 μ L) 繰り返し凍結融解サイクルを避けるためにすべて株式 LRAs-80 ° c に格納します。
  2. 慎重にマルチ チャンネルでトランスフェクション培地を吸引し、100 μ L の培適切な LRA (表 1) に置き換えます。デタッチ transfected HEK293T 細胞培養プレート面から簡単にデタッチするのには知られているを避けるために井戸の壁と一緒に非常に優しく中を追加します。
  3. 37 ° C で 5% CO2加湿インキュベーターで 48 h 用プレートを孵化させなさい

3 フローサイトメトリー解析のため修正可能な生存染付 Transfected セルの染色

注意:死んだ細胞および残骸の取り外しは、偽陽性を排除し、最高品質の結果を得ることが不可欠です。

  1. 軽くピペッティング上下 (~ 5 回)、マルチ チャンネルとメディアの泡を回避しながら、ウェルあたりリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L を使用してメディアにセルをデタッチします。必要な場合は、トリプシン EDTA 溶液 (0.05% - PBS で 10 mM) の井戸あたり 35 μ L を使用し、血清を含む培地で中和前に 37 ° C で 5 分間の培養皿からセルをデタッチします。
  2. 96 ウェル V 底プレートにセルを転送します。
  3. 4 ° C で 500 × gで 5 分間細胞をスピンし、細胞に触れることがなく媒体/PBS を慎重に吸引します。
  4. セルを洗浄して 200 μ L の血清タンパク質/無料 PBS で少なくとも 1 時間。
  5. 4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心分離し、プレートを傾斜およびセルに触れることがなく洗浄バッファーを削除して上澄みを廃棄します。
  6. タンパク質/血清無料 PBS で生存率染料 1: 1000 希釈することによって修正可能性色素の実用的なソリューションを準備します。50 μ L/ウェル希薄化後染色の準備をします。
    注:性染料は、青、赤、紫のレーザーでの使用に適した色の範囲で利用できます。凍結乾燥の染料 (コンポーネント A) 50 μ L 無水 DMSO (コンポーネント B) の 1 つのバイアルを再修正可能性色素の原液を準備します。単一使用分注 (1 μ L 各)、-20 ° C でストアを光から保護。
  7. 希釈性色素の 50 μ L を各ウェルに追加し、マルチ チャンネルの上下にピペッティングにより細胞をミックスします。
  8. 光から保護、4 ° C で 10-15 分の汚れ。
  9. 洗浄バッファー (1% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA と PBS) の 150 μ L で 1-2 回を洗ってください。
  10. 500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。
  11. 暗闇の中で 4 ° C で 10-15 分の洗浄バッファーの作りたての 1% のホルムアルデヒドの 100 μ L でセルを固定します。
    注意:ホルムアルデヒドは非常に有毒であります。手袋と保護のための安全メガネを着用しながら吸入を避けるために発煙のフード 1% ホルムアルデヒド溶液を準備します。
  12. 洗浄バッファーの 100 μ L に 1-2 回細胞を洗浄します。
  13. 500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。
  14. 洗浄バッファーの 70 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。
    注:プロトコルはここで一時停止することができます。流れの cytometer で次の日分析のため暗闇の中で 4 ° C で固定セルを格納できます。

4. EGFP とした DsRed フローサイトメトリーとデータ解析による測定

注:流れの cytometer で HIV 転写 (EGFP %) と選択的スプライシング (% した DsRed) を分析します。70 μ m の細胞ストレーナーまたはノズル目詰まりを避けるために 100 μ m ナイロン メッシュを実行する前にサンプルをフィルター処理します。

  1. Cytometer とコンピューターが少なくとも起動ウォーム アップ レーザーをように使用する前に 10 分。
  2. サンプルを実行して、データ集録を開始、する前に 0.9% 食塩水で鞘タンクを記入し、廃棄物のタンクに次亜塩素酸ナトリウム タブレットが追加されていることを確認します。
  3. 空気の泡のためのフロー ・ セルを確認します。
  4. 探知器およびフィルターの実験に適していることを確認します。
    注:EGFP、青色レーザーの使用 (488 nm) および 530/30 バンドパス、下流エクスプレスが黄色のレーザーを使用して検出された最適中 (561 nm) および 610/20 バンドパス。青色レーザー (488 nm)、610/20 帯域通過はした DsRed 発現を検出するも使用できます。
  5. キャリブレーション ビーズを実行することによって検出器全体の cytometer 性能と感度を確認します。
  6. 転送を調整 (FSC A) と側 (SSC-A) 散布電圧無染色、主要な人口が画面に表示されるサンプルと明確に識別できます。
    注:FSC (前方散乱光)、光計測 SSC (側散乱の場合光)、セル (セル面積またはサイズ) のボリュームに依存する平らな角度に回折に比例している右の角度で光の回折の測定セルの粒度と内部の複雑さ。
  7. EGFP + した DsRed 検出器と逆に人口の波及を最小限を確保する単染色サンプルを使用して、手動または自動補正を実行します。
    注意:補償目的のためには、それぞれ単独で修正可能性色素で染色細胞と同様、単一の色蛍光タンパク質を発現する細胞のサンプルを使用します。分光特性の異なるため EGFP と下流の蛍光タンパク質補償の FITC と PE の補償ビーズを使用しないでください。補正コントロールは、正と負の人口の解決に十分に明るいする必要があります。
  8. プロットの作成し、蛍光マイナス 1 つ (FMO) コントロールを使用してゲートを設定します。
  9. 取得し、サンプルあたりの 10,000 の生菌イベントの最小を記録します。レーザー迎撃を通過のダブレットを避けるために中または低速でサンプルを実行します。パルス ジオメトリ ゲートなどを使用して、SSC のダブレットを排除するために SSC H 対。安定性を確認 SSC A 対時間をプロットすることによって実行して、どのようにも流れが実行中にします。
  10. 実行の最後に、きれいに濃縮洗浄剤と流れの cytometry 流体工学、5 分のための水します。
  11. シャット ダウン システム、廃棄物を破棄し、再取得後鞘のタンクを埋めます。
  12. 流れ cytometry データ解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。細胞の残骸や塊 (ダブレット) 前方と側面の散布図に基づく除外し、生存率染料染色を使用して死んだ細胞を排除する (負の人口生きているセルを =)。スプライシング製品下流の割合だけでなく、EGFP とした DsRed (図 4) を発現している細胞を識別する/(DsRed + EGFP) (図 5)。
  13. HIV 転写、スプライシング未処理細胞および個人または LRAs (図 5) の組み合わせにさらされる細胞を比較することによって、LRA の効果を決定します。

結果

HIV-1 の式 (EGFP), こさと次のブロモ ドメイン阻害剤 JQ1 による治療 (下流) 製品の代表的な結果は図 5のとおりです。JQ1(+) と Tat 大幅 EGFP を発現する細胞の割合を増加させた (DMSO を 2.18 と 4.13 FC それぞれ; n = 3), 成績証明書を示す。また、Tat と似たようなレベルにスプライシング製品 (DMSO 上 7.37 FC) の割合だけでなく、下流 (DMSO に 46.6 FC) を発現する...

ディスカッション

測定前のヴィヴォ ウイルス再活性化の難しさを考えると、モデルは、潜伏を含む HIV 待ち時間を研究するために時間をかけて開発された生体外で幅広い感染 T 細胞-ライン (J-ラッツ、ACH2、U1)、(の休息の潜在的な感染症の主要なモデルO ' doherty、レヴィン、グリーン、スピナ モデル) または事前活性化 cd 4 + T 細胞 (サフ、マリーニ、Planelles、Siliciano、カーン モデル) 単一のラウンドまたはレプ?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作業は、プロジェクト助成金 APP1129320 とオーストラリアの NHMRC からのプログラム助成金 APP1052979 によって支持されました。この仕事の成功の不可欠な構成要素とアドバイスを提供するため博士アダム ウィートリー、博士マリーナ アレクサンダー、ジェニー l. アンダーソン博士とミシェル Y. リーに感謝します我々 はまた、彼らのアドバイスや本研究で使用される流れの cytometer を維持するために寛大な支援の DMI の流れ施設スタッフを感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)ATCCCRL-3216Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141Origin Australia
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070Serum free medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry reagents
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)LabcoSODHYPO-5LConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7xMPBioIM76670Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterileCorningCLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer capCorning35223512 x 75 mm style, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Micro test tubes, bulkBIO-RAD2239391microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without capCorning35200812x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test TubesCorning352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MicroscopeNikon TMS310528
Centrifuge 5810R refrigeratedEppendorf5811000487with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data AnalysisBMG LabtechMARSFLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7version 7.0c

参考文献

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