Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Zusammenfassung

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Zusammenfassung

HIV bleibt aufgrund der Existenz eines Reservoirs von Zellen, die stabil und latente Form des Virus, birgt für das Immunsystem unsichtbar bleibt und nicht durch die aktuelle antiretrovirale Therapie (cART) unheilbar. Transkription und Spleißen wurden gezeigt, HIV-1 Latenzzeiten in ruhenden CD4 + T-Zellen zu verstärken. Umkehrung der Latenz durch den Einsatz von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) in der "Shock and Kill" Ansatz wurde ausgiebig untersucht, in dem Versuch, dieses Reservoir zu bereinigen, aber keinen Erfolg in klinischen Studien wegen mangelnder Entwicklung von angemessenen kleinen bisher nicht nachgewiesen Moleküle, die effizient dieses Reservoir durcheinanderbringen können. Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zur zuverlässig und effizient Bewertung Latenz Umkehr Agents (Gebietskörperschaften) auf HIV Transkription und Spleißen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung von ein LTR-gesteuerte dual Color-Reporter, der gleichzeitig die Wirkung von einem LRA auf Transkription und Spleißen messen kann durch Durchflusszytometrie. Das hier beschriebene Protokoll ist ausreichend für adhärente Zellen als auch die Zellen in der Suspension. Es eignet sich für eine große Anzahl von Drogen in einem hohen Durchsatz-System testen. Die Methode ist technisch einfach zu implementieren und kostengünstig. Darüber hinaus ist die Verwendung der Durchflusszytometrie ermöglicht die Beurteilung der Zellviabilität und somit Drogen Toxizität zur gleichen Zeit.

Einleitung

Trotz wirksame langfristige antiretrovirale Therapie besteht HIV in einem latenten Zustand als eine integrierte Provirus im Speicher CD4 + T-Zellen-¹. Das Chromatinstruktur des HIV-1-5 "lange terminal Repeat (LTR) Promoter und epigenetische Modifikationen wie Histon-Methylierung und Deacetylation durch DNA-Methyltransferasen (DNMT) und Histon Deacetylases (HDAC) sind wichtige Mechanismen, die transcriptional Repression und damit nach Integration Latenz^2,3. Eine Vielzahl von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) wurde untersucht, auf ihre Wirksamkeit induzieren Virus Produktion in-vitro- und in-vivo von latent infizierten ruhenden CD4 + T Zellen^{4,5,6,7 ,8}. Unter den lokalen und regionalen Gebietskörperschaften getestet, HDACi (HDAC-Inhibitoren) und BET Bromodomain-Hemmer (BETis) induzieren Chromatin Enttauung und Freisetzung von positiven Transkription Dehnung Faktor b (P-TEFb) bzw., was zu nachfolgenden entlasten die transkriptionelle Repression auf die 5' LTR und Aktivierung von HIV Ausdruck^{9,10,11,12,13}. Das Ausmaß der Reaktivierung durch diese Gebietskörperschaften erreicht war jedoch begrenzt, da nur ein mäßiger Anstieg der Zelle-assoziierten unspliced HIV mRNA (uns RNA), bezeichnend für virale Transkription, ex Vivo^14,15beobachtet wurde. Wichtig ist, versäumt diese lokalen und regionalen Gebietskörperschaften auch, eine Verringerung der Häufigkeit von latent infizierten Zellen induzieren.

HIV-Ausdruck kann weiter durch ineffiziente Spleißen¹⁶ sowie Mängel im nuklearen Export mehrfach gespleißte HIV-RNA (MS-RNA)¹⁷beschränkt sein. Daher sind zur Identifizierung neue Klassen von lokalen und regionalen Gebietskörperschaften, die sind stärker und können Einfluss auf verschiedene Aspekte der Virus Produktion Post-Integration erforderlich. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen Assays, die helfen, definieren die optimale Verbindungen effizient Latenz umzukehren erforderlich.

Hier ist ein Protokoll präsentiert, was nutzt einen Hochdurchsatz-Ansatz für funktionale Bewertung der Auswirkungen von Interventionen auf die HIV-LTR-driven Transkription und Spleißen. Kurz gesagt, eine neue LTR-gesteuerte Dual color Reporter System pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Abbildung 1) wird zur Durchflusszytometrie HIV Reaktivierung zu beurteilen. In dieser fluoreszierende Reporter führt die Expression des unspliced mRNA HIV (4 kb), verbesserte grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Ausdruck, während der Begriff der gespleißten mRNA (2 kb) Discosoma SP. rote (DsRed) fluoreszierendes Protein-Expression führen würde. Kurz gesagt, haben wir eine fluoreszierende Env-EGFP Schmelzverfahren Protein, gp140unc verwendet. EGFP, wo die kodierende Sequenz des EGFP in Frame mit einer UN-gespalten und verkürzten Form des Umschlags (Env) platziert wurde. Änderungen wurden eingeführt, um die Spaltstelle verhindern die Dissoziation der Env in gp120 und gp41-EGFP abtragen und zum Abschneiden der gp160-Protein vor der transmembrane Domäne erstellen eine lösliche Env analog, das erleichtert die korrekte Faltung und Ausdruck von EGFP. Auf den Ausdruck innerhalb einer Zelle, Rev lokalisiert in den Zellkern, wo es den nuklearen zytoplasmatischen Export von 4 kb Env vermittelt, mRNA über die Interaktion mit der Rev-responsive Element (RRE). Abschneiden der Env beeinträchtigt nicht die RRE liegt zwischen gp120 und gp41 und der A7 3' Splice Site. In diesem System Spleißen bei HIV-1 splice Geber 4 (SD4) und Spleiß-Akzeptor 7 (SA7) Ergebnisse bei der Herstellung von 2 kb mRNA Kodierung ein nichtfunktionaler Rev-Protein bei Aminosäure 38 abgeschnitten mit DsRed fluoreszierendes Protein, RevΔ38-DsRed verschmolzen. Kurz gesagt, war das Exon 2^Nd von Rev an Aminosäure 38 durch Überlappung Erweiterung¹⁸DsRed eingefügt. Um den nuklearen Export von unspliced mRNA zu erleichtern, wurde ein Säugetier Expressionsvektor Codierung Rev (pCMV-Rev^NL4.3) gemeinsam mit dem fluoreszierenden Reporter Konstrukt (Abbildung 2) transfiziert. Dieses einzigartige Reporter Konstrukt hier beschriebenen eignet sich im Hochdurchsatz-Bewertung der HIV-Übertragung und Spleißen, ohne die Notwendigkeit, virale Vektoren verwenden.

Protokoll

Hinweis: Verfahren zum Klonen, Transformation und Sequenzierung sind an anderer Stelle erläutert^18,19. Die Protokolle hier beginnt die Transfektion von Säugetieren Expressionsvektoren (Abbildung 3).

1. die Transfektion von HEK293T Zellen mit Dual Color Reporter zu konstruieren

1. Pflegen Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C. Nach dem Auftauen Durchgang HEK293T Zellen 2-3 Mal vor der Verwendung in Transfektion experimentiert. Dies würde die Zellen Zeit wieder aus dem tauenden Verfahren geben.
   Vorsicht: Mykoplasmen Kontamination von Zellkulturen bleibt ein ernstes Problem. Gute Laborpraxis und Routineuntersuchung von Zellkulturen sind wesentlich verringern das Risiko einer Kontamination der Mykoplasmen und Verbreitung²⁰vermeiden.
2. Teilen Sie die Zellen, 1:2 einen Tag vor der Aussaat und in frische DMEM Medium überführen. Pflegen Sie die Zellen für 24 h in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
3. Am Vortag Transfektion, entfernen Sie das Medium aus der Flasche durch Absaugen und waschen Sie die Zellen mit Dulbeccos Phosphat gepuffert (DPBS) Kochsalzlösung frei von Kalzium (Ca^{2 +}) und Magnesium (Mg^{2 +}) um Spuren von Serum zu entfernen.
4. 5 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % - 10 mM mit PBS-Puffer) in das Kulturgefäß und legen Sie sie bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator für 2 bis 5 min.
5. Wenn die Zellen getrennt sind, fügen Sie 5 mL DMEM mit 10 % (V/V) FBS ergänzt, weiter die Trypsin-Aktivität zu hemmen, die Zellen schädigen können.
6. Aufschwemmen Sie sanft durch Pipettieren der Zellsuspension rauf und runter, bis die Klumpen zu brechen.
7. Verdünnen Sie die Zellen 01:10 in Trypan blau Fleck (0,4 %).
8. Zählen Sie die lebenden Zellen, die keinen Trypan blau mit einem Mikroskop (10 X-Objektiv) und eine Zählkammern belegen.
9. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter zu, indem man den Durchschnitt der die Zellzahl und mit 10.000 multipliziert und durch den Verdünnungsfaktor (01:10) aus der Trypan blau zu färben.
10. Platte 2 x 10⁴ Zellen in 100 μL DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS ohne Antibiotika in einer 96-Well-Wohnung-Bodenplatte für 24 h.
11. Für jedes gut verdünnen 400 ng von pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng pCMV-Rev^NL4.3 und 100 ng pCMV-Tat101^AD8-Flagge DNA in 50 μL Serum freie Medium. Mischen Sie vorsichtig. Verwenden Sie für Experimente ohne Tat eine abgestimmte leer Tat-Vektor-pcDNA3.1 (-).
    Hinweis: Die Verwendung von Endotoxin-freie DNA wird dringend empfohlen. Dafür bereiten Sie Endotoxin-freie DNA mit Hilfe einer Nukleinsäure Reinigung Kit MIDI- oder Maxiprep. Bestimmen Sie die DNA Reinheit durch die Messung der 260/280 AD-Verhältnis, das zwischen 1,7 und 1,9 sein sollte.
12. Mischen Sie der Lipid-Reagenz gemischt, dann verdünnen Sie 0,65 μL in 50 μL Serum freie Medium. Vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
13. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Lipid-Reagenz.
14. Vorsichtig mischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung erscheinen trüb.
    Hinweis: Fahren Sie mit Schritt 1.15. innerhalb von 30 Minuten.
15. 100 μL pro Well der Lipid-Reagenz-DNA-komplexe tropfenweise auf die Zellen zu verzichten.
16. Mischen Sie leicht von der Platte hin und her schaukeln.
17. Inkubieren Sie die Platte für 5 h in einem 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator bei 37 ° c
    1. Jede Reaktion Mischung reicht für einen einzigen Brunnen (96-Well) Transfection. Passen Sie die Höhe und Volumen der Komponenten entsprechend der Anzahl der Droge und Kombination, die getestet werden würde und Konten für Pipettier Variationen. Alle Bedingungen werden in der Regel in Triplicates getestet.
    2. Transfizieren weitere Brunnen mit 100 ng von CMV-driven EGFP und DsRed-Express DNA Plasmid zwecks Entschädigung.

2. Behandlung von transfizierten HEK293T Zellen mit Latenz Umkehrung Agenten

Hinweis: Bestimmen Sie vor jedem Test den physiologischen Zustand der jede LRA durch Messung der Lebensfähigkeit der Zellen nach der Exposition auf hohe und niedrige Dosis des Medikaments mit Cell Proliferation Assay.

1. Jede LRA auf die entsprechenden Arbeiten Konzentration mit Wachstumsmedium verdünnen (z. B., 1 μM für JQ1(+)).
   Vorsicht: Bereiten Sie die lyophilisierten Medikamente mit dem entsprechenden Lösungsmittel zu einer Konzentration von 10 mM. Aufbewahren Sie alle Lager Gebietskörperschaften bei-80 ° C in einer einmaligen Gebrauch aliquoten (5 μl), um wiederholte Einfrieren Auftauen Zyklen zu vermeiden.
2. Vorsichtig aspirieren Sie Transfektion Medium mit einem Mehrkanal- und ersetzen Sie mit 100 μl Medium mit entsprechenden LRA (Tabelle 1). Fügen Sie Medium sehr sanft entlang der Mauer des Brunnens zu vermeiden, trennen die transfizierten HEK293T Zellen, die bekannt sind, leicht zu trennen von der Kultur Plattenoberfläche.
3. Inkubieren Sie die Platte für 48 h in einem 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator bei 37 ° c

3. Färbung von transfizierten Zellen mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff für Flow Cytometry Analysis

Vorsicht: Entfernen abgestorbene Zellen und Schutt ist erforderlich, um Fehlalarme zu beseitigen und Ergebnisse von höchster Qualität zu erhalten.

1. Lösen Sie die Zellen in den Medien mit 100 μL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch und sanft Pipettieren wechselvollen (~ 5 Mal) mit einer Mehrkanal Aufschäumen der Medien zu vermeiden. Falls erforderlich, lösen Sie die Zellen von der Platte mit 35 µL pro Bohrloch Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % - 10 mM mit PBS-Puffer) und Inkubation 5 min bei 37 ° C, vor Neutralisierung mit Serum-haltigem Medium.
2. Übertragen Sie die Zellen auf eine 96-Well-V-Boden-Platte.
3. Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 500 X g bei 4 ° C, dann aspirieren Sie vorsichtig Medium/PBS ohne die Zellen zu berühren.
4. Waschen Sie die Zellen mindestens 1 Mal mit 200 μl Protein/Serum frei PBS.
5. 500 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, dann verwerfen des Überstands durch Kippen der Plattenrandes und der Waschpuffer ohne die Zellen zu entfernen.
6. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung des Farbstoffes fixierbar Lebensfähigkeit durch die Lebensfähigkeit Farbstoff 1: 1000 in Protein/Serum frei PBS verdünnen. Bereiten Sie 50 µL des verdünnten Flecks pro Bohrloch.
   Hinweis: Lebensfähigkeit Farbstoffe sind in einer Palette von Farben geeignet für den Einsatz mit blauen, roten und violetten Lasern zur Verfügung. Bereiten Sie eine Stammlösung fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff durch resuspending ein Fläschchen des lyophilisierten Farbstoffs (Komponente A) mit 50 μL wasserfreiem DMSO (Komponente B). Shop bei-20 ° C in einen einzigen Verwendungszweck aliquoten (1 μl), vor Licht geschützt.
7. 50 μL der verdünnten Lebensfähigkeit Farbstoff in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen von oben und unten mit einer Mehrkanal pipettieren.
8. Fleck für 10-15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt.
9. 1-bis 2-Mal mit 150 μl Waschpuffer (PBS mit 1 % bovine Serum Albumin und 2 mM EDTA) waschen.
10. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
11. Befestigen Sie die Zellen mit 100 μL der frisch zubereiteten 1 % Formaldehyd in Waschpuffer für 10-15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
    Vorsicht: Formaldehyd ist sehr giftig. Bereiten Sie 1 % Formaldehyd-Lösung in einer Dampfhaube, Einatmen beim Tragen von Handschuhen und Schutzbrille zum Schutz zu vermeiden.
12. Waschen Sie die Zellen 1-2 Mal mit 100 μl Waschpuffer.
13. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
14. Die Zelle Pellet in 70 μl Waschpuffer aufzuwirbeln.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Fixe Zellen könnten bei 4 ° C im Dunkeln für die Analyse am nächsten Tag auf das Durchflusszytometer gespeichert werden.

4. EGFP und DsRed Messungen durch Durchflusszytometrie und Datenanalyse

Hinweis: HIV-Übertragung (% EGFP) und Spleißen (% DsRed) auf einem Durchflusszytometer analysieren. Filtern Sie die Probe vor dem Lauf mit einem 70 μm Zelle-Sieb oder 100 μm-Nylon-Mesh zu vermeiden, die Düse verstopfen.

1. Starten Sie die Cytometer und Computer mindestens 10 min vor mithilfe von Lasern aufwärmen zu gewährleisten.
2. Füllen Sie vor Beispiele ausführen und Beginn der Datenerfassung den Mantel Tank mit 0,9 % Kochsalzlösung und sicherstellen Sie, dass der Fäkalientank Natriumhypochlorit Tablet hinzugefügt wird.
3. Überprüfen Sie die Messzelle für Luftblasen.
4. Stellen Sie sicher, dass die Melder und Filter für das Experiment geeignet sind.
   Hinweis: Für EGFP, Nutzung der blauen Laser (488 nm) und 530/30 Bandpass, während DsRed Express optimal erkannt wird mit dem gelben Laser (561 nm) und 610/20 Bandpass. Ein blauer Laser (488 nm) und 610/20 Bandpass kann auch verwendet werden, um DsRed Ausdruck zu erkennen.
5. Überprüfen Sie die Cytometer Leistung und Empfindlichkeit über Detektoren durch Kalibrierung Perlen ausführen.
6. Passen Sie den vorwärts (FSC-A) und Side Scatter (SSC-A) Spannungen mit ungefärbten Probe, so dass die Bevölkerung auf dem Bildschirm ist und klar erkennbar.
   Hinweis: FSC (Forward verteilt Licht) ist eine Messung des Lichts Beugung in einem flachen Winkel, die abhängig von dem Volumen der Zelle (Zelle Oberfläche oder Größe), beim SSC (Seite-Streulicht) ist eine Messung der Lichtbeugung im rechten Winkel, die proportional zur Zelle Granularität und interne Komplexität.
7. Führen Sie manuelle oder automatische Kompensation mithilfe der Einzel-gefärbten Proben gewährleistet minimale Spillover EGFP + Bevölkerung in die DsRed Detektor und umgekehrt aus.
   Vorsicht: Verwenden Sie für Entschädigung Zwecke eine Probe von Zellen ausdrückt jede einzelne Farbe fluoreszierendes Protein und die Zellen einzeln mit dem fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt. Verwenden Sie FITC und PE Entschädigung Perlen nicht für EGFP und DsRed fluoreszierende Proteine Entschädigungen aufgrund der unterschiedlichen spektralen Eigenschaften. Vergütung Kontrollen sollte hell genug, um positive und negative Bevölkerung zu lösen.
8. Erstellen Sie Grundstücke und legen Sie die Tore mit Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrollen.
9. Erwerben Sie und notieren Sie ein Minimum von 10.000 lebensfähigen Zelle Ereignisse pro Probe. Ausführen von Beispielen mit mittlerer oder niedriger Geschwindigkeit, Dubletten, die durch den Laser abfangen zu vermeiden. Verwenden Sie Puls Geometrie gating wie SSC-A vs. SSC-H, Dubletten zu beseitigen. Überprüfen Sie die Stabilität des Laufs durch Plotten Zeit gegen SSC-A um zu sehen, wie auch die Strömung ist während des Laufs.
10. Am Ende des Laufs Flow Cytometry Fluidik mit konzentrierten Reinigungsmitteln zu reinigen, dann Wasser für 5 Minuten.
11. Herunterfahren des Systems die Abfälle entsorgen und neu auftanken Scheide nach Erwerb.
12. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe einer Flow Cytometry Datenanalyse-Software. Zellenrückstand und Klumpen (Dubletten) basierend auf vorwärts- und seitliche Streuung ausschließen, dann beseitigen abgestorbene Zellen mit der Lebensfähigkeit Farbstoff Fleck (negative Bevölkerung = lebende Zellen). Identifizieren Sie die Zellen mit dem Ausdruck EGFP und DsRed (Abbildung 4), sowie der Prozentsatz der gespleißten Produkt DsRed /(DsRed + EGFP) (Abbildung 5).
13. Bestimmen Sie die Wirkung der LRA auf HIV Transkription und Spleißen durch Vergleich von unbehandelten Zellen und den Zellen, einzelnen oder einer Kombination aus lokalen und regionalen Gebietskörperschaften (Abbildung 5).

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5 gezeigt, die Expression von HIV-1 unspliced (EGFP) und gespleißt (DsRed) Produkte, die nach der Behandlung mit Bromodomain-Hemmer JQ1. JQ1(+) und Tat deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck EGFP (2,18 und 4.13 FC über DMSO bzw.; n = 3) bezeichnend für unspliced Transkripte. Darüber hinaus JQ1(+) deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck DsRed (46,6 FC über DMSO) sowie der Anteil der...

Diskussion

Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Virus-Reaktivierung ex Vivo, infiziert eine Vielzahl von in-vitro-Modelle im Laufe der Zeit entwickelt wurden, um HIV-Latenz einschließlich latent studieren T-Zell-Linien (J-Lats, ACH2, U1), primäre Modelle der latenten Infektion ruhen ( O' Doherty, Lewin, Greene und Spina-Modelle) oder pre-activated CD4 + T-Zellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn Modelle) mit einzelnen Runde oder Replikation zuständigen Reporter Viren²². Um die physio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)	ATCC	CRL-3216	Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum	Gibco	10099-141	Origin Australia
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%	Gibco	15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium	Gibco	31985-070	Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
pEGFP-N1 plasmid	Clontech (TaKaRa)	6085-1	Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa	BD Biosciences		Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II	BD Biosciences		Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34976	Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
EDTA 0.5M pH8	Gibco	15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)	BD Biosciences	559123	3.0 - 3.4 mm
Sheath solution	Chem-Supply	SA046	90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)	Labco	SODHYPO-5L	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x	MPBio	IM76670	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)	Corning	430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)	Costar	3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)	Costar	3896
Centrifuge tubes (10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile	Corning	CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile	Corning	CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile	Corning	CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile	Corning	CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap	Corning	352235	12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh	SEFAR	03-100/32	100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk	BIO-RAD	2239391	microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap	Corning	352008	12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes	Corning	352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)	Grale Scientific	HCS2026	20 x 26 mm
Microscope	Nikon TMS	310528
Centrifuge 5810R refrigerated	Eppendorf	5811000487	with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader	BMG Labtech	N/A	Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis	BMG Labtech	MARS	FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel:mac 2011	version 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	version 7.0c