لوح منافسة مقايسة كتقييم أولى سريع لقمع المرض

Summary

قدم هو بروتوكول مقايسة منافسة لوحة تحديد ما إذا كان سماد محددة من المحتمل أن تحتوي على البكتيريا والفطريات التي تقمع نمو سولاني مرضى.

Abstract

والهدف هو تطوير وتحسين بسيط، بأسعار معقولة وفعالة الاختبار الأحيائي للكشف عن المرض القدرة القمعية السماد محددة ضد الفطريات soilborne سولاني مرضى. سولاني ر رض طائفة واسعة من مضيفي النباتات في جميع أنحاء العالم. تعيش في التربة سابروفيتي الفطر وينمو بسرعة في المياه بسيطة أجار وسائط الإعلام. فحص لوحة طريقة سريعة لمقارنة كومبوستس لقدرتها على إبطاء نمو سولاني ر.. كما يرتبط المقايسة جيدا مع قمع لمسببات الأمراض الفطرية الأخرى soilborne البقاء على قيد الحياة سابروفيتيس في التربة مثل الآفات المبكرة م وذبول الفوزاريوم وتعفن جذور لفحة وتعفن جذور بيثيوم.

Introduction

مرضى يمثل مجموعة معقدة واسعة من الفطريات، من دونك كوكوميريس ثاناتيفوروس (فرانك) الذي (anamorph = Kühn سولاني مرضى ) هو الممرض تسبب تعفن جذور والتثبيط قبالة¹. سولاني مرضى هو ممرض عدوانية وسابروفيتي التي يمكن البقاء على قيد الحياة ك sclerotia تحت الظروف البيئية السلبية¹. نتيجة لذلك فإنه توزيع عالمي ويمكن أن يسبب المرض على طائفة واسعة من مضيفي النباتات بما في ذلك الباذنجانية وقرنيات و Asteraceae والفصيلة الكرنبيه أسفر عن خسائر اقتصادية جسيمة.

السماد لديه القدرة على إيواء لذالك وكلاء لبعض مسببات الأمراض النباتية². لكن ليس كل كومبوستس على حد سواء كما أنها تؤثر على جميع مسببات الأمراض وكذلك³. وقد الكربون الخشبية اللجنين أعلى نسب السليلوز من التبن أو القش من الكربون على أساس كومبوستس. سولاني ر. يفضل الكربون متاحة بسهولة في القش. وفي المقابل، فطريات المكافحة البيولوجية، مثل الترايكوديرما spp.، تكون أكثر فعالية عندما الكربون أقل متاحة بسهولة. الفطريات المفيدة والبكتيريا في السماد يمكن منع الأمراض النباتية من خلال المنافسة أو الخصومة أو تنظيم نمو النبات³. يكشف التحليل المقترح أساسا العداء التي تم إنشاؤها بواسطة إنتاج المضادات الحيوية، أو اكوينزيميس، أو تشيلاتورس التي تضر بمسببات المرض.

مصنع المقايسة معيار الذهبي لتحديد ما إذا كان كومبوستس صالح أو ردع نمو النبات⁴. بيد أن المقايسة النباتية مضيعة للوقت (أسابيع إلى أشهر) لإكمال التي قد تكون أطول من المطلوب، ويتطلب العمل أكثر لاستخراج النباتات ذات الجذور لقياس شدة نظم جذور. قوية نسبيا، ولكن أسرع فحوصات (الأيام) سيكون أمرا مثاليا لبرامج مراقبة الجودة. والهدف من هذه الورقة لإثبات اختبار نسبيا سريعة ودقيقة للتنبؤ بإمكانات القمعية من السماد العضوي. وكان نمط الأسلوب بعد الفانو et al. كانت تضعف ⁵ مع استثناءين، مقتطفات السماد واستخدمت أجار المياه بدلاً من البطاطا الدكستروز أجار (PDA). سولاني ر ينمو بسرعة في المياه بسيطة أجار وسائل الإعلام حين المساعد الشخصي الرقمي تشجع نمو البكتيريا والفطريات الأخرى الملوثة الثقافة⁶.

هذا التحليل لوحة يخدم كمؤشر لقمع التي تنطبق على مجموعة من مسببات الأمراض النباتية التي تعيش في التربة سابروفيتيس بما في ذلك سولاني ر⁷م الآفات المبكرة والذبول مغزلاويه، تعفن جذور لفحة، وتعفن جذور بيثيوم. تحليل المنافسة لوحة مفيد على الشاشة مجموعة من منتجات السماد العضوي لتحتوي على المجتمعات المحلية للميكروبات التي تكون بمثابة عوامل المكافحة البيولوجية للتربة المسببة للأمراض. وكان المقايسة أحد المؤشرات الأكثر اتساقا لقمع المرض في^6،منتجات السماد التجاري⁸. تم اختيار المنتجات على التغيير في وصفه، والنضج، وعملية الإنتاج.

Protocol

1. إعداد مقدما

1. الثقافة الفطرية الرئيسية (اختبار الكائن الحي)
   1. طلب من "جمع نوع الثقافة الأمريكية"، "جمع علم الأحياء الدقيقة"⁹، تيليومورف كوكوميريس ثاناتيفوروس (فرانك) (ATCC 10154) أو 4031 ميا.
   2. وبدلاً من ذلك: جمع يعزل المحلية كما فعل صاحبا. شتلة فجل الأحمر (الزعفران فجل) يعمل أيضا كمحطة لطعم؛ جمع التربة من مكان يعرف أن لها تاريخاً تعفن التخميد حالاً أو الجذر الناجم عن سولاني ر. بذر البذور في التربة وعزل من آفات الجذر عند شتلة من 3 إلى 4 أسابيع من العمر.
      1. إزالة الشتلات من التربة والشطف بماء الصنبور. ابحث عن البنى الأنسجة في منطقة هيبوكوتيل بين الأوراق والجذر (الشكل 1).
      2. استخدام شفرة حلاقة المدببة واحدة لقطع شرائح 1 سم هيبوكوتيل أو الجذر باللون بني. استخدام الملقط تعقيم الشعلة إلى تراجع في الجزء المتعلق بحل 10% للتبييض المنزلية ل 1 دقيقة، يليه 10 ق شطف في الماء المعقم.
         ملاحظة: أعلى وأسفل صحن بتري معقمة حاويات مفيدة لهذه الخطوة.
      3. قطع استخدام لهب تعقيم الملقط لنقل المصنع إلى داخل منشفة ورقية بات الجافة ومن ثم ضع على سطح طبق بيتري مع المياه أجار (15 غم في 1 لتر).
      4. ضع طبق بيتري داخل وعاء من بلاستيك بغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية). مسح داخل الحاوية مع الإيثانول التبييض أو 75% 10% وأتركها في الهواء الجاف قبل إدراج الطبق.
      5. يبقى يعزل في التخزين طويل الأجل على وسائط الحد أدنى من أجار وجبة الذرة الميول (ز 17 في 1 لتر) (في 5 درجة مئوية).

رقم 1: أعراض المرض. التربة المحتوية على سولاني ر النتائج في الإنبات غير مكتمل وإنشاء (إلى اليسار). تحدث الأعراض على شتلة الفجل آفات البنى في هيبوكوتيل (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. استخدام البطاطا الدكستروز أجار لوحات (39 ز في 1 لتر) للعدوى لهذا الفحص اللوحة.
   1. إرساء ثقافة ابنه الثقافة مرضى في البطاطا الدكستروز أجار واحد أو يومين قبل الفحص، ضمان ذلك هي راسخة في لوحة الثقافة قبل المقايسة. بدء ثقافة ابنه بنقل قطعة صغيرة (10 مم) R. سولاني من الثقافة الرئيسية إلى مركز لوحة جديدة من البطاطا الدكستروز أجار (الشكل 2).
      ملاحظة: يعمل في غطاء الاندفاق الصفحي أو مسح أسفل منضدة مختبر مع 10% إيثانول التبييض أو 75% للتقليل من خطر التلوث.
3. اﻷوتوكﻻف 25 مل أنابيب الاختبار مع مختبرين 10 مل من الماء المقطر (2 x عدد العينات).

2-إعداد العينات للاختبار

1. إضافة عينتين مستقلة ز 0.5 لكل عينة اختبار السماد إلى 10 مل يعقم المياه في أنابيب الاختبار 25 مل. هزة في أنابيب الاختبار بين عشية وضحاها.
   1. قم بتسمية أنابيب الاختبار مع أرقام عينة فريدة من نوعها، وكل عضو من الزوج (مرجع) أو ب (عينة).
2. بعد 24 ساعة، إضافة 1.5 غرام أجار عادي إلى 90 مل ماء المقطر في قوارير ملكونيكال 125 اثنين.
3. اﻷوتوكﻻف كلا قوارير المخروطية مع أجار، ونموذج أ لكل زوج لمدة 20 دقيقة مع إعداد عادم بطيئة.
4. بعد اﻷوتوكﻻف، وضع قوارير المخروطية مع أجار في حمام مائي 45 درجة مئوية حتى تصل إلى التوازن (حوالي 30 دقيقة). لا تضع أي عجائن العينة في حمام المياه حتى أنها قد بردت إلى 45 درجة مئوية.

رقم 2: رسم توضيحي للبروتوكول. المقابس سولاني R. توضع على أطباق بتري تحتوي على استخراج المياه السماد. يتم قياس قطر النمو mycelial بعد 1-2 أيام مع المعونة من المجهر ستيريو لتحسين القرار والتباين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5. صب ملاط السماد (يعقم مرجع) عينة أ في أجار المنصهر من قارورة أجار A. دوامة لتفريق السماد إلى أجار.
6. صب ملاط السماد (العينة الحية) عينة ب في أجار المنصهر من قارورة أجار ب. دوامة لتفريق السماد إلى أجار.
7. صب الخليط من كل قارورة في خمسة صحون بتري البلاستيك التي 100 ملم في القطر.
8. اسمحوا بين عشية وضحاها لوحات باردة حتى يصلب أجار.

3-إضافة مرضى والتحدي

1. باستخدام تقنية معقمة، نقل قطع متساوية في الحجم من سولاني ر لكل زوج من عينة أجار لوحات (3 إلى 5 مم كوركبورير يعمل جيدا لإنشاء أجزاء متساوية الحجم). تأخذ قطعة من المستعمرة من الهامش خارج مستعمرة لضمان نشاط ينمو الميسليوم.
   ملاحظة: يعمل في غطاء الاندفاق الصفحي أو مسح أسفل منضدة مختبر مع الإيثانول التبييض أو 70% 10%.
2. احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة 1-2 أيام حتى نمو مستعمرة يبلغ حوالي نصف الطريق إلى الحافة اللوحات ألف.

4-قياس سولاني ر النمو

1. قياس نصف قطر الميسليوم في كل لوحة إلى 1 ملم أقرب مع مسطرة واضحة مسطحة باستخدام مجهر ستيريو مع الإضاءة المنقولة.
   ملاحظة: الحقل منحرف أو داكنة الإضاءة سوف يسهل رؤية وقياس خيوط فطرية شفافة. عند هذه النقطة، مناطق لتثبيط ستكون مرئية حول أجزاء السماد في لوحة ب إذا كان السماد القمعية.
2. تسجيل في دائرة نصف قطرها في ثلاثة أماكن للوحة الواحدة وحساب متوسط الثلاث بمثابة تدبير تمثيلية.
3. قم بطرح متوسط لوحات ب من لوحات A. إذا ب < هناك ثم الميكروبات في لوحات ب التي القمعية الممرض سولاني ر .
4. القسمة في دائرة نصف قطرها متوسط عدد أيام تحدي للتعبير عن وحدات لقمع النسبي كمعدل، الميسليوم ملم في اليوم الواحد.

النتائج

وينبغي الانتهاء من السماد مستقرة وناضجة، هما المصطلحات التي كثيرا ما تستخدم بالتبادل، حيث يمكن تعبئتها ونقلها بشكل أمن، ولا تسبب آثار ضارة أثناء الاستخدام النهائي في⁴. الاستقرار هو مقاومة للتحلل، وعادة ما تحدد باستخدام الأرقام القياسية للنشاط الميكرو...

Discussion

ونعلم من البحوث السابقة، أن بعض كومبوستس فعالة في قمع سولاني ر. وآثار القمعية بسبب الميكروبات الحية في السماد العضوي، لا الخصائص الأحيائية واللااحيائيه السماد^6،8. وقد انتقد استخدام التعقيم كوسيلة 'قتل' الحجمية لأنه يؤثر على كيمياء الكربون وسائل الإعلا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclavable narrow-neck glass conical flask	Fisher Scientific	10-040D	125-mL
autoclavable glass testtubes	Fisher Scientific	14-925J	25-mL
dehydrated granulated agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0	500 g quantity
heat resistant gloves	Fisher Scientific	MEMGG1314WL	several brands available
Parafilm (strips of 2-3 cm wide)	Fisher Scientific	PM992 13-374-16	5 or 10 cm widths work
disposable polystyrene petri dishes	Fisher Scientific	R80116	comes in sleeves of 20/ea or cases of 500
dehydrated potato dextrose agar	Fisher Scientific	DF0013-15-8	comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams
benchtop reciprocal shaker	Thomas Scientific	1227Y31	other models will work
water bath	ThermoScientific	S37363	5L general purpose
clear ruler, flat, at least 10 cm	Any		use metric rule
ATCC culture	American Type Culture Collection	ATCC 10154	teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;
lab tape	Fisher Scientific	15935	autoclavable and removable, 1" wide preferred
water resistant marker	office or scientific supply	Sharpie fine tip	write sample number on tape