Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

Resumo

Apresentado é um protocolo para um ensaio de competição de placa identificar se um adubo específico é susceptível de conter bactérias e fungos que inibem o crescimento de Rhizoctonia solani.

Resumo

O objetivo era desenvolver e otimizar um bioensaio de simples, acessível e eficaz para detectar a capacidade supressora de doença de um composto específico contra soilborne fungo Rhizoctonia solani. R. solani é um patógeno de uma vasta gama de hospedeiros de planta em todo o mundo. O fungo sobrevive no solo como uma Saprófita e cresce rapidamente em meios de ágar água simples. O ensaio de placa é um método rápido para comparar compostos por sua capacidade de retardar o crescimento de r. solani. O ensaio também se correlaciona bem com a supressão de outros patógenos fúngicos soilborne que sobrevivem como saprófitas em solos como início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz.

Introdução

Rhizoctonia representa um amplo complexo de fungos, dos qual Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorfo = Rhizoctonia solani Kühn) é o agente patogênico causando podridão de raiz e umedecimento-fora¹. Rhizoctonia solani é um patógeno agressivo e uma Saprófita que pode sobreviver como esclerócios sob condições ambientais adversas¹. Como resultado, tem uma distribuição global e podem causar doenças em ampla gama de hospedeiros de planta incluindo Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae, resultando em sérios prejuízos econômicos.

O adubo tem a capacidade de abrigar agentes de biocontrole para determinados agentes patogénicos de planta². No entanto, nem todos os compostos são iguais, nem eles afetam todos os agentes patogénicos da mesma forma³. Carbono à base de madeira tem lignina mais elevada rácios de celulose de compostos à base de feno ou palha-carbono. R. solani prefere carbono prontamente disponível encontrado em palha. Em contraste, o controle biológico de fungos, como Trichoderma spp., são mais eficazes quando o carbono é menos prontamente disponível. Benéficos fungos e bactérias em adubo podem suprimir a doença de planta através de competição, antagonismo ou regulador de crescimento de planta³. O ensaio proposto primeiramente detecta antagonismo criado pela produção de antibióticos, ecoenzymes ou quelantes que são prejudiciais ao patógeno.

Bioensaios de planta são um padrão-ouro para determinar se o terriço favorece ou impedir o crescimento de planta⁴. No entanto, a planta bioensaios são demoradas (semanas a meses) para concluir que pode ser mais do que o desejado e exige mais trabalho para extrair plantas com raízes para quantificar a severidade de sistemas da raiz. Comparativamente robusto, mas, mais rápido os ensaios (dias) seria ideais para programas de controle de qualidade. O objetivo deste trabalho é demonstrar um teste relativamente rápido e exato para prever potencial supressivo de adubo. O método foi padronizado após Alfano et al ⁵ com duas exceções, adubo extratos foram diluídos e ágar água foi usada no lugar de ágar de batata dextrose (PDA). R. solani cresce rapidamente em meios de ágar simples água Considerando que PDA promoveu o crescimento de bactérias e outros fungos que contaminou a cultura⁶.

Este ensaio de placa serve como um indicador de supressão que se aplica a uma gama de patógenos vegetais que sobrevivem no solo como saprófitas, incluindo r. solani⁷início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz. O ensaio de competição de placa é útil para a tela uma gama de produtos de adubo para que contém comunidades de micróbios que servem como agentes de controle biológico de patógenos de solo. O ensaio foi um dos indicadores mais consistentes de supressão da doença em adubo comercial produtos^6,8. Produtos foram escolhidos para sua variação na receita, maturidade e processo de produção.

Protocolo

1. preparar com antecedência

1. Cultura de fungosa mestre (organismo de teste)
   1. Encomendar o American Type Culture Collection, coleção de microbiologia⁹, pelo seu teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031.
   2. Como alternativa: Colete locais isolados como feito pelos autores. Mudas de vermelho rabanete (Raphanus sativus) funcionam bem como uma planta de isca; colete o solo de um local conhecido por ter um histórico de umedecimento-fora ou raiz podridão causada por r. solani. Plantar sementes no solo e isolar-se de lesões de raiz quando mudas são 3 a 4 semanas de idade.
      1. Retire as mudas do solo e enxágue com água da torneira. Olhe para o tecido marrom na região hypocotyl entre as folhas e a raiz (Figura 1).
      2. Use uma única lâmina afiada para cortar segmentos de 1 cm do hypocotyl ou raiz que têm uma cor marrom. Use chama-esterilizados fórceps para mergulhar os segmentos em solução de 10% de alvejante doméstico por 1 min, seguido de um enxágue s 10 em água estéril.
         Nota: A parte superior e inferior de uma placa de Petri estéril são recipientes úteis para esta etapa.
      3. Uso chama-esterilizados fórceps para transferir a planta pedaços para dentro de uma toalha de papel para pat seco e em seguida coloque sobre a superfície de uma placa de Petri com ágar água (15 g em 1 L).
      4. Coloque o prato de Petri dentro de um recipiente plástico com tampa e incubar à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C). Limpe o interior do recipiente com 10% de lixívia ou 75% de etanol e deixe secar antes de colocar o prato.
      5. Manter os isolados em armazenamento a longo prazo em uma mídia mínima do ágar farinha de milho inclinações (17 g em 1 L) (a 5 ° C).

Figura 1: sintomas da doença. Solo, contendo o r. solani resulta em germinação irregular e estabelecimento (à esquerda). Os sintomas em mudas de rabanete ocorrerem como lesões marrons do hypocotyl (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Use placas de ágar batata dextrose (39 g em 1 L) de inóculo para este ensaio de placa.
   1. Estabelecer uma cultura de filha de Rhizoctonia cultura em ágar dextrose batata, um ou dois dias antes do ensaio garantir está bem estabelecido na placa de cultura, antes do ensaio. Começa a cultura filha transferindo um pequeno pedaço (10 mm de diâmetro) de r. solani de cultura mestre para o centro de um prato fresco de ágar de batata dextrose (Figura 2).
      Nota: Trabalhar em uma capa de fluxo laminar ou limpar uma bancada de laboratório com 10% de lixívia ou 75% etanol para minimizar o risco de contaminação.
3. Autoclave tubos de ensaio de 25 mL com alíquotas de 10 mL de água destilada (2 x número de amostras).

2. preparação de amostras para teste

1. Adicione duas amostras independentes de 0,5 g de cada amostra de adubo para 10 mL de água esterilizada em tubos de ensaio de 25 mL. Agite os tubos de ensaio durante a noite.
   1. Etiquete os tubos de ensaio com números da amostra original e cada membro do par como uma (referência) ou B (amostra).
2. Após 24 h, adicione 1,5 g de ágar-ágar simples para 90 mL de água destilada em frascos de dois 125 mLconical.
3. Autoclave ambos os Matrases com agar e a uma amostra de cada par por 20 min com uma configuração de escape lento.
4. Depois da autoclave, coloca os frascos cónicos com ágar em um banho de água de 45 ° C até atingirem o equilíbrio (cerca de 30 min). Não coloque qualquer slurries de amostra em banho-maria até ter arrefecido a 45 ° C.

Figura 2: ilustração do protocolo. Plugues de r. solani são colocados em placas de Petri contendo extrato de água de adubo. O diâmetro do crescimento micelial é medido após 1-2 dias com o auxílio de um microscópio estéreo para melhorar a resolução e contraste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Despeje o chorume de adubo A amostra (referência autoclavados) o ágar fundido do balão A agar. Agitar o frasco para dispersar o adubo sobre o agar.
6. Despeje o ágar fundido do frasco B ágar, o chorume de adubo B amostra (amostra). Agitar o frasco para dispersar o adubo sobre o agar.
7. Despeje a mistura de cada balão em cinco pratos de Petri plástico que são de 100 mm de diâmetro.
8. Deixe a noite legal de placas para que o ágar endurece.

3. Adicione o desafio de Rhizoctonia

1. Utilizando técnica asséptica, transferir pedaços de tamanho igual de r. solani para cada par de placas de ágar de amostra (3 a 5 mm corkborer funciona bem para estabelecer pedaços de tamanhos iguais). Pegue pedaços da colônia da margem externa da colônia para segurar o micélio está crescendo ativamente.
   Nota: Trabalhar em uma capa de fluxo laminar ou limpar uma bancada de laboratório com 10% de lixívia ou 70% de etanol.
2. Incube as placas em temperatura ambiente por 1-2 dias até que o crescimento da colônia atinge cerca de meio caminho até a borda das placas A.

4. medida de r. solani crescimento

1. Medir o raio do micélio em cada placa para o mais próximo 1 mm com uma régua plana claro usando um microscópio estéreo com iluminação transmitida.
   Nota: Iluminação de campo escuro ou oblíqua será mais fácil de ver e medir as hifas transparentes. Neste ponto, zonas de inibição será visíveis ao redor fragmentos de adubo na placa B se o adubo é supressivo.
2. Gravar o raio em três lugares por placa e calcular uma média dos três para servir como uma medida representativa.
3. Subtrai a média das placas das placas A B. Se B < A então existem micróbios nas placas de B que são supressivos ao patógeno r. solani .
4. Divida o raio médio pelo número de dias de desafio para expressar unidades de supressão relativa como uma taxa, micélio mm por dia.

Resultados

Adubo terminado deve ser estável e maduro, dois termos que frequentemente são utilizados indistintamente, portanto pode com segurança ser embalado e transportado e não causa efeitos adversos durante a sua utilização final⁴. Estabilidade é uma resistência à decomposição e geralmente é determinada usando índices de atividade microbiana. Medidas gerais da respiração microbiana podem medir a estabilidade de adubo, mas não necessariamente doenç...

Discussão

Sabemos por pesquisas anteriores, que certos compostos são eficazes na supressão de r. solani e que os efeitos supressivos são devido os micróbios que vivem no adubo, não as propriedades abióticos de adubo^6,8. O uso de autoclave como um meio para 'matar' a microbiota tem sido criticado porque afeta a química do carbono da mídia¹⁰. Comparou-se o uso de autoclave a vácuo filtração através de papel Whatman n º 1. Tratame...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclavable narrow-neck glass conical flask	Fisher Scientific	10-040D	125-mL
autoclavable glass testtubes	Fisher Scientific	14-925J	25-mL
dehydrated granulated agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0	500 g quantity
heat resistant gloves	Fisher Scientific	MEMGG1314WL	several brands available
Parafilm (strips of 2-3 cm wide)	Fisher Scientific	PM992 13-374-16	5 or 10 cm widths work
disposable polystyrene petri dishes	Fisher Scientific	R80116	comes in sleeves of 20/ea or cases of 500
dehydrated potato dextrose agar	Fisher Scientific	DF0013-15-8	comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams
benchtop reciprocal shaker	Thomas Scientific	1227Y31	other models will work
water bath	ThermoScientific	S37363	5L general purpose
clear ruler, flat, at least 10 cm	Any		use metric rule
ATCC culture	American Type Culture Collection	ATCC 10154	teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;
lab tape	Fisher Scientific	15935	autoclavable and removable, 1" wide preferred
water resistant marker	office or scientific supply	Sharpie fine tip	write sample number on tape