Un test de concurrence plaque comme une rapide évaluation préliminaire de la Suppression de la maladie

Résumé

Présenté est un protocole pour un test de concurrence de plaque déterminer si un compost spécifique est susceptible de contenir des bactéries et des champignons qui inhibent la croissance de Rhizoctonia solani.

Résumé

L’objectif était de développer et optimiser un bioessai de simple, abordable et efficace pour détecter les capacité suppressive de maladie d’un compost spécifique contre le champignon terricole Rhizoctonia solani. R. solani est un pathogène d’une large gamme de plantes-hôtes dans le monde entier. Le champignon survit dans le sol comme un saprophyte et pousse rapidement sur milieu gélosé eau simple. L’essai de plaque est une méthode rapide pour comparer les composts pour leur capacité à ralentir la croissance de r. solani. L’essai corrèle aussi bien avec la suppression d’autres pathogènes fongiques terricole qui survivent en tant que saprophytes dans les sols comme les premiers fléaux Alternaria, fusariose, pourridié phytophthoréen, Pythium et pourriture des racines.

Introduction

Rhizoctonia représente un vaste complexe de champignons, de laquelle Donk Thanatephorus cucumeris (Frank) (anamorphe Rhizoctonia solani Kühn de =) est l’agent pathogène causant la pourriture des racines et la fonte des semis¹. Rhizoctonia solani est un pathogène agressif et un saprophyte qui peut survivre comme sclérotes sous des conditions environnementales défavorables¹. En conséquence, il a une répartition mondiale et peut provoquer des maladies sur la large gamme de plantes hôtes, y compris les Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae et Brassicaceae entraînant des pertes économiques sérieuses.

Compost a la capacité d’abriter des agents de lutte biologique pour certains agents pathogènes de plantes². Cependant, pas tous les terreaux ne se ressemblent ni ils affectent tous les agents pathogènes de la même façon³. Carbone à base de bois a lignine supérieure aux ratios de cellulose que le foin ou la paille-carbone basé composts. R. solani préfère carbone facilement accessible dans la paille. En revanche, la lutte biologique champignons, tels que les espèces de Trichoderma , sont plus efficaces lorsque le carbone est moins facile d’obtenir. Champignons bénéfiques et les bactéries en compost peuvent supprimer des maladies des plantes par le biais de concours, antagonisme ou régulation de la croissance végétale³. Le test proposé détecte principalement antagonisme créée par la production d’antibiotiques, les ecoenzymes ou les chélateurs qui nuisent à l’agent pathogène.

Plantes biologiques sont un étalon-or pour déterminer si les composts favorisent ou dissuader de croissance végétale⁴. Cependant, plantes biologiques sont beaucoup de temps (semaines ou mois) pour terminer qui peut être plus longtemps que vous le souhaitez et exige plus de travail pour extraire les plantes avec des racines de quantifier la sévérité des systèmes racinaires. Relativement robuste, mais plus rapide des essais (jours) serait idéales pour les programmes de contrôle de la qualité. L’objectif de cet article est de démontrer un test relativement rapide et précis pour prédire le potentiel suppressive de compost. La méthode a été modelée après Alfano et al. ⁵ à deux exceptions près, des extraits de compost ont été dilués et gélose aqueuse a été utilisé à la place de la gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA). R. solani pousse rapidement sur milieu gélosé simple d’eau tandis que le PDA a favorisé la croissance des bactéries et autres champignons qui a contaminé la culture⁶.

Cet essai de plaque sert d’indicateur de suppression qui s’applique à un éventail d’agents pathogènes des plantes qui survivent dans le sol comme saprophytes y compris r. solani⁷, les premiers fléaux Alternaria, fusariose, pourridié phytophthoréen et Pythium pourridié. Le test de concurrence de plaque est utile pour dépister une gamme de produits de compost pour endiguer les communautés de microbes qui servent d’agents de lutte biologique des agents pathogènes du sol. Le test a été un des indicateurs plus constants de la suppression de la maladie dans le compost commercial produits^6,8. Produits ont été choisis pour leur variation dans la recette, maturité et processus de production.

Protocole

1. Préparez à l’avance

1. Master culture fongique (organisme d’essai)
   1. Commander auprès de l’American Type Culture Collection, Collection de microbiologie⁹, par sa téléomorphe Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031.
   2. Alternative : Recueillir des souches locales comme fait par les auteurs. Semis de radis rouge (Raphanus sativus) fonctionnent bien comme plante appât ; récupérer la terre d’un endroit connu pour avoir une histoire de pourriture de racine ou de fonte des semis causée par r. solani. Semer les graines dans le sol et isoler des lésions des racines lorsque les semis sont âgés de 3 à 4 semaines.
      1. Enlever les semis du sol et rincer à l’eau du robinet. Vous cherchez un tissu brun dans la région de l’hypocotyle entre les feuilles et la racine (Figure 1).
      2. Utiliser une simple lame de rasoir tranchant pour couper les segments de 1 cm de l’hypocotyle ou les racines qui ont une couleur brune. Utiliser forceps stérilisé à la flamme pour tremper les segments en solution à 10 % d’eau de Javel pendant 1 min, suivi d’un rinçage de 10 s dans de l’eau stérile.
         Remarque : Le haut et le bas d’une boîte de Petri stérile sont des conteneurs utiles pour cette étape.
      3. Pinces à usage stérilisé à la flamme pour transférer l’usine de pièces à l’intérieur d’une serviette en papier pour pat sécher et puis placer sur la surface d’une boîte de Pétri avec eau gélosée (15 g dans 1 L).
      4. Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un récipient en plastique avec un couvercle et laisser incuber à température ambiante (environ 20 ° C). Essuyer l’intérieur du récipient avec l’eau de Javel ou 75 % 10 % d’éthanol et laissez-le sécher à l’air avant d’insérer le plat.
      5. Garder les isolats dans le stockage à long terme sur un milieu minimal de semoule de maïs gélose inclinée (17 g dans 1 L) (à 5 ° C).

Figure 1 : symptômes de la maladie. Sols contenant r. solani se traduit par la germination inégale et mise en place (à gauche). Sur des semis de radis, les symptômes apparaissent comme des lésions brunes à l’hypocotyle (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Utilisez des plaques de gélose de dextrose (39 g dans 1 L) de pommes de terre pour l’inoculum pour cet essai de plaque.
   1. Établir une culture de la fille de Rhizoctonia culture sur gélose dextrosée à la pomme de terre un ou deux jours avant le dosage, afin d’assurer, il est bien établi sur la plaque de culture avant le dosage. Démarrer la culture de la fille en transférant un petit morceau (10 mm de diamètre) de r. solani de la culture de maître au centre d’une nouvelle plaque de gélose dextrosée à la pomme de terre (Figure 2).
      NOTE : Travailler sous une hotte à flux laminaire ou essuyer un banc de laboratoire avec 10 % d’éthanol 75 % ou de l’eau de Javel pour minimiser les risques de contamination.
3. Autoclave 25 mL tubes à essai avec 10 mL d’eau distillée (2 × nombre d’échantillons).

2. préparation des échantillons pour essai

1. Ajouter deux échantillons indépendants 0,5 g de chaque échantillon de compost pour 10 mL d’eau stérilisé dans des éprouvettes de 25 mL. Secouer les tubes à essai du jour au lendemain.
   1. Étiqueter les tubes à essai avec numéros d’échantillon unique et chaque membre de la paire comme (référence) ou B (échantillon).
2. Après 24 h, ajouter 1,5 g de gélose ordinaire à 90 mL d’eau distillée dans des flacons de deux 125 mLconical.
3. Autoclave les deux fioles coniques avec agar et l’échantillon A de chaque paire pendant 20 min avec un réglage d’échappement lent.
4. Après l’autoclave, placer les fioles coniques avec agar dans un bain d’eau de 45 ° C jusqu'à l’équilibre (environ 30 min). Ne pas mettre n’importe quel coulis de l’échantillon dans un bain-marie jusqu'à ce qu’il ait refroidi à 45 ° C.

Figure 2 : Illustration du protocole. Bouchons de r. solani sont placés sur des plats de Pétri contenant de compost extrait à l’eau. Le diamètre de la croissance mycélienne est mesuré après 1-2 jours à l’aide d’un microscope stéréo pour améliorer la résolution et le contraste. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

5. Versez le purin de compost A sample (référence autoclavé) dans l’agar fondu de la fiole d’agar A. Agiter pour disperser le compost dans la gélose.
6. Versez le purin de compost B sample (échantillon de vie) dans l’agar fondu du flacon B agar. Agiter pour disperser le compost dans la gélose.
7. Versez le mélange de chaque fiole dans cinq plats de Pétri en plastique qui sont de 100 mm de diamètre.
8. Laisser la nuit fraîche de plaques donc l’agar se durcit.

3. ajouter le défi Rhizoctonia

1. À l’aide d’une technique aseptique, transférer des morceaux de taille égale de r. solani sur chaque paire de plaques de gélose échantillon (3 à 5 mm corkborer fonctionne bien pour créer des morceaux de taille égale). Prenez les morceaux de la colonie du bord extérieur de la colonie pour assurer le mycélium est en croissance active.
   NOTE : Travailler sous une hotte à flux laminaire ou essuyer un banc de laboratoire avec 10 % d’éthanol eau de Javel ou de 70 %.
2. Incuber les plaques à température ambiante pendant 1 à 2 jours jusqu'à ce que la croissance de la colonie atteint à mi-chemin vers le bord des plaques A.

4. mesurer la croissance de r. solani

1. Mesurer le rayon du mycélium dans chaque assiette 1 mm près avec une règle claire plate à l’aide d’un microscope stéréo avec éclairage transmis.
   NOTE : Illumination Oblique ou foncé champ rendra plus facile à voir et mesurer les hyphes transparents. À ce stade, les zones d’inhibition sera visibles autour de fragments de compost dans la plaque B si le compost est suppressif.
2. Enregistrer le rayon à trois endroits par plaque et calculer une moyenne de trois pour servir une mesure représentative.
3. Soustraire la moyenne des plaques des plaques A B. Si B < A puis il y a des microbes dans les plaques de B qui sont suppressives au pathogène r. solani .
4. Le rayon moyen de diviser par le nombre de jours de défi pour exprimer les unités de suppression relative sous forme de taux, mycélium de mm par jour.

Résultats

Compost fini doit être stable et mature, deux termes qui sont souvent utilisés indifféremment, donc peut être emballé et transporté en toute sécurité et pas entraîner des effets négatifs au cours de son utilisation finale⁴. La stabilité est une résistance à la décomposition et est habituellement déterminée à l’aide d’indices de l’activité microbienne. Mesures générales de respiration microbienne peuvent mesurer de stabilité compo...

Discussion

Nous savons par les recherches antérieures, que certains composts sont efficaces pour réprimer r. solani et que les effets suppresseurs sont due à des microbes vivant dans le compost, pas les propriétés abiotiques de compost^6,8. L’utilisation de l’autoclave afin de « tuer » microbiote a été critiquée parce qu’elle affecte la chimie du carbone des médias¹⁰. Nous avons comparé l’utilisation de l’autoclave pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclavable narrow-neck glass conical flask	Fisher Scientific	10-040D	125-mL
autoclavable glass testtubes	Fisher Scientific	14-925J	25-mL
dehydrated granulated agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0	500 g quantity
heat resistant gloves	Fisher Scientific	MEMGG1314WL	several brands available
Parafilm (strips of 2-3 cm wide)	Fisher Scientific	PM992 13-374-16	5 or 10 cm widths work
disposable polystyrene petri dishes	Fisher Scientific	R80116	comes in sleeves of 20/ea or cases of 500
dehydrated potato dextrose agar	Fisher Scientific	DF0013-15-8	comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams
benchtop reciprocal shaker	Thomas Scientific	1227Y31	other models will work
water bath	ThermoScientific	S37363	5L general purpose
clear ruler, flat, at least 10 cm	Any		use metric rule
ATCC culture	American Type Culture Collection	ATCC 10154	teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;
lab tape	Fisher Scientific	15935	autoclavable and removable, 1" wide preferred
water resistant marker	office or scientific supply	Sharpie fine tip	write sample number on tape