الإرسال المتعدد وركزت التحفيز بالموجات فوق الصوتية مع الفحص المجهري الأسفار

Summary

التحفيز بالموجات فوق الصوتية نابض المنخفضة الكثافة (لبوس) وسيلة لتحفيز ميكانيكية غير الغازية من الخلايا الذاتية أو هندسيا مع عالية الدقة المكانية والزمانية. توضح هذه المقالة كيفية تنفيذ لبوس إلى مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار وكيفية التقليل من عدم تطابق مقاومة الصوتية على طول المسار بالموجات فوق الصوتية لمنع القطع الميكانيكية غير المرغوب فيها.

Abstract

من خلال التركيز نبضات الموجات فوق الصوتية المنخفضة الكثافة التي تخترق الأنسجة الرخوة، يمثل لبوس تكنولوجيا الطب الحيوي واعدة للتلاعب بأمان وعن بعد إطلاق العصبية وإفراز الهرمونات والخلايا التي أعيدت برمجتها وراثيا. ومع ذلك، ترجمة هذه التكنولوجيا لأغراض التطبيقات الطبية حاليا يعوقها الافتقار إلى الآليات الفيزيائية الحيوية التي تستهدف أنسجة الإحساس والاستجابة للبوس. سيكون نهجاً مناسباً لتحديد هذه الآليات لاستخدام أجهزة الاستشعار البصرية في تركيبة مع ليبوس لتحديد الكامنة وراء مسارات الإشارات. ومع ذلك، يجوز الأخذ بتنفيذ لبوس مجهر الأسفار القطع الميكانيكية غير مرغوب فيه بسبب وجود واجهات المادية التي تعكس، واستيعابها وينكسر الموجات الصوتية. تعرض هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإدماج لبوس للمجاهر المتوفرة تجارياً تستقيم برنامج التحصين الموسع-الأسفار مع التقليل من تأثير واجهات البدنية على طول المسار الصوتي. ويرد وصف إجراءات بسيطة لتشغيل محول عنصر مفرد بالموجات فوق الصوتية وإدخال المنطقة المحورية لمحول في جهة موضوعية. ويتضح استخدام ليبوس مع مثال للعابرين التي يسببها ليبوس الكالسيوم في الخلايا المستزرعة جليوبلاستوما البشرية تقاس باستخدام التصوير بالكالسيوم.

Introduction

العديد من الأمراض تتطلب شكلاً من أشكال التدخل الطبي الغازية. هذه الإجراءات غالباً ما تكون باهظة الثمن، ومحفوفة بالمخاطر وتتطلب فترات الانتعاش وهكذا إضافة عبئا على نظم الرعاية الصحية. الطرائق العلاجية عدم الغازية لديها القدرة على توفير بدائل أرخص وأكثر أمنا للإجراءات الجراحية التقليدية. ومع ذلك، هي غالباً ما تكون محدودة النهج غير الغازية الحالية مثل العلاج الصيدلاني أو transcranial التحفيز المغناطيسي بالمفاضلة بين اختراق الأنسجة والقرار الزمانية المكانية والآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف. وفي هذا السياق، يشكل الموجات فوق الصوتية مركزة تكنولوجيا غير الغازية واعدة مع القدرة على التعامل مع الوظائف البيولوجية داخل الأنسجة بدرجة عالية من الدقة الزمانية المكانية ومحدودة خارج الهدف آثار عميقة.

التحفيز بالموجات فوق الصوتية المركزة يتكون من إيصال الطاقة الصوتية في مواقع دقيقة عميقة داخل الكائنات الحية. يمكن أن يكون هذا الطاقة استناداً إلى المعلمات نبض الصوتية، مجموعة متنوعة من الاستخدامات الطبية. على سبيل المثال، إدارة الأغذية والعقاقير قد وافقت على استخدام عالية الكثافة "وركزت فوق الصوتية" (هيفو) للاستئصال الحراري لاورام البروستاتا والتسبب في الهزة مناطق الدماغ والرحمية والنهايات العصبية المسببة للألم في العظام الانبثاث¹ . بوساطة هيفو ميكروبوبلي التجويف يستخدم أيضا لعابر فتح حاجز الدم في الدماغ للتنفيذ الهادف للمداواة تدار النظامية². كثافة متوسط نبض المكانية الذروة (أنا_جنا) وذروة المكانية الزمانية متوسط كثافة (أنا_{الميثيل}) المستخدمة هيفو التطبيقات عادة أعلاه عدة كيلوات سم^-2 وتنتج ضغط النبض من عدة عشرات من الآلام والكروب الذهنية. قيم كثافة هذه هي أعلى بكثير من وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير أنا_جنا ، وحدود_{الميثيل} للتشخيص بالموجات فوق الصوتية، 190 ث سم^-2 و 720 ميغاواط سم^-2، على التوالي³. وفي المقابل، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن التحفيز غير مدمرة نابض بالموجات فوق الصوتية الموجودة داخل أو بالقرب من نطاق حدود كثافة الموجات فوق الصوتية التشخيصية (لبوس) يمكن أن تكون فعالة التعامل مع العصبية عن بعد و بأمان إطلاق^{4، 5،،}من^67،8و^9،إفراز الهرمونات¹⁰ والمحوره وراثيا الخلايا¹¹. حتى الآن، لا تزال الآليات الخلوية والجزيئية التي خلايا الإحساس وتستجيب للموجات فوق الصوتية غير واضحة، النافية للترجمة السريرية للبوس. ومن ثم، في السنوات القليلة الماضية، دراسات الأغشية الاصطناعية، والخلايا المزروعة والحيوانات حفز بالموجات فوق الصوتية قد اكتسبت زخما لكشف الفيزيائية والعمليات الفسيولوجية والتضمين لبوس^{12،13، ،}من ¹⁴¹⁵.

الصوت يتكون من الاهتزاز الدعاية من خلال وسيلة مادية. الموجات فوق الصوتية صوت مع تردد فوق النطاق مسموعة البشرية (أي فوق 20 كيلو هرتز). في مختبر، والموجات فوق الصوتية تصدر عموما كهرضغطية محولات الطاقة التي تحتوي على مادة يهتز في الاستجابة إلى حقل كهربائي تتأرجح في عرض النطاق ترددي عالية التردد محددة. يوجد نوعان من محولات الطاقة: واحدة عنصر محولات الطاقة والمصفوفات محول طاقة. عنصر واحد كهرضغطية محولات الطاقة تمتلك سطح منحن الذي يعمل كعدسة تركيز ويركز الطاقة الصوتية ومن ثم إلى منطقة محددة تسمى منطقة التركيز. محولات الطاقة عنصر واحد من كثير أرخص وأسهل للعمل من الصفائف محول طاقة. هذه المادة سوف تركز على محولات الطاقة عنصر واحد.

يعتمد حجم المنطقة المحورية لمحول عنصر واحد مركزة على الخصائص الهندسية للعدسة الصوتية وعن الترددات الصوتية. لتحقيق منطقة ملليمتر-حجم تنسيق مع محول عنصر واحد، ترددات الموجات فوق الصوتية في النطاق MHz مطلوبة عادة. لسوء الحظ، هي سريعة جداً يخفف الموجات الصوتية في مثل هذا التردد عندما يتم نشرها في وسيلة ضعيفة مثل الهواء. وهكذا، الموجات فوق الصوتية ميغاهرتز تحتاج إلى نشرها على العينة في مادة أكثر كثافة مثل المياه والتي تم إنشاؤها. وهذا يشكل التحدي الأول في إدماج أسلوب ليبوس مجهر.

وتحدي ثاني هو للتقليل من الواجهات المادية بين مواد مختلفة من ممانعات الصوتية (والذي نتاج للكثافة المادية والسرعة الصوتية) على طول المسار الصوتي. يمكن أن تعكس هذه الواجهات، ينكسر، مبعثر وامتصاص الموجات الصوتية، مما يجعل من الصعب تحديد مقدار الطاقة الصوتية تسليمها فعلياً بعينه. أنها قد أيضا إنشاء القطع الميكانيكية غير المرغوب فيها. على سبيل المثال، إنشاء واجهات مقاومة عدم تطابق عمودي الصوتية المنتجة تأملات موجات باكبروباجاتينج التي تتداخل مع تلك التي يروجون للأمام. على طول مسار التدخل، الموجات إلغاء بعضها البعض في المناطق الثابتة من المساحات التي تسمى العقد ونلخص في منطقة تسمى العقد المضادة، بالتناوب خلق موجات دائمة ما يسمى (الشكل 1). من المهم experimentalist لتكون قادرة على التحكم أو القضاء على هذه الواجهات التجريبية في المختبر كما أنها قد لا تكون موجودة في الجسم الحي.

قياس الأسفار من الصحفيين الضوئية طريقة معروفة لاستجواب عينات بيولوجية شفافة في الوقت الحقيقي، ومع لا اضطراب المادية. وهكذا هذا النهج يعتبر مثاليا للدراسات لبوس كما سيعرض أي تحقيقات المادية الموجودة في منطقة سونيكاتيد القطع الميكانيكية. ويصف هذا البروتوكول بتنفيذ وتشغيل لبوس مجهر تجاري برنامج التحصين الموسع-الأسفار.

Protocol

1-زراعة الخلايا على فيلم البوليستر سمعيا شفافة

1. التصفح بحجم 12 مم ثقب في الجزء السفلي من صحن الثقافة القياسية 35 ملم باستخدام الصحافة-حفر عمودي. نقل التدريبات ببطء وملابس حماية العين. إزالة قطعة من البلاستيك تعلق على الجزء السفلي من الطبق باستخدام شفرة لإنشاء سطح أملس على الجانب الخارجي (الشكل 2).
2. تطبيق طبقة رقيقة من الإيبوكسي البحرية-الصف أو الغراء في السطح السفلي الخارجي للطبق.
3. وضع فيلم بوليستر (2.5 ميكرون سمك) ضد السطح السفلي الخارجي للطبق، واضغط بشدة للتأكد من الإيبوكسي/الغراء ينتشر بالتساوي بين الفيلم وسطح البلاستيك السميك. اجذب الفيلم بطريقة الطرد مركزي بأصابع الاتهام إنشاء سطح مستو (الشكل 2).
4. عندما قد جفت الإيبوكسي/الغراء، بإيجاز شطف الجافة البوليستر-الأسفل طبق مع الإيثانول 95% وتعقيم بوضع الطبق والداخل السطح من غطاء لها تحت قوي 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية مصدر إثارة. قم بضبط المدة وكثافة لتقديم جرعة الأشعة فوق البنفسجية من حوالي 330 مللي جول سم^-2 للتدمير الكامل لمعظم أنواع الكائنات الحية الدقيقة. ويناظر هذه الطاقة تقريبا مدة 5 دقائق باستخدام 1,000 إنارة الأشعة فوق البنفسجية µW^-2 سم.
5. الكوة المتاحة تجارياً المصفوفة خارج الخلية البروتين المخاليط (امبم) في مخزن لهم في-20 درجة مئوية أو أقل في ظروف معقمة وأنابيب صغيرة (50-100 ميليلتر).
6. في بيئة معقمة (مثلاً، داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية)، تضعف أسهم مجمدة من امبم مع وسيط الثقافة المطلوبة إلى 1: 100. العمل على الجليد لمنع امبم البلمرة عند درجة حرارة الغرفة. تطبيق بسرعة 100 ميليلتر من خليط متوسطة على فيلم البوليستر. ضع الغطاء مرة أخرى على الطبق للحفاظ على العقم.
7. احتضان الأطباق أسفل البوليستر المغلفة امبم في خلية ثقافة CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية ح 6-12.
8. بعد الحضانة، نضح المتوسطة الزائدة والبذور مباشرة السطح مع الخلايا في الكثافة المرغوبة. العمل تحت ظروف معقمة للحفاظ على العقم.

2-لبوس التنفيذ

1. مكان خزان لمياه تحت الهدف المتمثل المجهر تستقيم مع حجم عمل كبير ودون أجهزة الإضاءة في مسار انتقال العدوى.
2. استخدام مكونات المجاهر المتوفرة تجارياً، مكان حامل عينة أدناه الهدف وحامل محول تحت صاحب العينة. لمحاذاة اللاحقة عينة البحث والموجات فوق الصوتية، جبل أصحاب هذه اثنين على مراحل الترجمة.
   1. مكان نقل قطع الغيار والمحركات من مراحل الترجمة خارج الدبابة أو فوق خط المياه لتجنب الأضرار الناجمة عن المياه. استخدام مواد غير قابلة للتآكل مثل الفولاذ المقاوم للصدأ أو الألومنيوم المؤكسد لمكونات المجاهر مغمورة فقط.
3. ملء الخزان بالماء منزوع ويطرد قبل استخدام محول الغمر. وينبغي أن يتزامن خط المياه بالطائرة الأفقي لصاحب العينة (الشكل 3).
   ملاحظة: يمنع المياه اقتران الكهربائية في وجود المجالات الكهربائية العالية. كما سيمنع ولﻵﻻت نثر والتعديلات من الموجات الصوتية. استنزاف المياه بعد كل تجربة استخدام مضخة أو صمام حيث أن خط المياه يقع أسفل موقع محول. أيضا، استبدال أو تصفية المياه في كثير من الأحيان وتنظيف خزان الماء حسب الحاجة لتجنب نمو الكائنات الدقيقة.

3-منحرف الإثارة الصوتية

1. استخدام مكونات المجاهر المتوفرة تجارياً، توجيه محول في موقف منحرف فيما يتعلق بمسار بصري. هذا يضمن أن تعكس أي موجات ستوجه بعيداً عن العينة (رقم 3 و رقم 4).

4-القيادة محول طاقة

ملاحظة: محولات طاقة الموجات فوق الصوتية تحويل الطاقة الكهربائية المتذبذبة إلى توسيع الميكانيكية/انكماش المواد كهرضغطية. هذا التحويل ينتج فقدان الطاقة في شكل طاقة حرارية. وبالتالي، بينما تملك محولات الطاقة حد ذروة الجهد الكهربي لإدخال، أنها تمتلك أيضا حد طاقة كهربائية لتجنب الضرر الحراري للعنصر كهرضغطية:

مع الواجب دورة جزء نسبي من الوقت للمحاكاة الكهربائية، ف الطاقة الكهربائية (بواط)، الخامس_rms الجذر-يعني-ساحة الجهد الكهربي للإدخال (في فولت) من مصدر التيار الكهربائي البديل و زي الكهربائية مقاومة (في أوم).

مع الخامس_pp ذروة إلى ذروة الجهد الكهربي للإدخال المطبقة على محول.

1. قم بإنشاء نموذج موجه جيبية تحتوي على التردد المطلوب، عدد من دورات لكل نبضة، ونبض تردد تكرار استخدام مولد دالة تجارية. بيد أن الصوت المرتفع نسبيا اللازمة لفعالية محرك محولات الطاقة القياسية بالموجات فوق الصوتية غالباً ما يتطلب إضافة مضخم لتضخيم الإخراج (أي زيادة السعة للخامس_pp) مولد الدالة.
   ملاحظة: على سبيل المثال، الشركة المصنعة لمحول يشير إلى حدود الطاقة لمحول معين هو 35 دبليو سيتم إدخال جيبية ذروة--إلى--ذروة الجهد (V_في) 500 أم في واجب دورة 50% وتضخم من خلال ديسيبل 50/100 واط مضخم تكون في حدود طاقة محول طاقة هذا؟
   1. للإجابة على هذا السؤال، حساب الجهد بعد التضخيم. لمضخم تردد راديو (RF)، يتم تعريف عامل التضخيم (dB) بواسطة:
      
      هكذا، قد تضخم الجهد إخراج الخامس سعة_pp (الخامس_pp = V_خارج) من:
      باستخدام المعادلات 1 و 2، واستخدام 50 Ω كمقاومة الكهربائية، القوة المقابلة التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الجهد،:
      
      فهذا التحفيز في حدود طاقة محول.
   2. باستخدام المثال أعلاه، حساب المعلمات الموجي (الصوت وتواتر ومدة النبضة وتواتر تكرار النبضة) التي تتوافق مع حدود الطاقة والجهد التي توفرها الشركة المصنعة لمحول. التأكد من احترام هذه الحدود لتجنب إتلاف محول وغيرها من الصكوك المتصلة.
2. اختر مولد دالة التي تعمل ضمن نطاق تردد متوافقة مع محول بالموجات فوق الصوتية. ضبط تردد مولد دالة لتواتر ذروة القيمة الاسمية لمحول.
3. إنشاء نبضة جهد جيبية المدة المطلوبة وتواتر تكرار استخدام وضع الاندفاع لمولد الدالة. ضبط الجهد الذروة إلى الذروة إلى قيمة المطلوبة. تأكد من أن مدة النبضة أقصر من الوقت المنقضي بين هما البقول على التوالي.
4. تحقق من أن الموجي يناظر الإشارة المرجوة عن طريق توصيل ناتج مولد دالة الإدخال للذبذبات.
5. قم بتوصيل ناتج مولد دالة الإدخال لمضخم الترددات اللاسلكية (الشكل 4). تأكد من أن المعلمات التحفيز في حدود من الشركة المصنعة لمحول.

5-شعاع المحاذاة

1. اختر هيدروفونات التي تعمل تردد النطاق الصوتية كثافة ومتوافقة مع تواتر وكثافة محول بالموجات فوق الصوتية.
2. إحضار غيض من التحقيق هيدروفونات بعناية إلى التركيز داخل مجال الرؤية موضوعية في الموضع المقابل لموقف العينة (الشكل 4).
3. تأكد من أن كلا من المسبار ومحول طاقة مغمورة في المياه منزوع ويطرد. لا نتوء غيض هيدروفونات مع أي كائن المادية عدا الماء كهذا سوف يغير طلاء وتؤثر على القياس.
4. تنفيذ محاذاة قبل إجمالي لمحول عن طريق وضع بصريا على محور الصوتية نحو التحقيق هيدروفونات. التأكد من أن المسافة بين السطح في محول ونصيحة هيدروفونات تناظر تقريبا البعد البؤري لمحول.
5. قم بتوصيل هيدروفونات الإخراج إلى واحدة من المدخلات إشارة للذبذبات. قم بتوصيل مشغل المزامنة من مولد دالة أخرى الذبذبات الإدخال. تصور كل الإشارات في وقت واحد على الذبذبات.
6. محرك أقراص محول مع بضع دورات الموجات فوق الصوتية في دورة العمل منخفضة ومنخفضة السعة لتجنب الأضرار بالتحقيق. تحقق مع ظروف هيدروفونات التشغيل المأمون الشركة المصنعة لتجنب إتلاف نصيحة هيدروفونات.
7. ضبط مفتاح s/الشعبة طبقاً لوقت السفر من الموجات فوق الصوتية من السطح لمحول هيدروفونات. ابحث عن إشارة هيدروفونات على الذبذبات بعد مشغل المزامنة.
8. يفجر ببطء محول باستخدام مرحلة XYZ الميكانيكية أو اليدوية. ترك محول إلى الموضع الذي يرتبط مع إشارة هيدروفونات القصوى (الشكل 4).
   ملاحظة: إذا تم اكتشاف أي إشارة من الممكن أن كثافة النبضات الصوتية منخفض جداً أو سوء محاذاة الشعاع أو متناثرة في كائن. التحقق بشكل منتظم حيث بصريا قبل الانحياز هيدروفونات ومحول الطاقة وأن لا فقاعات أو كائن فموجودة في المسار فيما عدا فيلم البوليستر. إذا كان لا يزال يتم الكشف عن لا إشارة، زيادة في الجهد الكهربي للإدخال بكمية صغيرة لزيادة السعة لإشارة هيدروفونات.

6-تحديد ضغط النبض بالموجات فوق الصوتية وكثافة

1. مع شعاع الانحياز، قياس السعة الذروة إلى الذروة من هيدروفونات الإخراج في الذبذبات الفولتية المختلفة القيادة محول. تأكد من عدم تجاوز حد الضغط الذي أوصت به الشركة المصنعة هيدروفونات.
2. تحويل هذه القياسات إلى ضغط و/أو قيم الكثافة الصوتية استخدام أسلوب المعايرة التي توفرها الشركة المصنعة هيدروفونات.
   ملاحظة: يمكن تحديد كثافة الصوتية من الضغوط والعكس بالعكس باستخدام الصيغة:
   
   مع أنا الضغط الصوتي (في ث م^-2)، ف الضغط الصوتي (في السلطة الفلسطينية)، ρ كثافة نشر المواد (000 1 كيلوغرام م^-3 للمياه) c سرعة الصوت في نشر المتوسطة (للمياه، ج = 1,500 m s^-1).
3. إنشاء منحنيات المعايرة باستخدام هذه القياسات.
   ملاحظة: قد ضغط مقابل الجهد وكثافة مقابل الجهد منحنيات شكل الخطي ومكافئ، على التوالي.
4. تحديد قيمة ضغط و/أو كثافة الجهد المحركة المطلوبة باستخدام منحنى المعايرة المقابلة.

7-الكالسيوم-حساسة/ليبوس خلية يعيش Fluorescence التصوير

1. استبدال الثقافة المتوسطة الخلية مع المخزن مؤقت المطلوب تصوير التي تحتوي على 5 ميكرون من صبغة حساسة للكالسيوم خلية بيرمينت (مثلاً، أنا فلوو-4). احتضان الطبق الثقافة في₂ CO حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1.
2. تغسل الخلايا مع المخزن المؤقت نفس خالية من الصبغة بعناية.
3. ضع الطبق في صاحب العينة. تثير الخلايا باستخدام إضاءة الضوء الأزرق (490 نيوتن متر) وضبط التعرض الكاميرا وشدة الإثارة لتجنب التشبع المفرط تبيض أو بكسل.
4. أداء الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام إعدادات اقتناء الصورة المرجوة. استخدم هدفا غمر لتحسين جودة الصورة ومع فترة طويلة من العمل عن بعد للحد من انعكاسات غير مرغوب فيها (انظر الشكل 4).

النتائج

الرقم 5 مثال عن تجربة ليبوس متعدد مع تصوير الكالسيوم. جليوبلاستوما الخلايا (A-172) كانت تزرع على امبم المغلفة البوليستر الفيلم في مستنبت القياسي (تستكمل مع المضادات الحيوية المصل و 1% 10%) والمحتضنة مع المراسل المراعية للكالسيوم الفلورية فلوو-4 صباحا. الخلايا ت...

Discussion

مزايا رئيسية لمركزه بالموجات فوق الصوتية هو قدرته على توصيل الطاقة الميكانيكية أو الحرارية غير إينفاسيفيلي للعينات البيولوجية مع عالية الدقة الزمانية. تقنيات أخرى تهدف إلى حفز ميكانيكيا الخلايا عادة ما توظف الغازية المسابير المادية (على سبيل المثال، الخلية دس) أو يتطلب تفاعل أشعة ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107