ריבוב ממוקד אולטרסאונד גירוי עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Summary

בעוצמה נמוכה פעמו אולטרסאונד גירוי (LIPUS) הוא מודאליות עבור גירוי מכני לא פולשנית של תאים אנדוגני או מהונדסים עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאמר זה מתאר כיצד ליישם את LIPUS כדי במיקרוסקופ epi-זריחה וכיצד למזער את אי התאמה של עכבה אקוסטיים לאורך השביל אולטרסאונד כדי למנוע חפצי מכני לא רצויים.

Abstract

על ידי התמקדות פולסים אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה לחדור רקמות רכות, LIPUS מייצג טכנולוגיה ביו מבטיח מרחוק ובבטחה לתפעל ירי עצבית, הפרשת ההורמונים ותאים מחדש מבחינה גנטית. עם זאת, התרגום של טכנולוגיה זו עבור יישומים רפואיים היא כיום הקשו על ידי חוסר של מנגנונים הביו-פיסיקלי שבו ממוקד רקמות הגיוני ולהגיב LIPUS. בגישה מתאימה כדי לזהות מנגנונים אלה יהיה לשימוש אופטי ביולוגיים בשילוב עם LIPUS כדי לקבוע שבבסיס איתות המסלולים. עם זאת, יישום LIPUS כדי מיקרוסקופ פלורסצנטיות יכול להכיר רצויה חפצי מכני בשל נוכחותם של ממשקים פיזיים לשקף, לספוג, מסיטים גלים אקוסטיים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב כדי לשלב את LIPUS כדי זמין מסחרית זקוף epi-זריחה מיקרוסקופים תוך מזעור ההשפעה של ממשקים פיזיים לאורך השביל אקוסטית. הליך פשוט מתואר לפעול מתמר אולטרסאונד רכיב אחד וכדי להכניס את אזור מוקד של המתמר מוקד אובייקטיבית. השימוש LIPUS מודגם עם דוגמה של סידן LIPUS-induced שנחשולי בתאים בתרבית גליובלסטומה האדם נמדד באמצעות הדמיית סידן.

Introduction

מחלות רבות דורשות צורה כלשהי של התערבות רפואית פולשנית. הליכים אלה לעיתים יקר, מסוכן, דורשים ותקופות התאוששות, ובכך להוסיף נטל מערכות הבריאות. פולשני שיטות טיפוליות יש פוטנציאל לספק חלופות בטוחות יותר וזול יותר ניתוחים קונבנציונלי. אולם, לגישות פולשני כגון גירוי מגנטי pharmacotherapy או טראנס מוגבלים לעיתים קרובות על ידי הפשרות בין חדירה לרקמות, ייתכן רזולוציה ואפקטים את המטרה לא רצויים. בהקשר זה, אולטרסאונד ממוקד מהווה טכנולוגיה לא פולשנית מבטיחה עם פוטנציאל לתמרן תפקודים ביולוגיים עמוק בתוך רקמות עם רמת דיוק גבוהה ייתכן ואפקטים את המטרה מוגבל.

אולטרסאונד ממוקד גירוי מורכב אספקת אנרגיה אקוסטית-מיקומים מדויקים עמוק בתוך אורגניזמים חיים. בהתאם הדופק אקוסטית פרמטרים, אנרגיה זו יכול להיות מגוון רחב של שימושים רפואיים. למשל, מינהל המזון והתרופות שאושרה השימוש אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HiFU) על אבלציה תרמי של גידולים בערמונית, אזורים במוח הגורמים רעד, מיומות, גרימת כאב חיבורי עצבים גרורות בעצמות¹ . Microbubble המוביל בתיווך HiFu קוויטציה משמש גם לפתיחת מחסום הדם - מוח למסירה יישוב של הרפוי מערכתית בניהול²transiently. עוצמת הדופק הממוצע המרחבי-לשיא (אני_sppa) ועוצמת טמפורלית הממוצע המרחבי-לשיא (אני_spta) המשמש HiFU יישומים הם בדרך כלל מעל kW כמה ס מ^-2 ולייצר לחץ דופק של כמה עשרות של MPa. אלו ערכי העוצמה גם הרבה מעל ה-FDA אישר לי_sppa ואני_spta מגבלות עבור אבחון אולטרסאונד, W 190 ס מ^-2 ו- 720 mW ס מ^-2,³בהתאמה. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גירוי אולטרסאונד פעמו הרסניות הנמצאים בתוך או ליד הטווח של אבחון אולטרסאונד בעוצמה גבולות (LIPUS) יכול להיות יעיל מרחוק ובבטחה לתפעל עצבית ירי^{4, 5,}-^6,-^7,-⁸,^9,הפרשת ההורמונים¹⁰ והנדס תאים¹¹. ובכל זאת, מנגנוני תאית ומולקולרית שבו תאים לחוש ולהגיב אולטרסאונד עדיין אינן ברורות, מסלק קליניים תרגום של LIPUS. לכן, בשנים האחרונות, מחקרים של ממברנות מלאכותיות, תאים בתרבית וחיות מגורה עם אולטרסאונד קיבלו תנופה כדי לחשוף biophysical, תהליכים פיזיולוגיים מווסת על ידי LIPUS^{12,13, 14,15}.

צליל מורכב רטט הפצת דרך תווך הפיזי. אולטרסאונד היא צליל עם תדירות בגובה שמיע אנושי (קרי, מעל 20 קילוהרץ). באווירה מעבדה, גלי אולטרסאונד מופקים בדרך כלל על ידי מתמרים פיזואלקטריים המכילים חומר רוטט בתגובה שדה חשמלי נדנוד פס בתדירות גבוהה ספציפיים. קיימים שני סוגי מתמרים: יחיד רכיב מתמרים ומערכים מתמר. מתמרים פיזואלקטריים רכיב יחיד בעלי משטח מעוגל אשר משמש עדשה התמקדות, ומכאן מתרכזת אנרגיה אקוסטית לתוך אזור מוגדר נקרא אזור מוקד. אלמנט יחיד מתמרים הם יותר זול וקל לתפעול מאשר מתמר מערכים. מאמר זה יתמקד מתמרים רכיב יחיד.

הגודל של האזור מוקד של מתמר ממוקד רכיב יחיד תלוי על מאפיינים גיאומטריים של העדשה אקוסטית תדירותו אקוסטית. כדי להשיג מילימטר-גודל אזור מיקוד עם מתמר רכיב יחיד, אולטרסאונד תדרים בטווח MHz נדרשים בדרך כלל. למרבה הצער, גלים אקוסטיים בתדר כזה הם מהר מאוד הקלוש כאשר הופץ במדיום רפים כגון אוויר. לפיכך, גלי אולטרסאונד MHz צריך להיות שנוצר להפיץ את הדגימה מהותי צפופה כמו מים. זה מהווה את האתגר הראשון בשילוב LIPUS לערוץ מיקרוסקופ.

האתגר השני הוא למזער ממשקים פיזיים בין חומרים עם שונה אקוסטית impedances (שהיא תוצר של צפיפות גשמי, המהירות אקוסטית) לאורך השביל אקוסטית. ממשקים אלה יכול לשקף, מסיטים, פיזור ולקלוט גלים אקוסטיים, ולכן קשה לכמת את כמות האנרגיה אקוסטית ביעילות למסור דגימה. הם גם עלולים ליצור חפצי מכני לא רצויים. למשל, השתקפויות אי-התאמה בניצב אקוסטית המיוצר עכבה ממשקים ליצור גלים backpropagating להפריע אלה הפצת קדימה. לאורך השביל הפרעות, הגלים לבטל אחד את השני בכל האזורים קבוע של רווחים בשם צמתים סכום למעלה-לסירוגין אזורים בשם אנטי-צמתים, יצירת גלים עומדים כביכול (איור 1). חשוב experimentalist היכולת לשלוט או לחסל אלה ניסיוני ממשקי חוץ גופית בתוך כפי שהם אינם יכולים להתקיים בתוך vivo.

פלורסצנטיות מדידה של כתבים אופטי הוא שיטה ידועה לחקור דגימות ביולוגיות שקוף בזמן אמת, עם הפרעות גופניות. גישה זו ולכן אידיאלי ללימודי LIPUS כמו כל רגשים הפיזית הנוכחים בשטח sonicated תציג חפצי מכני. פרוטוקול זה מתאר את יישום ותפעול של LIPUS כדי מיקרוסקופ אפינפרין מסחרי-זריחה.

Protocol

1. גידול תאים על הסרט פוליאסטר שקוף המתקפלות

1. תרגיל בגודל 12 מ"מ חור בתחתית לצלחת תרבות רגיל 35 מ מ באמצעות העיתונות-תרגיל אנכי. את התרגיל לאט לאט, לענוד הגנה העין. הסר את חתיכות הפלסטיק המצורף בתחתית המנה באמצעות סכין כדי ליצור משטח חלק בצד החיצוני (איור 2).
2. למרוח שכבה דקה של ימית-כיתה אפוקסי או דבק על פני השטח החיצוני התחתון של המנה.
3. במקום סרט של פוליאסטר (עובי 2.5 מיקרומטר) נגד מהמשטח התחתון חיצוני של המנה ולחץ בחוזקה כדי לוודא שהאפוקסי/הדבק מתפשט באופן שווה בין הסרט לבין משטח הפלסטיק עבה. משוך בעדינות את הסרט בצורה צנטריפוגלי עם האצבעות כדי ליצור משטח שטוח (איור 2).
4. כאשר האפוקסי/הדבק התייבש, בקצרה שטיפה יבשה פוליאסטר-התחתון צלחת עם 95% אתנול ולחטא על-ידי הצבת המנה ובתוך המשטח של המכסה שלה תחת חזקה 254 ננומטר UV עירור מקור. להתאים את משך ועוצמת לספק מנה UV של 330 אמ ס מ^-2 להרס מוחלט של רוב סוגי מיקרו אורגניזמים. אנרגיה זו כ מקביל משך זמן של 5 דקות באמצעות של^-2 ס מ µW 1,000 UV תאורה.
5. Aliquot מטריצה חוץ-תאית זמינים מסחרית חלבון תערובות (EMPM) ב שפופרות קטנות (µL 50-100) וחנות אותם ב-20 ° C או פחות בתנאים סטריליים.
6. בסביבה סטרילית (למשל, בתוך ארון אבטחה), לדלל מלאי קפוא של EMPM עם המדיום התרבות הרצויה כדי מטריים. לעבוד על קרח כדי למנוע EMPM פלמור בטמפרטורת החדר. להחיל במהירות 100 µL של התערובת בינונית על הסרט פוליאסטר. מניחים את המכסה בחזרה על המנה כדי לשמור על עקרות.
7. דגירה התחתון פוליאסטר מצופה EMPM מנות תרבות CO תא₂ החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-12 שעות.
8. לאחר דגירה, תשאף המדיום עודף, זרע ישירות השטח עם תאים על הצפיפות הרצויה. עבודה בתנאי סטרילי כדי לשמור על עקרות.

2. LIPUS יישום

1. מקום מיכל מים מתחת המטרה של מיקרוסקופ זקוף עם נפח עבודה גדול, ללא תאורה בחומרה נתיב השידור.
2. באמצעות רכיבי optomechanical זמין מסחרית, מקום בעל מדגם מתחת המטרה ומחזיק מתמר מתחת המחזיק לדוגמה. הדגימה הבאים ליישור חיפוש ואולטרסאונד, הר אלה שני בעלי שלבים תרגום.
   1. מניחים את חלקי נע, מפעילים של שלבי התרגום מחוץ למיכל או מעל קו המים כדי למנוע נזקי מים. השתמש רק חומרי מתכלה כגון אלומיניום או נירוסטה עבור רכיבי optomechanical שקוע.
3. למלא את המיכל מים יונים degassed לפני ניצול מתמר טבילה. קו המים צריך לחפוף עם מישור האופקי של בעל מדגם (איור 3).
   הערה: מים יונים מונעת צימוד חשמלי בנוכחותו של שדות חשמליים גבוהה. Degassing תמנע גם פיזור והשינויים של גלים אקוסטיים. מרוקנים את המים לאחר כל הניסוי באמצעות משאבה או שסתום כך קו המים יורד מתחת המיקום של המתמר. בנוסף, להחליף או לסנן את המים לעתים קרובות וניקיון למיכל המים כנדרש, כדי למנוע צמיחה של מיקרואורגניזמים.

3. המלוכסן עירור אקוסטי

1. באמצעות רכיבי optomechanical זמינים מסחרית, אוריינט המתמר בעמדה אלכסונית ביחס הנתיב אופטי. פעולה זו תבטיח כי כל משתקפת גלים יופנו מן המדגם (איור 3 ו- 4 באיור).

4. נהיגה מתמר

הערה: אולטרסאונד מתמרים להמיר אנרגיה חשמלית נדנוד מכני התרחבות להתכווצות של חומר פיזואלקטריים. המרה זו מפיקה אובדן אנרגיה בצורה של אנרגיית חום. לפיכך, בעוד מתמרים בעלי מגבלה קלט מתח שיא, הם גם בעלי גבול חשמל כדי למנוע נזק תרמי אלמנט פיזואלקטריים:

בחובתה מחזור השבר היחסי של זמן של סימולציה חשמל, P החשמל (בוואט), V_rms המתח שורש-ממוצע-הריבועים קלט (ב וולט) של מקור מתח חלופי ו- Z חשמל עכבה (ב אוהם).

עם V_pp המתח קלט שיא אל שיא שהוחל המתמר.

1. ליצור טופס גל sinusoidal המכיל את התדירות הרצויה, מספר מחזורי לפי הדופק, ואין דופק תדירות חזרה באמצעות גנרטור פונקציה מסחרית. עם זאת, Vpp גבוה יחסית צריך לנהוג ביעילות את אולטרסאונד רגיל מתמרים, לעיתים קרובות דורש התוספת של מגבר כוח כדי להגביר את הפלט (קרי, להגדיל משרעת של V_pp) של הגנרטור פונקציה.
   הערה: לדוגמה, היצרן של מתמר מציין את מגבלת כוח עבור מתמר נתון הוא 35. W Sinusoidal שיא אל שיא יזין מתח (V_ב) של 500 mV-חובה מחזור של 50% ו מוגבר באמצעות 50 dB/100 W מגבר להיות בתוך מגבלת הכוח של מתמר הזה?
   1. כדי לענות על שאלה זו, לחשב את המתח לאחר הגברה. עבור מגבר כוח תדרי רדיו (RF), הגורם הגברה (dB) מוגדרת על-ידי:
      
      לכן, יש מתח מוגבר של משרעת פלט V_pp (V_pp = V_החוצה) של:
      באמצעות משוואות 1 ו-2, באמצעות 50 Ω כמו עכבה חשמלית, הכוח המקביל שנוצר על ידי מתח זה הוא:
      
      לגירוי הזה לכן בתוך מגבלת הכוח של המתמר.
   2. באמצעות הדוגמה לעיל, לחשב את צורת גל הפרמטרים (Vpp, תדירות, משך פעימה, תדירות החזרה דופק) התואמים מגבלות הכוח ומתח שסיפק היצרן של המתמר. ודא לכבד את מגבלות אלה כדי למנוע נזק המתמר ומכשירים אחרים המחוברים.
2. לבחור גנרטור פונקציה הפועלת בתוך טווח תדר תואם מתמר האולטרסאונד. התאם את התדירות של מחולל על תדירות שיא הנומינלי של המתמר.
3. ליצור מתח sinusoidal הדופק הרצוי משך, תדירות חזרה באמצעות מצב פריצה של הגנרטור פונקציה. התאם מתח שיא אל שיא לערך הרצוי. ודא כי משך הדופק הוא קצר יותר מאשר הזמן שחלף בין שני פולסים עוקבים.
4. בדוק כי waveform תואם האות הרצויה על-ידי חיבור הפלט של מחולל הקלט של תנודות.
5. לחבר את הפלט של מחולל הקלט של מגבר RF כוח (איור 4). ודא כי הפרמטרים גירוי הם בגבולות היצרן של המתמר.

5. קרן יישור

1. לבחור הידרופון ופועלת עם תדר בטווח ואקוסטית בעוצמה תואם תדירות ועוצמת מתמר אולטרסאונד.
2. בזהירות להכניס את קצה בדיקה הידרופון מוקד בתוך שדה הראייה האובייקטיבית במיקום המתאים למיקום של המדגם (איור 4).
3. ודא כי המכשיר והן מתמר שקועים במים יונים ו- degassed. לא להקפיץ את קצה ההידרופון עם אובייקט פיזי כלשהו מלבד מים זה לשנות את ציפוי שלה, להשפיע על המדידה.
4. לבצע יישור קדם ברוטו של המתמר על-ידי חזותית מיקום ציר אקוסטית לעבר החללית הידרופון. מוודא כי המרחק בין פני השטח של המתמר הטיפ הידרופון שיתאימו כ אורך מוקד של המתמר.
5. להתחבר ההידרופון פלט לאחת אות קלט של אוסצילוסקופ. להתחבר על ההדק סינכרון מ מחולל אותות קלט אוסצילוסקופ אחר. דמיינו שני אותות בו זמנית על אוסצילוסקופ.
6. כונן המתמר עם כמה מחזורים אולטרסאונד מחזור נמוך, משרעת נמוכה כדי למנוע נזק החללית. בדוק בתנאים של ההידרופון יצרן פעולה בטוחה כדי למנוע נזק הטיפ הידרופון.
7. התאם את כפתור s/חלוקה לפי משך הנסיעה של אולטרסאונד ממשטח של המתמר על ההידרופון. חפשו אות הידרופון אוסצילוסקופ לאחר ההדק סינכרון.
8. לאט לאט להניע מתמר באמצעות שלב XYZ ממונע או ידנית. יוצאים המתמר למצב זה לא מופיע עם האות הידרופון מקסימלי (איור 4).
   הערה: אם אין אות זוהה זה אפשרי כי האינטנסיביות של הפולסים אקוסטית הוא נמוך מדי או הקרן כי מיושרים או מפוזרים על-ידי אובייקט. בדוק בקביעות כי הידרופון של מתמר הן מבחינה ויזואלית מסודרים מראש כי אין בועות או האובייקט הפיזי נמצאים בנתיב מלבד הסרט פוליאסטר. אם אין אות עדיין מזוהה, תגביר את המתח קלט על-ידי כמות קטנה כדי להגדיל את משרעת הידרופון אות.

6. קביעת לחץ דופק באולטרסאונד ועוצמה

1. בעזרת קרן מיושר, למדוד את משרעת השיא אל שיא של ההידרופון פלט-אוסצילוסקופ עבור מתחים שונים נהיגה המתמר. ודא שלא לחרוג ממגבלת לחץ המומלץ על ידי היצרן של ההידרופון.
2. להמיר מדידות אלה לחץ ו/או ערכי העוצמה אקוסטית בשיטת הכיול שסיפק היצרן של ההידרופון.
   הערה: ניתן לקבוע את עוצמת אקוסטית מן הלחץ ולהיפך תוך שימוש בנוסחה:
   
   עם אני הלחץ אקוסטית (ב W ז^-2), P לחץ אקוסטי (ב- Pa), ρ הצפיפות של הפצת חומר (1,000 ק"ג מ^-3 למים) ו- c מהירות הקול ב הפצת בינוני (מים, c = 1,500 מ' s^-1).
3. ליצור עקומות כיול באמצעות מדידות אלה.
   הערה: לחץ לעומת מתח ועוצמה מול מתח העקומות יש צורה קווית, פרבוליות, בהתאמה.
4. לקבוע את הערך לחץ ו/או בעוצמה של מתח נהיגה הרצוי באמצעות עקומת כיול המתאימים.

7. סידן-רגיש/LIPUS לחיות תאים פלורסצנטיות הדמיה

1. להחליף בינוני תרבות של התא עם מאגר ההדמיה הרצויה המכיל 5 מיקרומטר של צבע סידן תלויית התא-permeant (למשל, אני Fluo-4). דגירה המנה תרבות ב חממה₂ CO ב 37 ° C עבור 1 h.
2. לשטוף היטב תאים עם המאגר אותו ללא צבע.
3. הכנס את המאכל בעל מדגם. לרגש את התאים באמצעות תאורה אור כחול (490 nm) ולהתאים את עוצמת עירור וחשיפת המצלמה כדי למנוע עודף רוויה הלבנה או פיקסל.
4. לבצע הדמיה בצילום מואץ באמצעות הגדרות רכישת התמונה הרצויה. השתמש אובייקטיבית טבילה איכות תמונה טובה יותר, ועם זמן ומרחק עבודה כדי לצמצם השתקפויות רצויה (ראה איור 4).

תוצאות

איור 5 הוא דוגמה של ניסוי LIPUS מרובב עם סידן הדמיה. Glioblastoma תאים (A-172) היו גדל על EMPM מצופה פוליאסטר סרט בינוני תרבות רגיל (בתוספת 10% סרום ו 1% אנטיביוטיקה), מודגרות עם הכתב פלורסנט סידן רגיש Fluo-4 בבוקר. התאים היו עם תמונה באמצעות עדשה טבילה X 10 ומאוירות מקור אור LED ל?...

Discussion

יתרון הראשי של אולטרסאונד ממוקד היא היכולת שלה לא-פולשנית להעביר אנרגיה מכנית ו/או תרמית דגימות ביולוגיות עם דיוק גבוהה-עתיים. טכניקות אחרות שנועדו מכנית לעורר תאים בדרך כלל מעסיקים רגשים הפיזית פולשני (למשל, תא-מציץ) או דורשת את האינטראקציה של קרני לייזר באנרגיה גבוהה עם חפצים זרים (<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107