JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتطوير وتوصيف نموذج حمار وحشي من الصرع الناجم عن تثبيط عابر للجين DEPDC5.

Abstract

يمثل الصرع أحد الاضطرابات العصبية الأكثر شيوعا، حيث يصيب ما يقدر بنحو 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. وقد كشفت التطورات الأخيرة في البحوث الجينية مجموعة كبيرة من الجينات المتورطة في أشكال مختلفة من الصرع، وتسليط الضوء على الطبيعة غير المتجانسة لهذا الاضطراب. النماذج الحيوانية المناسبة ضرورية للتحقيق في الآليات المرضية الناجمة عن الطفرات الوراثية المتورطة في الصرع وتطوير علاجات متخصصة ومستهدفة. في السنوات الأخيرة، برزت سمكة الحمار الوحشي ككائن فقري قيم لنمذجة الصرع، مع استخدام كل من التلاعب الجيني والتعرض للأدوية المعروفة الصرع، مثل pentylenetetrazole (PTZ)، لتحديد العلاجات الجديدة المضادة للصرع. وقد ارتبطت الطفرات الضارة في منظم mTOR DEPDC5 مع أشكال مختلفة من الصرع البؤري وهدم تقويم العظام حمار وحشي يسبب فرط النشاط المرتبطة نوبات عفوية مثل المضبوطات، فضلا عن تعزيز النشاط الكهربائي والسباحة عجلة بدوره مميزة. هنا، وصفنا الطريقة التي ينطوي عليها توليد نموذج DEPDC5 لفقدان الوظيفة وتوضيح بروتوكول لتقييم النشاط الحركي في 28 و 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf)، فضلا عن طريقة لتسجيل النشاط الميداني في استئصال سمك الحمار الوحشي البصري. كما يتم توفير توضيح لتأثير عقار PTZ الصرع على نشاط الخلايا العصبية مع مرور الوقت.

Introduction

نظرا لصغر حجمها، والتنمية oviparous والشفافية في المراحل المبكرة من التنمية، برزت حمار وحشي ككائن فقري قيمة لنمذجة الأمراض البشرية متنوعة مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان أو الاضطرابات العصبية1،2. تجمع سمكة الحمار الوحشي بين مزايا الفقاريات ، بما في ذلك الحفاظ العالي على بنية الأعضاء والشفرة الوراثية ، مع صغر حجم وسهولة التلاعب الجيني للكائنات النموذجية الأبسط ، وبالتالي تسهيل كل من الدراسات الأساسية والتطبيقات التحويلية. وعلى وجه الخصوص، فإن قابليتها للفحص الآلي عالي الإنتاجية للسلوك وعلامات الفلورسنت للعمليات الخلوية جعلت من سمك الحمار الوحشي نموذجا جذابا بشكل خاص لأبحاث الصرع. وقد تجلى ذلك في الزيادة الكبيرة في العقد الماضي من عدد المنشورات التي تتميز النماذج الناجمة كيميائيا و / أو الوراثية من الصرع3،4،5 ، ومؤخرا ، تقارير عن العلاجات الواعدة التي تم الحصول عليها من الشاشات الكيميائية في هذه النماذج6،7،8.

DEPDC5 هو عضو في مجمع GATOR1 ، وهو منظم سلبي للإشارة mTOR9. تم اكتشاف الطفرات في جين DEPDC5 لأول مرة في عام 2013 في probands الذين يعانون من الصرع البؤري المهيمن على الأمراض الذاتية10،11، ومنذ ذلك الحين تم الإبلاغ عنها في عدد من الحالات السريرية المرتبطة بمظاهر الصرع البؤرية وخلل التنسج القشري البؤري12. ومن المتوقع أن الغالبية العظمى من الطفرات المبلغ عنها أن يسبب فقدان وظيفة الجين12, وهذا ما ثبت رسميا لعدد من النصوص DEPDC5 تحور التي تستهدفها هراء بوساطة اضمحلال الحمض النووي الريبي12,13. في الاتفاق، الضربة القاضية من تقويم الجينات في حمار وحشي باستخدام المضادة للمنطق مورفولينو oligonucleotides (AMOs) النتائج في عدد من الميزات التي هي مشتركة بين نماذج الصرع في هذا الكائن الحي، بما في ذلك فرط النشاط، بدوره عجلة مثل السباحة، والنوبات العفوية وتعزيز النشاط العصبي14،15،16،17،18. ومن المثير للاهتمام, العلاج مع rapamycin, مثبط للإشارة mTOR, عكس السمات السلوكية لهذا النموذج18, دعم فرضية أن DEPDC5 فقدان وظيفة يمكن أن تؤدي إلى الصرع بسبب سوء تنظيم المسار mTOR9,19.

عابرة ضربة قاضية من التعبير الجيني في الجسم الحي باستخدام أوليغونوكليوتيدات مضادة للمنطق تحمل تعديل مورفولينو كان أداة لا تقدر بثمن لدراسة دور جينات محددة، على قدم المساواة مع تقنيات si / shRNA القائم. في الآونة الأخيرة ، وجدت الاستراتيجيات القائمة على AMO أيضا تطبيقات سريرية ، مع تلقي أول علاج AMO موافقة إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج ضمور العضلات دوشين في عام 201620 . في حين أفيد أنه في حمار وحشي النمط الظاهري للجين الحاد القائم على AMO الضربة القاضية لا يرتبط دائما مع نماذج الضربة القاضية التأسيسية21، وهذا يمكن أن يكون راجعا على الأقل في بعض الحالات إلى آليات تعويضية ولدتها التعديلات الوراثية التأسيسية22. ومع ذلك ، فإن مسألة خصوصية النمط الظاهري الناجم عن AMO هي مصدر قلق لا جدال فيه يجب معالجته بجد في الدراسات التي تستخدم هذه التكنولوجيا23. من أجل ضمان خصوصية النمط الظاهري القائم على AMO ، هناك العديد من الضوابط الرئيسية الضرورية. وتشمل هذه منحنى الجرعة والاستجابة التي تسمح باختيار أدنى جرعة من AMO فعالة لضرب الجينات إلى أسفل، وتجنب السمية الشاملة بسبب إدخال فائض من المواد الوراثية. كما أن استخدام AMO غير متطابقة التي لا تستهدف أي منطقة معينة في الجينوم مطلوب أيضا لتحديد جرعة مناسبة وفي تحديد النمط الظاهري محددة. ومن الضروري إجراء AMO ثاني يستهدف منطقة مختلفة من نفس الجين، مثل AMO مانعة للربط، للتأكد من أن النمط الظاهري يرجع إلى هدم الجين المستهدف. إنقاذ النمط الظاهري الضربة القاضية مع cDNA من الجين، إما تقويم العظام البشري أو نسخة معدلة كودون من جين حمار وحشي التي لا يمكن استهدافها من قبل AMO، ويوفر حجة قوية لصالح خصوصية النمط الظاهري. عدم وجود الإنقاذ مع نفس cDNA التي تحتوي على فقدان وظيفة الطفرات (مثل إدخال codons توقف في وقت مبكر) هو دليل آخر في هذا الاتجاه.

هنا، نقدم طريقة لتوليد نموذج فقدان الوظيفة DEPDC5 حمار وحشي وبروتوكول phenotyping السلوكية في 28 و 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf). في 28 hpf, DEPDC5 فقدان الوظيفة يسبب فرط النشاط العام, كما يتضح من تعزيز اللف وحركات الارتعاش من الأجنة داخل المشيمة. يمكن استخدام نظام آلي للكشف عن الحركة في هذه المرحلة لتحديد النشاط الإجمالي لكل جنين. في 48 حصان، حمار وحشي معرض النمطية الهروب السباحة استجابة للمس. في حمار وحشي مع التعبير عن downregulated DEPDC5، مسار السباحة هو أكثر بكثير من ملتوية في الضوابط ، والأسماك التي تظهر "المسمار الفلين" أو "بدوره عجلة" مثل نمط ، على غرار نماذج الصرع الأخرى المبلغ عنها في هذا الكائنالحي 3،4. تم الحصول على تسجيلات كهربية في الصفت البصري في يرقات حمار وحشي بين 4-6 أيام بعد الإخصاب (dpf) وتظهر زيادة أساسية في نشاط الخلايا العصبية في الحيوانات المنسدلة DEPDC5. ميزة هذا النموذج هو أنه يقدم العديد من الميزات الظاهري في نقاط زمنية مختلفة, والتي يمكن أن تكون مفيدة في رصد وتقييم فعالية العلاجات الدوائية أثناء التنمية.

Protocol

وقد وافقت اللجان الوطنية والمؤسسية المعنية بالأخلاقيات على الإجراءات التجريبية.

1. عابرة الضربة القاضية من الجينات DEPDC5 في جنين حمار وحشي

  1. إعداد الأدوات:
    1. إعداد السيليكون elastomer المغلفة حقن أطباق بيتري: مزيج قاعدة وعامل علاج من عدة (انظر جدول المواد) في نسبة 10:1. ملء طبق بيتري 35 ملم في منتصف الطريق مع الخليط. انتظر السيليكون لتصلب قبل استخدامه (وهذا يمكن أن يستغرق عدة أيام).
    2. إعداد 1.2 mmol /L حلول الأسهم من المضادة للسينس مورفولينو أوليغونوكليوتيدات (AMO; انظر جدول المواد). إضافة 250 ميكرولتر من الماء المعقم إلى 300 نانولي اليوفيلية AMO للحصول على محلول مخزون 1.2 ملليمول / لتر. للذوبان الكامل، سخني القنينات لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. دوامة لفترة وجيزة. ختم غطاء أنبوب مع فيلم من البلاستيك (انظر جدول المواد).
    3. لتجارب الإنقاذ السيطرة، وإعداد تعبير البلازميد التي تحتوي على cDNA الإنسان من DEPDC5 (انظر جدول المواد)المستنسخة في العمود الفقري pCS2 أو تعبير مماثل متوافق مع حمار وحشي البلازميد. كتحكم سلبي ، تم إدخال طفرة تسبب كودون التوقف المبكر (p.Arg487*) في cDNA.
    4. إعداد مياه الجنين: 0.06 غرام / لتر ملح حوض السمك (انظر جدول المواد) في مياه التناضح العكسي + 0.5 ملغم / لتر الميثيلين الأزرق.
    5. يوم الحقن، وإعداد الإبر الزجاجية بوروسيليكاتيون microinjection باستخدام سحب (انظر جدول المواد). وضع إعدادات درجة الحرارة المناسبة على سحب الإبرة. استخدام 10 سم طويلة، 1/0.5 OD/ ID مم البوروسيليكات الزجاج الشعرية لتوليد اثنين ~ 5 سم الشعيرات الدموية مع نصائح رقيقة مع طول ما يقرب من 1 سم.
    6. إذا كان غيض من الإبر على ما يرام جدا، ومنع طرد الحل، وكسر نهاية جدا من طرف مدبب باستخدام ملقط تحت المجهر.
    7. قبل الحقن مباشرة، قم بإعداد حلول العمل للأجسام AMOs. إعداد حل جديد دائما لضمان استنساخ النتائج. سخني قنينات مخزون AMO عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إعداد عينة حقن 5 ميكرولتر تحتوي على صبغة خضراء سريعة (تركيز نهائي 0.02٪، انظر جدول المواد)و AMO المخفف في تركيز العمل في الماء.
    8. تحديد تركيز العمل من AMO تجريبيا لكل جين باستخدام منحنى استجابة الجرعة. يمثل تركيز العمل تركيزا يكون فيه AMO فعالا في هدم الجين دون التسبب في سمية عامة ، مثل العيوب المورفولوجية الإجمالية. عادة، ستكون تركيزات العمل AMO في نطاق 0.2 ملليمول/لتر إلى 1 ملليمول/لتر (تم تحديد 0.4 ملليمول/لتر ه ه كتركيز فعاللهذه الدراسة 18). حقن التحكم عدم تطابق مورفولينو في نفس تركيز AMO فعالة.
    9. دوامة الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة لجلب قطرات إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
    10. لتجارب الإنقاذ، وإعداد عينة حقن 5 ميكرولتر مع AMO المخفف في تركيز العمل وتعبير cDNA البلازميد المخفف في الماء إلى تركيز نهائي ليتم تحديده تجريبيا. للتعبير عن DEPDC5 وplasmid التحكم السلبي، 100 نانوغرام / ميكرولتر كانت فعالة لإنقاذ phenotypic.
  2. إعداد الأجنة:
    1. في اليوم السابق للميكرويينجيكت، قم بإعداد خزانات تزاوج سمك الحمار الوحشي. صباح اليوم من الحقن، وإزالة فواصل لتمكين التفريخ. جمع البيض في أطباق بيتري 100 ملم مليئة بمياه الجنين باستخدام منخل غرامة. حقن في غضون 20-30 دقيقة من جمع، في حين أن البيض في مرحلة خلية واحدة.
    2. اختيار 60-80 بيضة مع ماصة باستور البلاستيك وترتيبها في طبق بيتري المغلفة السيليكون للحقن. سطح السيليكون سيمنع البيض من الانزلاق أثناء الحقن. إزالة معظم مياه الجنين، وترك ما يكفي لتغطية البيض في منتصف الطريق.
  3. الاحتياجات الدقيقة:
    1. ملء إبرة زجاجية مع محلول الحقن. ضع الإبرة عموديا في أحد الأنابيب التي تحتوي على محلول الحقن ، مع التأكد من أن الطرف السفلي من الإبرة يلمس المحلول. انتظر عدة دقائق حتى يرتفع محلول الحقن الملون عن طريق الشعيرات الدموية ويمكن رؤيته في طرف الإبرة.
    2. جبل الإبرة شغلها على مقبض حقن من microinjector (انظر جدول المواد).
    3. قم بتشغيل ضاغط الهواء وضبط إعداد الضغط لتوليد حجم حقن قدره ~ 2 nL.
    4. لحساب حجم المحلول المحقون، ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكروتوم. حقن محلول الصبغة التي تحتوي على استخدام الضغط المحدد والمعلمات الوقت. قياس قطر مجال السوائل المحقونة وحساب الحجم الإجمالي باستخدام حجم الصيغة = 4/3 * π *(د/2)3، حيث د = القطر المقاس للبولوس المحقون.
    5. باستخدام مجهر مناظير تشريح مع تكبير 4X، حقن البيض في مرحلة خلية واحدة عن طريق المرور عبر المشيمة وصفار، وإسقاط الحل مباشرة داخل الخلية.
    6. جمع الأجنة المحقونة في طبق بيتري 100 ملم مع مياه الجنين، وتسمية الطبق واحتضانها في 28 درجة مئوية.
    7. تأكد من أن درجة حرارة الحاضنة مستقرة مع مرور الوقت ، حيث أن معدل نمو الأجنة حساس للحرارة. على سبيل المثال، سيتم تسريع النمو في درجات حرارة أعلى ومرحلة النمو أمر بالغ الأهمية لتقييم النمط الظاهري24بشكل صحيح.
    8. تحقق من جودة البويضات 6-8 ساعة بعد الحقن وإزالة الأجنة الميتة وغير المخصبة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.
    9. في صباح اليوم التالي، عد وإزالة الأجنة الميتة في كل طبق مع ماصة باستور البلاستيك.

2. تحليل السلوك

  1. تحليل النشاط العالمي عند 28 حصان:
    1. إجراء الاختبار بعد ظهر اليوم التالي للفحص المجهري (28 حصان)، مع التأكد من أن الوقت من اليوم الذي يتم فيه إجراء الاختبار متسق على التجارب لإجراء تحليل إحصائي صحيح مع سرعة نمو الأجنة.
    2. املأ طبق 35 مم (طبق اختبار) بماء الجنين واتركه يسخن في الحاضنة (28 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل بدء الاختبار.
    3. ضع شبكة شبكية بلاستيكية (1.2x1.2 مم) مقطعة إلى الحجم ، في الجزء السفلي من طبق الاختبار.
    4. اطلب من مجرب آخر أن يقوم بترتيب اختبار الأجنة عشوائيا وإخفاء أسماء الحالات التي سيتم اختبارها.
    5. تأكد من أن معدل الوفيات لا يتغير بين الحالات وبالمقارنة مع الأجنة غير المحقونة لضمان خصوصية النمط الظاهري. لا تتجاوز نسبة الأجنة الميتة في جميع الحالات 10-13٪18.
    6. ضع 10-12 جنينا لا يزال داخل المشيمة على الشبكة البلاستيكية باستخدام ماصة باستور بلاستيكية. ملء طبق الاختبار مع ما يكفي من مياه الجنين للحفاظ على الأجنة المغمورة ولكن ليس عائمة. إذا لزم الأمر، قم بتحريك الأجنة بعناية باستخدام طرف بلاستيكي لوضعها على الشبكة.
    7. باستخدام كاميرا فيديو (انظر جدول المواد)تعلق على المجهر تشريح، وتسجيل نشاط اللف العفوي لفترة محددة من الزمن (10-20 دقيقة أشرطة الفيديو الطويلة وعادة ما تكون كافية للحصول على عينات تمثيلية من رشقات نارية النشاط للقياس الكمي)
    8. أعد الأجنة إلى طبقها الخاص وأعيدها إلى الحاضنة. كرر التجربة مع أكبر عدد ممكن من الأجنة حسب الحاجة لكل حالة (كما يحددها تحليل الطاقة بنسبة 90٪).
    9. لتحليل الحركة التلقائية الكلية، استخدم نظام ZebraLab (انظر جدول المواد). باستخدام وحدة القياس الكمي للنشاط، قم بتحميل الفيديو المسجل وتصميم ساحات التتبع حول كل جنين حسب الاقتضاء. تعيين عتبة التجميد والفجر إلى 10 و 50، على التوالي.
    10. قم بتشغيل تحليل الفيديو التلقائي، الذي يحدد النشاط الإجمالي داخل كل من الساحات المحددة، ثم استرجع مجموعة البيانات كجداول بيانات وأجر التحليل باستخدام برنامج تحليل البيانات.
  2. اللمس أثار الهروب استجابة (TEER) في 48 حصان:
    1. إجراء الاختبار في الصباح بعد يومين من الحقن (48 ساعة بعد الإخصاب).
    2. على الأقل 2 ساعة قبل الاختبار، dechorionate الأجنة باستخدام ملقط ناعم. تأكد من أن الوقت من اليوم ل dechorionation واختبار السلوك متناسقة على التجارب.
    3. ملء طبق 130 ملم (طبق اختبار) مع ماء الجنين والسماح لها بالإحماء في الحاضنة (28 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل بدء الاختبار.
    4. عد وإزالة اليرقات الميتة والمتشوهة بشكل مورفولوجي. سجل الأرقام لكل شرط.
    5. يكون آخر المجرب عشوائية النظام وتدوين أسماء الشروط التي سيتم اختبارها.
    6. قم بتركيب الكاميرا (انظر جدول المواد)فوق طبق الاختبار للتأكد من أن طبق الاختبار بأكمله داخل مجال الرؤية. وضع مسطرة داخل مجال الرؤية يوفر معايرة داخلية للمسافة.
    7. مع ماصة باستور بلاستيكية ، ضع جنينا في وسط طبق الاختبار وابدأ التسجيل باستخدام معدل اكتساب 30 إطارا في الثانية.
    8. مع طرف بلاستيكي ناعم، المس ذيل الجنين قليلا بحركة نفض الغبار.
    9. أوقف التسجيل عندما تنهي اليرقة حركتها.
    10. إزالة الجنين من طبق الاختبار ووضعه في طبق جديد مملوء بماء الجنين. كرر الاختبار مع أكبر عدد ممكن من الأجنة حسب الحاجة لكل حالة (كما يحددها تحليل الطاقة بنسبة 90٪).
    11. أعد الأجنة إلى طبقها الأصلي وأعيدها إلى الحاضنة.
    12. لتحليل معلمات سلوك السباحة، قم بتحميل الفيديو المسجل إلى برنامج ImageJ للتحليل. تحميل وتثبيت دليل تتبع البرنامج المساعد من ImageJ (انظر جدول المواد). إطلاق البرنامج المساعد عن طريق اختيار أدوات | | المكون الإضافي التتبع اليدوي في القائمة.
    13. في إطار الحوار، أدخل المقياس المعايرة للصورة. يؤدي تضمين مسطرة في حقل الكاميرا إلى تسهيل تحويل سم إلى بكسل.
    14. حدد إضافة مسار وابدأ تتبع المسار بالنقر على صورة يرقة الحمار الوحشي في الإطار الأول. تقدم الإطارات تلقائيا مع كل نقطة التي يتم إضافتها إلى التتبع.
    15. استمر في تتبع الحركة حتى نهاية حلقة السباحة.
    16. حدد مسار النهاية في نافذة التتبع، واسترجاع إحداثيات X-Y وحساب المسافة الإجمالية والسرعة وزاوية الدوران.

3. التحليل الكهروفيزيولوجي

  1. الكاشف وإعداد الأدوات:
    1. إعداد 1٪ agarose في مياه الجنين (انظر القسم 1.1.4). Aliquot agarose السائل في أنابيب الطرد المركزي الدقيق والحفاظ على هذه على كتلة التدفئة في 42 درجة مئوية لمنع agarose من تصلب.
    2. إعداد حل التسجيل (في mmol / L): NaCl 134، KCl 2.9، CaCl2 2.1، MgCl2 1.2، الجلوكوز 10، HEPES 10، pH 7.8.
    3. سحب الأنابيب الزجاجية البوروسيليكات مع فتحة طرف من 1.5-2 ميكرومتر (5-6 مم2·kg·s−3· مقاومة−2) غير مصقولة.
  2. إعداد يرقات حمار وحشي لعلم الفيزيولوجيا الكهربية:
    1. ضع السمك في طبق بيتري ذو القاع الزجاجي (انظر جدول المواد)وأزل الوسائط الزائدة خارج الخلية من أجل ضمان إحضار السمكة إلى أقرب مكان ممكن من زلة الغطاء.
    2. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، أضف أغاروز السائل الدافئ على اليرقة وحولها. استخدام فقط ما يكفي من الآجروز لتغطية الأسماك. في حين أن agarose يتصلب، واستخدام ملقط غرامة لتوجيه الأسماك في وضع مستقيم، الجانب البطني إلى أسفل، في وسط الطبق.
    3. أضف 2 مل من محلول التسجيل الذي يحتوي على بروميد بانكورونيوم 10 ميكرومتر (انظر جدول المواد)لمنع انتقال العدوى العصبية العضلية. إضافة المشلولين ضرورية للقضاء على القطع الأثرية بسبب الحركات الصغيرة أثناء التسجيلات.
  3. التسجيل الكهربي
    1. ملء micropipette مع تسجيل الحل.
    2. مع مكبر للصوت المشبك التصحيح (انظر جدول المواد)في تكوين المشبك الجهد، وقياس مقاومة القطب في الحمام لتأكيد قيمته الصحيحة.
    3. باستخدام هدف 20x ، ضع رأس اليرقة في مجال الرؤية المركزي وخفض micropipette للوصول إلى موضع التسجيل في الدماغ ، داخل استئصال البصري.
    4. قم بتبديل مكبر الصوت المشبك التصحيحي إلى المشبك الحالي وإصلاح التيار الحامل إلى 0 mA.
    5. وباستخدام فلتر منخفض التمرير قدره كيلوهرتز واحد، ومعدل احتياز قدره كيلوهرتز واحد، ومكاسب رقمية تبلغ 10، سجل نشاطا عفويا لمدة 60 دقيقة لتحديد مستويات النشاط الأساسي.
    6. بعد 1 ساعة من تسجيل خط الأساس، إضافة 200 ميكرولتر pentylenetetrazol (PTZ، انظر جدول المواد) حل 300 مليمول / لتر إلى الحمام لتركيز النهائي من 20 ملليمول / L PTZ.
    7. تسجيل نشاط الخلايا العصبية في PTZ لمدة 120 دقيقة أخرى.
  4. تحديد حدث إزالة الاستقطاب
    1. أحداث التسجيل الميداني لها ديناميات بطيئة جدا (ترددات الاهتمام في نطاق 0.005-0.2 s-1). لذلك، تصفية الإشارة مع تمريرة منخفضة (بتروورث 5th ترتيب LPF في 100 s-1)من أجل تجنب الاسم المستعار. قم بدمج بيانات الجهد المسجلة من معدل إطار الامتلاك (في هذه الحالة، 1 ks-1)وصولا إلى 250s-1 (RAW SIGNAL).
    2. لتحديد الطوابع الزمنية لكل حدث إزالة الاستقطاب، استخدم إشارة الكشف، وهي نسخة عالية التمرير تمت تصفيتها من الإشارة المسجلة (بتروورث 1 st ترتيب HPF في 0.01 s-1).
    3. وبإزالة مكونات التردد المنخفض، يمكن إجراء الكشف عن أحداث إزالة الاستقطاب باستخدام طريقة بسيطة للتعتبات. استخدم عتبة ثابتة لإزالة الضوضاء والكشف عن الأحداث (تم استخدام 0.3 mV لهذه الدراسة).
    4. تميز حدث إزالة الاستقطاب بسلسلة من العتبات التي تحدث في فترات زمنية أصغر من 4 s. حساب بداية ونهاية حدث إزالة الاستقطاب كما هو محدد من التسلسلات المتتالية لعبور العتبة. يمكن تجاهل الأحداث التي تكون أقصر من 40 مللي ثانية كضوضاء.
    5. حساب سعة الأحداث في غير المصفاة (RAW SIGNAL) لإزالة الأخطاء بسبب تأثير تصفية تمرير منخفضة على ذروة الحدث. حدد موجة إزالة الاستقطاب من الإشارة الخام باستخدام الطوابع الزمنية المحددة في الإشارة المصفاة. قياس السعة على أنها الفرق بين القيم القصوى والحد الأدنى للموج المحدد من الإشارة الخام.
      ملاحظة: يتم توفير ملفات البرنامج النصي لتنفيذ الخطوة 3.4 — تحديد حدث إزالة الاستقطاب — والحصول على الشكل 1 كملف تكميلي مرفق بهذه المقالة.

النتائج

يظهر الشكل 1 آثار الجهد التمثيلي لتسجيلات حقل يرقة حمار وحشي 4-6 dpf خارج الخلية في حالة حالتين وراثيتين: التحكم في عدم التطابق وDEDDC5 الضربة القاضية. في فترة الأساس للتسجيل، يظهر DEPDC5 الضربة القاضية حدوث أعلى للأحداث العفوية، في حين أن عنصر التحكم عدم التطابق يعرض تقلبات قليلة جدا. هذه الأنماط نشاط ممثلة للزيادة الكبيرة في نشاط الخلايا العصبية بسبب فقدان وظيفة DEPDC5, كما أبلغنا سابقا18. بعد تطبيق PTZ، يظهر كل من التحكم بعدم التطابق وD DEPDC5 عدد متزايد من أحداث إزالة الاستقطاب. خلال الفترة الأولى بعد تطبيق PTZ (10 - 60 دقيقة) ، لوحظ معدل 0.8 حدث لكل دقيقة في كل من التحكم في عدم التطابق و DEPDC5 بالضربة القاضية ، حيث تكون غالبية الأحداث ذات سعة عالية (>1 mV). خلال فترة الاستجابة الأخيرة (60 - 120 دقيقة بعد تطبيق PTZ) ، يرتفع معدل أحداث إزالة الاستقطاب إلى حوالي حدث واحد في الدقيقة ، وغالبية الأحداث منخفضة السعة (≤1 mV).

figure-results-1021
الشكل 1: مثال على آثار التسجيلات الميدانية في دماغ يرقات حمار وحشي. (A) نظرة عامة على تسجيل 180 دقيقة ليرقات التحكم في عدم التطابق وهدم DEPDC5. أولا، تم تسجيل النشاط الأساسي التلقائي، ثم تم تطبيق PTZ في الحمام (شريط أحمر). (ب) الفترة المحيطة بالحوافز الزمنية المدرجات التكرارية لأحداث إزالة الاستقطاب للسيطرة على عدم التطابق و DEPDC5 الضربة القاضية. وصنفت الأحداث على أنها ذات سعة عالية (>1 mV - أزرق) واتساع منخفض (≤1 mV - أسود). (C-E) مثال آثار فترات مختلفة من التسجيل: (ج) النشاط العفوي، (D) أحداث السعة العالية خلال الفترة الأولى بعد تطبيق PTZ،(ه) أحداث السعة المنخفضة خلال الفترة الأخيرة بعد تطبيق PTZ. لاحظ أن يتم توفير ملفات البرنامج النصي للحصول على هذه الأرقام كملف تكميلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: ملفات البرنامج النصي للخطوة 3.4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الصرع هو مرض عصبي معقد ، ويضم مجموعة واسعة من الأمراض التي بدأت توضح مع ظهور تقنيات التسلسل الجيني25،26،27. نماذج الحيوانات متعددة الاستخدامات ضرورية لاستراتيجية تحويلية فعالة من شأنها أن تسفر عن كل من رؤى في الآليات المرضية للصرع المرتبطة وراثيا، فضلا عن العلاجات المستهدفة لأشكال متميزة من هذا الشرط. وقد كانت نماذج حمار وحشي فعالة جدا في استنساخ الميزات الرئيسية للصرع وتوفير قراءات موثوق بها لفحص الأدوية المضادة للصرع5,28. يمكن الكشف عن النوبات العفوية في حمار وحشي معدل وراثيا15،29،30،31 والتحليل العصبي الفسيولوجي في هذه النماذج28 أكد الأساس العصبي للسلوك الشبيه بالصرع32،33. يرقات حمار وحشي صغيرة الحجم قابلة للشاشات الكيميائية في شكل 96 بئرا باستخدام الكشف الآلي عن السلوك البسيط ، مثل السباحة التلقائية ، والتي تسمح بالكشف السريع عن العلاجات المحتملة.

يتم الحصول على نموذج DEPDC5 الضربة القاضية المعروضة هنا عن طريق حقن AMO في جنين حمار وحشي لمنع التعبير الجيني أثناء التنمية. يقدم هذا النموذج العديد من السمات الظاهرية الأساسية خلال نقاط زمنية مختلفة لتطور اليرقات ، والتي يمكن استخدامها كمؤشرات لكفاءة العلاج خلال بروتوكول الفحص الكيميائي أو الوراثي. إن الضربة القاضية للجين بوساطة AMO هي تقنية قوية ، تظهر مزايا على نماذج المضبوطات الناجمة عن المواد الكيميائية ، لأنها تستهدف على وجه التحديد التعبير عن جين الاهتمام ، مما يسمح بتحديد الآليات المسببة للأمراض الكامنة الناجمة عن طفرة جينية. يمكن للحث الكيميائي ، والتي هي مع ذلك أدوات قوية لفحص الأدوية ، أن تعمل من خلال مسارات خلوية متعددة قد لا تكون دائما ذات صلة بالطفرة الوراثية قيد الدراسة. في حين أن حقن AMO هو في حد ذاته تقنية بسيطة عندما يتقن من قبل المجرب ، فإنه يقدم أيضا عددا من القيود. يجب إجراء الحقن في جنين مرحلة الخلية الواحدة. في أيدينا، والحقن في مراحل لاحقة زادت كثيرا من التباين في النمط الظاهري. وهذا يحد من الوقت المتاح للحقن; لذلك، استراتيجية لتوليد البيض للحقن في تسلسل زمني مفيد. نحن نستخدم بشكل روتيني 4-5 الصلبان التي نفتحها على فترات 15-20 دقيقة، مما يسمح بحقن مخلب واحد قبل الحصول على واحد المقبل. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر لتقييم النمط الظاهري في نفس الوقت بين التجارب المختلفة ، حيث تتطور السلوكيات النمطية بسرعة خلال الأيام الأولى من التطور. كما يجب التحكم بعناية في حجم وتركيز الأجسام غير المشبعة بالأجسام الغريبة، لأن السمية العامة الناجمة عن حقن كميات مفرطة ستخفي النمط الظاهري المحدد. الضوابط المختلفة المقدمة في المقدمة ضرورية لتحديد جرعة الحقن الصحيحة والنمط الظاهري المقابل.

التسجيلات الميدانية للدماغ حمار وحشي اليرقات هي أداة مفيدة للتحقيق في الآثار الضارة للطفرات الوراثية المشاركة في اضطرابات الدماغ المختلفة على نشاط الخلايا العصبية العالمية34. أحداث إزالة الاستقطاب ينظر في ظل هذه الظروف التجريبية هي طريقة راسخة لتقييم الآثار الكهربية للعقاقير في ظروف الصرع المختلفة15,35. غير أن تقييم هذه الآثار قد تم في معظمه نوعيا وليس كميا، ووجود مراقب ذاتي كطرف فاعل في التحليل. هنا، نقوم بتطوير استراتيجية الكشف التلقائي التي يمكن أن تحدد موضوعيا معدل إزالة الاستقطاب، واتساعها ومدتها، ويمكن تقييم التقدم المحرز في هذه المعلمات عبر الزمن، أو مع تدخلات وراثية أو دوائية مختلفة.

تظهر النتائج التمثيلية المعروضة هنا النشاط الميداني المتوقع للنموذج الوراثي المهدم DEPDC5 بالمقارنة مع التحكم في عدم التطابق في سمك الحمار الوحشي 4-6 dpf ، قبل وبعد تطبيق PTZ لإدخال نشاط كهرومغناطيغرافي يشبه الصرع. سابقا، لقد أظهرنا زيادة كبيرة في النشاط القاعدي للشرط DEPDC5 ضربة قاضية18. هنا، نظهر أن استجابة هذين الشرطين لPTZ، وهو محفز نشاط الصرع الكيميائي، له مسار مماثل في الوقت المناسب، بدءا من فترة من التردد المنخفض نسبيا، وارتفاع السعة أحداث إزالة الاستقطاب والاستمرار مع فترة من ارتفاع التردد، وانخفاض السعة أحداث إزالة الاستقطاب. أحداث تسجيل الحقل لها ديناميات بطيئة (ترددات الاهتمام في نطاق 0.005-0.2ثانية -1)،وبالتالي يتم استخدام كل من مرشحات تمرير منخفضة وعالية تمرير في هذا البروتوكول لعزل الأحداث ذات الاهتمام. بعد القضاء على الضوضاء منخفضة التردد ، يتم إجراء الكشف عن أحداث إزالة الاستقطاب باستخدام عتبة بسيطة. وبما أن إحصاءات الإشارة تتأثر كثيرا بوجود أحداث إزالة الاستقطاب، لم نتمكن من استخدام الانحراف المعياري للإشارة الإجمالية لتحديد هذه العتبة. وكان التغير في قيمة الانحراف المعياري عبر مجموعات البيانات أكبر من مستويات الضوضاء التي لوحظت عند التسجيل. لذلك، بعد الفحص البصري لللآثار، استخدمنا قيمة ثابتة من عتبة 0.3 mV، من أجل تجنب التحيز الناجم عن مستويات مختلفة من نشاط إزالة الاستقطاب.

يوفر البروتوكول الموصوف طريقة موحدة وبسيطة لتقييم السلوك الحركي والنشاط الميداني العصبي ، عبر تسجيل جهد المشبك الحالي خارج الخلية إلى جانب الكشف التلقائي عن أحداث إزالة الاستقطاب في الصفت البصري ، لتوصيف الأنماط الظاهرية الشبيهة بالصرع في نماذج حمار وحشي.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر موظفي منصة الفيزيولوجيا الكهربية ICM حيث تم إجراء تجارب الفيزيولوجيا العصبية. كما نشكر أنكا ماريان على المساعدة التقنية. SC كان مدعوما بمنحة الترامبولين #21488. تم دعم EK من قبل منحة AFM # 18469 ومنحة ERC الموحدة (ALS-Networks). تم دعم HC من قبل جوائز الدكتوراه من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (PLP20141031462) و ARSLA. وبالنسبة إلى كل من AD وRM، تم دعم هذا العمل بثلاث منح من الهيئة الوطنية الرومانية للبحث العلمي والابتكار، CNCS-UEFISCDI (أرقام المشروع PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010، PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007، و COFUND-NEURON-NMDAR-PSY)، وهي منحة من برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي - اتفاقية منحة رقم 668863-SyBil-AA، ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية NSF-IOS-1656830 بتمويل من حكومة الولايات المتحدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-Aldrich, FranceA9539
Aquarium salt Instant Ocean, Blacksburg, VASS15-10
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentsBF100-50-10OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm
CaCl2Sigma-Aldrich, FranceC1016
Depdc5-atg antisense morpholinoGeneTools, OR, USAN/Asequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ 
Depdc5-mis antisense morpholinoGeneTools, OR, USAN/Asequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ 
Depdc5-splice antisense morpholinoGeneTools, OR, USAN/Asequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’
DigitizerMolecular Devices, CA, USADigidata 1550
Fast Green DyeSigma-Aldrich, FranceF7258Stock solution of 0.2%
Glass-bottom petri dishesIbidi, Germany81218
GlucoseSigma-Aldrich, France68270
Grasshopper 2 cameraFLIR, BC, CanadaGRAS-03K2M-Cformerly Point Grey Research
HEPESSigma-Aldrich, FranceH3375
Human wild-type DEPDC5 cDNADharmacon, FranceNM_001242897.1 Accession: BC144291 Clone ID 905
ImageJ softwareNIH, USAN/A
KClSigma-Aldrich, FranceP9333 
Matlab softwareMathWorks, MA, USAN/A
MgCl2Sigma-Aldrich, FranceM2670
NaClSigma-Aldrich, FranceS7653 
NaOHSigma-Aldrich, France71687
Pancuronium bromide Alomone LabsP-130Stock solution of 60 mM in water
ParafilmSigma-Aldrich, FranceP7793
Patch clamp amplifierMolecular Devices, CA, USAMultiClamp 700BComputer-controled patch clamp amplifier
pClamp10 acquisition softwareMolecular DevicesN/A
Pentylenetetrazol (PTZ)Sigma-Aldrich, FranceP6500Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution)
Pipette pullerNarishige, JapanPC-10
Pneumatic PicoPump WPI, FrancePV 820
Sylgard 184 kitSigma-Aldrich Intl.761036
Transfer plastic pipettesSigma-Aldrich, FranceZ350605
ZebralabViewpoint, FranceN/A

References

  1. Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish. Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).
  2. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The Power of Zebrafish in personalised medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).
  3. Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. , (2005).
  4. Cunliffe, V. T. Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  5. Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models. Progress in Brain Research. , (2016).
  6. Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome. Brain. , (2017).
  7. Orellana-Paucar, A. M., et al. Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy. PLoS ONE. , (2013).
  8. Baxendale, S., et al. Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures. Disease Models & Mechanisms. , (2012).
  9. Bar-Peled, L., et al. A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).
  10. Ishida, S., et al. Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies. Nature Genetics. , (2013).
  11. Dibbens, L. M., et al. Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci. Nature Genetics. , (2013).
  12. Baulac, S., Weckhuysen, S. . DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).
  13. Picard, F., et al. DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology. , (2014).
  14. Teng, Y., et al. Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Human Molecular Genetics. , (2010).
  15. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. , (2013).
  16. Suls, A., et al. De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome. American Journal of Human Genetics. , (2013).
  17. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS ONE. , (2016).
  18. de Calbiac, H., et al. DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish. Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).
  19. Panchaud, N., Péli-Gulli, M. P., De Virgilio, C. Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1. Science Signaling. , (2013).
  20. Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Design, Development and Therapy. , (2017).
  21. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. , (2015).
  22. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. , (2015).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. , (2017).
  24. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).
  25. Møller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).
  26. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. , (2013).
  27. Dunn, P., et al. Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes. Frontiers in Genetics. , (2018).
  28. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions. Nature Neuroscience. , (2015).
  29. Zhang, Y., et al. Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine. PLoS ONE. , (2015).
  30. Swaminathan, A., et al. Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development. Current Biology. , (2018).
  31. Samarut, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. γ-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment. Epilepsia. , 2061-2074 (2018).
  32. Turrini, L., et al. Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish. Scientific Reports. , (2017).
  33. Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures. PLoS Computational Biology. , (2018).
  34. Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2013).
  35. Afrikanova, T., et al. Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs. PLoS ONE. , (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176 DEPDC5 mTOR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved