Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا الأسلوب يوفر وسيله للزوجين optogenetics والمشفرة وراثيا مجسات الكالسيوم إلى مستويات الكالسيوم القاعدية صوره الأساس والتغيرات في العابرين الكالسيوم أثارت في عضلات الجسم الجدار من الكائن الحي النموذجي c. اليجنتس.

Abstract

يوفر نموذج الكائن الحي c. اليجانقاف نظاما ممتازا لأداء التصوير بالكالسيوم في الجسم. وتسمح هيئته الشفافة وقدرته علي التلاعب الوراثي بالتعبير المستهدف لأجهزه استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا. يحدد هذا البروتوكول استخدام أجهزه الاستشعار هذه لتصوير ديناميات الكالسيوم في الخلايا المستهدفة ، وعلي وجه التحديد عضلات جدار الجسم في الديدان. من خلال الاستفادة من التعبير المشترك لل بريسينابتيك تشانيلروبوبسين, تحفيز الإفراج عن استيل من الخلايا العصبية الحركية المثيرة يمكن ان يكون مستحثا باستخدام نبضات الضوء الأزرق, مما ادي إلى الاستقطاب العضلات والتغييرات القابلة للتكرار في الكالسيوم سيتوبلازمي مستويات. يتم مناقشه اثنين من تقنيات التجميد دوده مع مستويات متفاوتة من الصعوبة. وتبين المقارنة بين هذه التقنيات ان كلا النهجين يحافظان علي فسيولوجيا التقاطع العصبي العضلي ويسمح بالكمية القابلة للتكرار لعابري الكالسيوم. عن طريق الاقتران optogenetics والتصوير الوظيفي الكالسيوم ، ويمكن تقييم التغييرات في التعامل مع الكالسيوم بوستسينابتيك والتوازن في مجموعه متنوعة من الخلفيات متحولة. البيانات المقدمة بالتحقق من صحة كل من تقنيات التعبئة ويفحص علي وجه التحديد ادوار ساركو سي (اندو) بلازمي شبكي الكالسيوم ATPase وقناه البوتاسيوم BK تنشيط الكالسيوم في الجسم جدار العضلات تنظيم الكالسيوم.

Introduction

تقدم هذه الورقة طرقا لتصوير الكالسيوم في الجسم باستخدام عضلات جدار الهيكل c. التي تستخدم تحفيز الخلايا العصبية أوبتوجينيتيك. الاقتران العضلات التي أعرب عنها وراثيا المشفرة مؤشر الكالسيوم (جيكط) مع الضوء الأزرق أثارت الاستقطاب العصبية ويوفر نظاما لمراقبه بوضوح العابرين الكالسيوم التي أثيرت بعد المتشابك. هذا يتجنب استخدام التحفيز الكهربائي, السماح للتحليل غير الغازية من المسوخ التي تؤثر علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك.

واحد-فلوكوفيري جيكسيس ، مثل gcamp ، يستخدم جزيء بروتين فلوري واحد تنصهر في مجال M13 من سلسله الضوء ميوسين كيناز في نهايته N-الطرفية و كالموديولين (CaM) في C-المحطة. علي الكالسيوم ملزمه ، والمجال كام ، والتي لديها تقارب عاليه للكالسيوم ، يخضع لتغيير المطابقة يحفز تغيير المطابقة اللاحقة في البروتين الفلورسنت مما يؤدي إلى زيادة في كثافة مضان1. ومتحمس GCaMP مضان في 488 نانومتر ، مما يجعلها غير صالحه لاستخدامها بالتزامن مع تشانيلروببسين ، الذي يحتوي علي الطول الموجي الاثاره مماثله من 473 نانومتر. التالي ، من أجل القياسات الكالسيوم زوجين مع تحفيز تشانيلروببسين ، البروتين الفلوري الأخضر من GCaMP يحتاج إلى استبداله ببروتين فلوري احمر ، mRuby (ركامب). باستخدام العضلات وأعرب RCaMP, في تركيبه مع التعبير العصبية الحركية الكوليني من تشانيلروبيبسين, يسمح الدراسات في تقاطع العصبية العضلية (NMJ) مع الاستخدام المتزامن لoptogenetics والتصوير الوظيفي داخل نفس الحيوانية 2-

استخدام تشانيلروبوبسين يتجاوز الحاجة إلى التحفيز الكهربائي لتشويه الوصلات العصبية العضلية من c. اليجانيس، والتي يمكن ان تتحقق الا في الاستعدادات تشريح ، مما يجعل هذه التقنية علي حد سواء أسهل لتوظيف وأكثر دقه عند استهداف انسجه معينه. علي سبيل المثال, وقد استخدمت في السابق تشانيلروببسين في c. اليجنس لتنشيط الخلايا العصبية المحددة بشكل عكسي, مما يؤدي إلى تنشيط قويه من الخلايا العصبية مثير أو المثبطة3,4. كما ان استخدام الاستقطاب المحفز للضوء يلتف أيضا علي مساله تلف الخلايا العصبية بسبب التحفيز الكهربائي المباشر. وهذا يوفر فرصه لدراسة اثار العديد من بروتوكولات التحفيز المختلفة, بما في ذلك المحفزات المستمرة والمتكررة, علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك4.

ان الطبيعة الشفافة لل c. اليجايليس تجعله مثاليا للتحليل الوظيفي للتصوير الفلوري. ومع ذلك, عند تحفيز الخلايا العصبية المثيرة استيل في NMJ, ومن المتوقع الحيوانية للرد مع انكماش العضلات الفورية4, مما يجعل من تجميد الديدان الحرجة في تصور تغيرات الكالسيوم منفصلة. تقليديا ، وقد استخدمت وكلاء الدوائية لشل الماشية. واحد مثل هذه المخدرات المستخدمة هو levamisole, وهو اتروبين مستقبلات استيل الكولين5,6,7. منذ الليفاميزول يؤدي إلى التنشيط المستمر لنوع فرعي من مستقبلات العضلات مثير, هذا الكاشف غير مناسب لدراسة ديناميات الكالسيوم العضلات. العمل ليفيسيزول يدفع الاستقطاب بوستسينابتيك ، ورفع الكالسيوم عصاري خلوي ، والملاحظات انسداد بعد التحفيز بريسينابتيك. لتجنب استخدام الادويه المشلولة ، قمنا بفحص طريقتين بديلتين لتعبئة c. اليجايليس. تم لصقها الحيوانية اما أسفل ومن ثم تشريح مفتوحة لفضح عضلات الجسم الجدار ، علي غرار القائمة c. اليجانقاف nmj الكهربائية الطريقة8، أو استخدمت نانوبيادس لشل الكائنات السليمة9. سمح كلا الإجراءات للقياسات استنساخه من يستريح وأثار العضلات الكالسيوم العابرين التي كانت قابله للقياس بسهوله.

الطرق في هذه الورقة يمكن استخدامها لقياس مستويات الكالسيوم القاعدية السيتووليك والعابرين في خلايا العضلات الجدار الجسم بوستمتشابك في c. الايليسين. وترد أمثله للبيانات التي تستخدم التقنيتين المختلفتين للتعبئة. كلا التقنيتين الاستفادة من optogenetics لتشويه الخلايا العضلية دون استخدام التحفيز الكهربائي. وتبين هذه الامثله جدوى هذه الطريقة في تقييم الطفرات التي تؤثر علي معالجه الكالسيوم بعد المتشابك في الديدان وتشير إلى إيجابيات وسلبيات النهجين التجميد.

Protocol

1. الاعداد المجهر

  1. استخدام المجهر المركب مع قدرات مضان. لهذه الدراسة ، تم جمع البيانات علي المجهر تستقيم (جدول المواد) مزوده المصابيح لأثاره.
  2. من أجل تصور بشكل صحيح التغيرات الفلورية في عضلات جدار الجسم ، واستخدام هدف التكبير عاليه.
    1. للتحضيرات تشريح ، استخدام 60x NA 1.0المياه الغمر الهدف (جدول المواد).
    2. للتحضيرات باستخدام نانوبيادس ، استخدام 60x NA 1.4 النفط الغمرالهدف (جدول المواد). هذا التكبير يضمن دقه كافيه من العضلات علي جهاز استشعار الكاميرا.
  3. استخدام كاميرا عاليه الحساسية تعلق علي المجهر للتقاط الصور بمعدل الإطار عاليه من أجل تتبع التغيرات السريعة في مستويات الكالسيوم. لهذه الدراسة ، صوره مع نظام sCMOS (جدول المواد) قادره علي التصوير الإطار الكامل في 100 هرتز ، والأوقات المرتفعة للإشارات Ca2 + يمكن ان تكون سريعة مثل عشرات من مللي ثانيه.
  4. السيطرة علي اكتساب الكاميرا والاثاره مضان الصمام مع برنامج المدير الصغير الذي يعمل في ImageJ10 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  5. استخدام البرنامج المساعد منصة الكترونيه مفتوحة المصدر ، والذي يربط الخارجية المفتوحة المصدر المجلس متحكم (جدول المواد) ، لأداره نبضات التوقيت الخارجي للسيطرة علي الاثاره مضان.
    ملاحظه: تتوفر عموميات رقميه من الدبابيس الرقمية 8 إلى 13 توفير بت الإخراج 0 إلى 5. ويمكن معالجه هذه القيم باعتبارها القيمة الاساسيه 2 من 1 ، 10 ، 100 ، الخ. يتم الاشاره إلى إعدادات المنفذ التسلسلي في الجدول 1 وتتوفر من موقع المدير المصغر (جدول المواد). البرامج الثابتة للمجلس متحكم متاحه بالمثل في هذا الموقع.
  6. للسيطرة علي منطق توقيت ، وتفعيل بروتوكول الاستحواذ الجزئي في البرنامج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    ملاحظه: هذا يبدا في وقت واحد مده اطار الكاميرا مسبقا وعدد الإطارات التي سيتم تنشيطها ، فضلا عن مصراع المنطقية والعنبر مسبقا LED لأثاره الفلورية. في هذه الحالة ، يتم التحكم في العنبر الصمام الحالة الصلبة التبديل بواسطة بت متحكم 1 الإخراج من خلال دبوس 9. الإطارات الكاميرا خارج TTL (لوحه الخلفي من 3 موصل) بتشغيل محفز. هذا بالبالضبط الأوقات تفعيل الضوء الأزرق الصمام لتفعيل تشانيلروبيبسين في وقت معين بعد تفعيل تسلسل التصوير.
  7. لتحفيز تشانيلروببسين مع الضوء الأزرق وسجل التغييرات RCaMP ، استخدم اثنين من المصابيح. تنشيط تشانيلروبوبسين مع LED مع ذروه الانبعاثات الموجي من 470 nm ومرشح ممر (455 إلى 490 nm) وتثير RCaMP مع LED مع ذروه الانبعاثات الطول الموجي من 594 نانومتر ومرشح ممر (570 إلى 600 nm).
  8. من أجل تنشيط في وقت واحد تشانيلروفوبسين والتقاط التغييرات في مستويات الفلورسنت RCaMP ، والمشاركة في أناره كل من المصابيح ونقل الضوء إلى نفس المسار البصري باستخدام الموحدة شعاع ديشروريك.
  9. التحكم في توقيت أضاءه LED مع مفاتيح الحالة الصلبة (جدول المواد) التي تسيطر عليها إشارات TTL (الحد الأقصى تصنيف بدوره في الوقت المحدد ، 1 مللي ثانيه ، بدوره قباله الوقت 0.3 ms: 0 إلى 90 ٪ بدوره علي وإيقاف الوقت من ال< 100 μs).
  10. تعيين كثافة LED مع إمدادات الطاقة الخطية منخفضه الضوضاء الحالية الخاضعةللرقابة (جدول المواد).
  11. لضمان التوقيت الدقيق للضوء الأزرق LED ، تنشيطه مباشره بواسطة نبض TTL إلى مرحل الحالة الصلبة من محفز. برنامج الضوء الأزرق بروتوكول التحفيز إلى محفز (جدول المواد) ، والذي يعمل بمثابه المؤقت دقيقه من بداية اكتساب الصورة إلى أضاءه LED الزرقاء. في هذه التجربة ، بدوره علي تحفيز الضوء الأزرق بعد 2 ثانيه من التقاط الفلورية RCaMP فقط واستخدام قطار من 5 ، 2 ms الضوء الأزرق البقول مع فواصل 50 ms interpulse لتنشيط تشانيلروبوبسين.
    ملاحظه: يمكن تعيين التاخير قبل نبضات الضوء الأزرق ، ومده نبضات الضوء الأزرق ، والوقت بين البقول ، وعدد البقول في القطار في هذه المرحلة ، وينبغي ان تعكس المعلمات المحددة للفائدة التجريبية.

2.c. اعداد العينات اليجس والحصول علي البيانات

  1. لتحفيز بصريا الخلايا العصبية بريسينابتيك, الحصول علي الحيوانية التعبير عن تشانيلروبوبسين في الخلايا العصبية اتروبين مثير, مدفوعا مع المنطقة المروج unc-17 , وأعرب عن rcamp في جميع عضلات جدار الجسم مدفوعا مع المروج ميو-3 المنطقة2.
    ملاحظه: ينصح فقط استخدام الكائنات مع الجينات المتكاملة ومستويات قويه من الفلورية كما التعبير متغير في أنواع الخلايا المقابلة قد تؤثر علي موثوقيه الحصول علي البيانات.
  2. جعل الأسهم العاملة من جميععبر الشبكية عن طريق تمييع مسحوق الشبكية (جدول المواد) في الايثانول لإنشاء تركيز النهائي من 100 mM وتخزين في-20 درجه مئوية. سيكون هذا المخزون العامل مستقرا لمده سنه واحده تقريبا.
  3. إنشاء مخزون من OP50 e. القولونية، نمت في وسائل الاعلام LB ، تستكمل مع جميعترانس الشبكية من الأسهم العاملة المحرز في الخطوة 2.2 ، في التركيز النهائي من 80 μM. سيعتمد الحجم المستخدم لمخزون الشبكية OP50 + علي عدد اللوحات اللازمة للتجربة.
  4. البذور الديدان الخيطية وسائل الاعلام النمو (NGM) لوحات مع ما يقرب من 300 μL من الأسهم OP50 + الشبكية والسماح لوحات لتجف بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  5. تنمو سلالات c. اليجان إلى العمر المطلوب في الظلام علي OP50 + لوحات ngm الشبكية في 20 ° c. لهذه التجربة ، استخدم الديدان البالغة.
    1. للتجربة باستخدام اعداد تشريح ، فقط استخدام الديدان البالغين البيض كما أداء تشريح علي الأصغر سنا ، والحيوانية الصغيرة هي صعبه للغاية. ترك الكائنات علي لوحات OP50-الشبكية لمده لا تقل عن 3 أيام لتنشيط تشانيلروبيبسين فعاله.
  6. في حاله استخدام الاعداد الذي تم تشريحه8،11 (الشكل 1ا) ، قم باجراء التفكيك في الاضاءه الخافتة.
    1. وضع الحيوانية في طبق تشريح مع قاعده المشبك المغلفة سيليكون التي تمتلئ 1 مم Ca2 + حل خارج الخلية تتالف من 150 mm كلوريد الصوديوم ، 5 ملم kcl ، 1 مم cacl2، 4 مم mgcl2، 10 ملم الجلوكوز ، 5 مم السكروز ، و 15 مم hepes (pH 7.3 ،-340 الوسم).
    2. الغراء أسفل الحيوانية باستخدام لاصق الجلد الموضعي السائل مع التلوين الأزرق علي طول الجانب الظهري من الدودة واجراء شق اهاب الجانبي علي طول الغراء/دوده واجهه باستخدام الابر الزجاجية.
    3. استخدمي ماصه الفم لمسح الأحشاء الداخلية من تجويف الدودة.
    4. الغراء أسفل رفرف اهاب من الحيوانية لفضح عضلات جدار الجسم الإنسي البطني للتصوير.
  7. في حاله استخدام الاعداد الخاص بالنانو (الشكل 1ب)
    1. جعل المنصهر 5 ٪ محلول اجنشا باستخدام ddH2O إلى حجم النهائي من 100 mL.
    2. باستخدام ماصه باستور ، ضع قطره من المحلول المصهور المنصهر علي شريحة زجاجيه وضع علي الفور شريحة زجاجيه ثانيه فوق الأعلى ، متعامدة مع الاولي ، باستخدام ضغط لطيف لإنشاء لوحه حتى اجثار. قم بازاله الشريحة العلوية قبل الاستخدام.
    3. أضافه ما يقرب من 4 μL من النانو البوليسترين (جدول المواد) إلى منتصف لوحه اجبرزت.
    4. في الضوء المنخفض ، اختر 4-6 c. الاناقه في محلول نانبياد ، والتاكد من عدم وضع الكائنات علي راس بعضها البعض ، ووضع بعناية علي القمه.
  8. ضع الشريحة المعدة أو طبق التشريح علي المجهر ، واعثر وركز علي الدودة باستخدام التكبير 10x وأضاءه الحقل الساطع الخافتة.
  9. التبديل إلى 60x التكبير والاثاره الفلورية RCaMP لتحديد العضلات جدار الجسم الذي هو الامامي إلى الفرج وفي المستوي البؤري الصحيح.
    ملاحظه: يتم تحديد العضلات الاماميه للفرج كما انها تعكس العضلات التي تحفز عاده في التجارب الكهربية.
  10. تغيير مسار الصورة من العدسة إلى الكاميرا عن طريق سحب التبديل والنقر المباشر داخل برنامج الحصول علي البيانات (جدول المواد).
    ملاحظه: تاكد من إيقاف تشغيل مسار تحفيز الضوء الأزرق عند هذه النقطة للتاكد من انه لا يتم تنشيط تشانيلروبيبسين قبل التقاط الصور.
  11. التركيز علي الصورة داخل البرمجيات الحصول علي البيانات باستخدام المجهر التركيز الدقيق.
  12. مره واحده في العضلات من الواضح في التركيز, إيقاف الصورة الحية عن طريق إلغاء النقر علي زر لايف .
  13. انقر فوق زر ROI في برنامج الحصول علي البيانات وإنشاء مربع حول العضلات التي تركز علي.
  14. علي المحفز ، قم بالتبديل علي مسار تحفيز الضوء الأزرق الذي تم برمجته مسبقا في الخطوة 1.10.
  15. انقر فوق اكتساب في برنامج التصوير للتقاط الصورة من خلال كاميرا CMOS. للقيام بذلك ، تعيين وقت التعرض ل 10 s مع إطارات 1,000 و 2x التسلق.

3-تحليل البيانات

  1. افتح ملف البيانات في برنامج التصوير (جدول المواد) ، وباستخدام أداه المضلع، الخطوط العريضة للعضلات الفائدة. هذا هو عائد الاستثمار.
  2. انتقل إلى الصورة | مداخن | المؤامرة Z-المحور الملف الشخصي وتصدير نقاط البيانات الناتجة في برنامج الجداول (جدول المواد). تقوم هذه الوظيفة بتحديد قيمه متوسط العائد علي الاستثمار مقابل النقطة الزمنيه.
  3. نقل العضلات العائد علي الاستثمار التي تم إنشاؤها باستخدام أداه المضلع خارج الحيوانية للحصول علي قياس مضان الخلفية بواسطة الخطوات المبينة في 3.2. تصدير البيانات الناتجة إلى مصنف جدول البيانات.
  4. في مصنف جدول البيانات ، اطرح القيم الفلورية الخلفية من قيم مضان العضلات في كل نقطه زمنيه. وهذا يوفر الخلفية طرح اشاره الفلورسنت.
  5. متوسط الخلفية طرح فلوري لأول 2 s من نقاط البيانات. وهذا سيعطي قياس الخط القاعدي ، F.
  6. استخدم قياس الخط القاعدي لحساب مستوي المضان المعياري في كل نقطه زمنيه. للقيام بذلك ، استخدم المعادلة (ΔF/F) + 1. ΔF يمثل (F (t)-F) ، حيث F (t) هو قياس مضان في اي نقطه زمنيه معينه و F هي القيمة الاساسيه. يتم أضافه + 1 كازاحه محور ص.
  7. كرر الخطوات 3.2-3.6 لكل صوره العضلات التي يتم تجميعها. استخدام خلايا عضلية واحده أو متعددة لكل صوره هو وفقا لتقدير الباحث. يمكن تحديد n من التجربة من خلال اجراء تحليل الطاقة.
  8. استخدم البيانات المعالجة من الخطوات 3.2-3.6 لاجراء تتبع للقيم الفلورية في برامج الرسوم البيانية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  9. من هذا التتبع ، وقياس حركيه عابره الكالسيوم ، مثل الارتفاع إلى وقت الذروة ونصف وقت الاضمحلال ، وذلك باستخدام الاداات المتوفرة في الرسوم البيانية البرمجيات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

النتائج

قيمت هذه التقنية التغيرات في المسوخ التي يعتقد انها تؤثر علي معالجه الكالسيوم أو الاستقطاب العضلي. وقد تم تصور مستويات الخط القاعدي والعابرات الفلورية وتم تقييم الكالسيوم السيتووليك وحركيه الكالسيوم داخل العضلات. ومن المهم ان تزرع الماشية علي الشبكية المتحولة لمده ثلا...

Discussion

جيكاس هي أداه قويه في البيولوجيا العصبية c. اليجس . وقد استخدمت الاعمال السابقة تقنيات تصوير الكالسيوم لفحص مجموعه واسعه من الوظائف في كل من الخلايا العصبية والعضلات ، بما في ذلك الاستجابات الحسية والسلوكية ، مع أساليب متنوعة من التحفيز. وقد استخدمت بعض الدراسات المحفزات الكيميائية ل...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفان الدكتور الكسندر غورسكهالك علي ZX1659 ، والمعسكر الذي يحتوي علي سلاله دوده ، والدكتور هونغكيون كيم لسلاله الدودة البطيءه-1 (eg142) ، والمشروع الوطني للموارد البيولوجية لسلاله الدودة sca-1 (tm5339) .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
all-trans retinalSigma-AldrichR2500Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LEDRCaMP illumination
Arduino UNOMouser782-A000066Controls fluorescence illumination
Blue LEDchannelrhodopsin illumination
BX51WI microscopeOlympusFixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supplyAmetekSorensonControls LED intensity
Igor ProWavemetricsWavemetrics.comGraphing software
ImageJNIHimagej.nih.govImage processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4OlympusWater immersion objective for dissected preparation
Master-8 StimulatorA.M.P.IMaster timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Managermicro-manager.orgControls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft ExcelMicrosoftSpreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camerapco.4.2High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4OlympusOil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheresPolysciences, Inc.00876-15For worm immobilization
solid state switchesSensata TechnologiesCrydom CMX100D6Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Richmond LabSY1627Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Richmond LabExcitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Gottschalk LabZX1659Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line

References

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
  3. Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  4. Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
  5. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
  6. Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
  9. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
  10. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
  11. Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
  12. Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
  13. Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
  14. Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
  15. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  16. Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
  17. Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
  18. Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
  19. Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
  20. Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
  21. Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
  22. Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
  23. Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
  24. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
  25. Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
  26. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
  27. Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
  28. Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 c rcamp optogenetics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved