In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Resumo

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

Resumo

O organismo modelo C. elegans fornece um sistema excelente para executar a imagem latente in vivo do cálcio. Seu corpo transparente e manipulabilidade genética permitem a expressão direcionada de sensores de cálcio geneticamente codificados. Este protocolo esboça o uso destes sensores para a imagem latente in vivo da dinâmica do cálcio em pilhas alvejadas, especificamente os músculos da parede do corpo dos sem-fins. Ao utilizar a coexpressão de channelrhodopsina pré-sináptica, a estimulação da liberação de acetilcolina de neurônios motores excitatórios pode ser induzida usando pulsos de luz azul, resultando em despolarização muscular e alterações reprodutíveis no cálcio citoplasmático Níveis. Duas técnicas de imobilização de vermes são discutidas com diferentes níveis de dificuldade. A comparação dessas técnicas demonstra que ambas as abordagens preservam a fisiologia da junção neuromuscular e permitem a quantificação reprodutível dos transientes de cálcio. Emparelhando a optogenética e a imagem latente funcional do cálcio, as mudanças na manipulação e na homeostase pós-sináptica do cálcio podem ser avaliadas em uma variedade de fundos do mutante. Os dados apresentados valiam ambas as técnicas da imobilização e examinam especificamente os papéis do C. elegans Sarco (endo) o ATPase reticular Plasmic do cálcio e o canal cálcio-ativado do potássio de BK na regulação do cálcio do músculo da parede do corpo.

Introdução

Este papel apresenta métodos para a imagem latente in vivo do cálcio de C. elegans músculos da parede do corpo usando a estimulação neuronal optogenética. Emparelhar um indicador de cálcio geneticamente codificado expresso (GECI) com luz azul desencadeou a despolarização neuronal e fornece um sistema para observar claramente os transientes pós-sinápticos evocados de cálcio. Isso evita o uso de estimulação elétrica, permitindo uma análise não invasiva de mutantes que afetam a dinâmica pós-sináptica do cálcio.

O GECIS do único-fluorophore, tal como gcamp, usa uma única molécula fluorescente da proteína fundida ao domínio M13 da quinase da corrente clara do miosina em seu fim do N-terminal e no calmodulina (CaM) no C-Terminus. Em cima do emperramento do cálcio, o domínio do CaM, que tem uma afinidade elevada para o cálcio, sofre uma mudança conformacional que induz uma mudança conformacional subseqüente na proteína fluorescente que conduz a um aumento na intensidade¹da fluorescência. GCaMP fluorescência está animado em 488 nm, tornando-se inadequado para ser usado em conjunto com channelrhodopsin, que tem um comprimento de onda de excitação semelhante de 473 nm. Assim, a fim de par de medições de cálcio com a estimulação da channelrhodopsina, a proteína verde fluorescente do GCaMP precisa ser substituída por uma proteína vermelha fluorescente, mRuby (RCaMP). Usando o músculo expressado rcamp, em combinação com a expressão colinérgicos do neurônio do motor do channelrhodopsin, permite estudos na junção neuromuscular do sem-fim (nmj) com uso simultâneo do optogenetics e da imagem latente funcional dentro do mesmo animal ^{o 2}.

O uso de channelrhodopsin ignora a necessidade de a estimulação elétrica despolarizar as junções neuromusculares de C. elegans, que só pode ser alcançada em preparações dissecadas, tornando esta técnica mais fácil de empregar e mais precisa ao segmentar tecidos específicos. Por exemplo, channelrhodopsin tem sido usado anteriormente em C. elegans para ativar os neurônios específicos de forma^{reversível, levando}a uma ativação robusta de neurônios excitatórios ou inibidores^{de inibição}3,4. O uso da despolarização luz-estimulada igualmente contorna a edição de dano neuronal devido à estimulação elétrica direta. Isto fornece uma oportunidade de examinar os efeitos de muitos protocolos diferentes da estimulação, incluindo estimulações sustentadas e repetidas, na dinâmica pós-sináptica do cálcio⁴.

A natureza transparente de C. elegans torna-o ideal para a análise funcional de imagens fluorescentes. No entanto, ao estimular os neurônios excitatórios de acetilcolina na NMJ, espera-se que os animais respondam com uma contração muscular imediata⁴, tornando a imobilização dos vermes críticos na visualização de alterações discretas de cálcio. Tradicionalmente, os agentes farmacológicos têm sido usados para paralisar os animais. Uma tal droga usada é Levamisole, um agonista do receptor de acetilcolina colinérgico^5,6,7. Desde que levamisol conduz à ativação persistente de um SubType de receptores excitatórios do músculo, este reagente é inadequado para o estudo da dinâmica do cálcio do músculo. A ação de levamisol induz a despolarização pós-sináptica, elevando o cálcio citosólico, e obstruindo observações depois da estimulação pré-sináptica. Para evitar o uso de drogas paralisantes, examinamos dois métodos alternativos para imobilizar C. elegans. Os animais foram colados para baixo e, em seguida, dissecado aberto para expor os músculos da parede do corpo, semelhante ao existente C. elegans nmj método de eletrofisiologia⁸, ou nanobeads foram utilizados para imobilizar animais intactos⁹. Ambos os procedimentos permitiram as medidas reprodutíveis dos transientes do cálcio do descanso e do músculo evocado que eram facilmente quantifiable.

Os métodos deste trabalho podem ser utilizados para medir os níveis de cálcio citosólico basal e transientes em células musculares da parede do corpo pós-sináptica em C. elegans. Exemplos de dados empregando as duas técnicas de imobilização diferentes são dadas. Ambas as técnicas aproveitam a optogenética para despolarizar as células musculares sem o uso de estimulação elétrica. Estes exemplos demonstram a viabilidade deste método em avaliar as mutações que afetam o tratamento pós-sináptica do cálcio nos sem-fins e apontam os prós e os contras das duas aproximações da imobilização.

Protocolo

1. configuração do microscópio

1. Use um microscópio composto com capacidades da fluorescência. Para este estudo, os dados foram coletados em um microscópio vertical (tabela de materiais) equipado com LEDs para excitação.
2. A fim de visualizar corretamente as alterações de fluorescência nos músculos da parede do corpo, use um objetivo de alta ampliação.
   1. Para preparações dissecadas, use um objetivo de imersão de água 60x NA 1,0 (tabela de materiais).
   2. Para preparações com nanoesferas, use um objetivo de imersão de óleo 60x NA 1,4 (tabela de materiais). Esta ampliação assegura a suficiente resolução dos músculos para o sensor da câmera.
3. Use uma câmera elevada da sensibilidade unida ao microscópio para capturar imagens em uma taxa de frame elevada a fim controlar mudanças rápidas em níveis do cálcio. Para este estudo, a imagem com um sistema de sCMOS (tabela dos materiais) capaz da imagem latente cheia do frame em 100 Hertz, como tempos da ascensão para os sinais de CA^{2 +} pode ser tão rápida quanto dezenas de milissegundos.
4. Controle de aquisição de câmera e excitação de fluorescência LED com um software de microgerente rodando em ImageJ¹⁰ de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
5. Use um plug-in de plataforma eletrônica de código aberto, que conecta uma placa de microcontrolador de código aberto externo (tabela de materiais), para gerenciar os pulsos de temporização externos para controlar a excitação de fluorescência.
   Nota: as saídas digitais estão disponíveis dos pinos digitais 8 a 13 que fornecem bocados de saída 0 a 5. Estes podem ser abordados como base 2 valores de 1, 10, 100, etc. As configurações da porta serial são indicadas na tabela 1 e estão disponíveis no site do microgerente (tabela de materiais). O firmware para a placa do microcontrolador está igualmente disponível neste Web site.
6. Para controlar a lógica de cronometragem, ative o protocolo de aquisição de micromanager no software de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
   Observação: isso simultaneamente inicia uma duração de quadro de câmera predefinida e o número de quadros a serem ativados, bem como o obturador lógico e LED âmbar predefinido para excitação de fluorescência. Neste caso, o interruptor ambarino do estado sólido do diodo emissor de luz é controlado pela saída do bocado 1 do microcontrolador através do pino 9. Os frames da câmera para fora TTL (placa traseira para fora o conector 3) disparam um stimulator. Isto cronometra precisamente a ativação do diodo emissor de luz azul para a ativação do channelrhodopsin em um tempo ajustado que segue a ativação da seqüência da imagem latente.
7. Para estimular a canalrhodopsina com luz azul e gravar alterações RCaMP, use dois LEDs. Ative o channelrhodopsin com um diodo emissor de luz com um comprimento de onda máximo da emissão de 470 nanômetro e um filtro do bandpass (455 a 490 nanômetro) e excitar rcamp com um diodo emissor de luz com um comprimento de onda máximo da emissão de 594 nanômetro e um filtro do bandpass (570 a 600 nm).
8. A fim ativar simultaneamente o channelrhodopsin e capturar mudanças em níveis fluorescentes de RCaMP, co-ilumina ambos os diodos emissores de luz e transmite-o à mesma trilha ótica usando um combinador dichroic do feixe.
9. Controle o sincronismo da iluminação do diodo emissor de luz com os interruptores do Estado contínuo (tabela dos materiais) controlados por sinais do TTL (tempo nominal máximo da volta-sobre, 1 senhora, tempo de turn-off 0,3 MS: 0 a 90% giram-em e desligam o tempo de < 100 μs).
10. Ajuste a intensidade do diodo emissor de luz com as fontes de alimentação lineares controladas atuais do baixo ruído (tabela dos materiais).
11. Para assegurar o sincronismo preciso do diodo emissor de luz azul, ative-o diretamente pelo pulso do TTL ao relé do contínuo-estado de um stimulator. Programe o protocolo de estimulação de luz azul em um estimulador (tabela de materiais), que atua como um temporizador preciso desde o início da aquisição de imagem até a iluminação LED azul. Neste experimento, ative a estimulação de luz azul após 2 s de captura de fluorescência rcamp apenas e use um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul com intervalos de 50 ms intervalo para ativar channelrhodopsin.
    Nota: o atraso antes de pulsos de luz azul, a duração dos pulsos de luz azul, o tempo entre pulsos, e o número de pulsos no trem pode ser definido neste momento e deve refletir os parâmetros específicos de interesse experimental.

preparação da amostra 2. C. elegans e aquisição de dados

1. Para estimular oticamente os neurônios pré-sinápticos, obter animais expressando channelrhodopsin em neurônios colinérgicos excitatórios, conduzido com a região do promotor UNC-17 , e rcamp expressa em todos os músculos da parede do corpo conduzido com o promotor Myo-3 região².
   Nota: recomenda-se apenas o uso de animais com transgenes integrados e níveis robustos de fluorescência, pois a expressão variável nos tipos de células correspondentes pode afetar a confiabilidade da aquisição de dados.
2. Faça um estoque de trabalho de todos-Trans da retina diluindo o pó da retina (tabela de materiais) em etanol para criar uma concentração final de 100 mm e armazenar a-20 ° c. Este estoque de trabalho será estável por aproximadamente um ano.
3. Criar um estoque de OP50 E. coli, cultivado em meios de lb, suplementado com todo-Trans da retina a partir do estoque de trabalho feito na etapa 2,2, em uma concentração final de 80 μm. O volume utilizado para o estoque OP50 + retinal dependerá do número de placas necessárias para o experimento.
4. Placas de mídia de crescimento de nematódeos de sementes (NGM) com aproximadamente 300 μL do estoque de OP50 + retiniana e permitem secar as placas durante a noite à temperatura ambiente no escuro.
5. Cresça cepas c. elegans para a idade desejada no escuro em OP50 + placas retinianas ngm a 20 ° c. Para este experimento, use vermes adultos.
   1. Para o experimento usando a preparação dissecada, use apenas vermes adultos gravid como a realização da dissecção em animais mais jovens e menores é extremamente desafiador. Deixe os animais nas placas OP50-retinal por um mínimo de 3 dias para uma ativação eficaz do channelrhodopsin.
6. Se utilizar a preparação dissecada^8,11 (Figura 1A), realize dissecções com pouca luz.
   1. Coloque os animais em um prato de dissecação com uma base de cobertura revestida de silicone que é preenchida com uma solução de 1 mm CA^{2 +} extracelular composta de 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CAcl_2,4mm MgCl₂, 10 mm de glicose, 5 mm de sacarose e 15 mm de HEPES (pH 7,3 ,-340 OSM).
   2. Cola para baixo os animais usando o adesivo líquido da pele tópica com coloração azul ao longo do lado dorsal do verme e fazer uma incisão lateral cutícula ao longo da interface cola/Worm usando agulhas de vidro.
   3. Use uma pipeta de boca para limpar as vísceras internas da cavidade do sem-fim.
   4. Cole para baixo a aleta da cutícula do animal para expor os músculos medial ventral da parede do corpo para a imagem latente.
7. Se utilizar a preparação de nanoesferas (Figura 1B)
   1. Faça uma solução de agarose de 5% derretida usando ddH₂o para um volume final de 100 ml.
   2. Usando uma pipeta de Pasteur, coloc uma gota da solução derretida do agarose em uma corrediça de vidro e coloc imediatamente uma segunda corrediça de vidro sobre a parte superior, perpendicular ao primeiro, usando a pressão delicada para criar uma almofada mesmo do agarose. Remova o slide superior antes de usar.
   3. Adicionar aproximadamente 4 μL de nanoesferas de poliestireno (tabela de materiais) ao meio da almofada de agarose.
   4. Na luz baixa, escolha 4-6 C. elegans na solução do nanobead, certificando-se que os animais não colocam sobre se, e coloc com cuidado uma lamínula na parte superior.
8. Coloc o prato preparado da corrediça ou da dissecção no microscópio, e encontre-o e concentre-se em um sem-fim usando a ampliação 10x e a iluminação brilhante fraca do campo.
9. Mude para a ampliação 60x e excitação de fluorescência RCaMP para identificar um músculo ventromedial da parede do corpo que é anterior à vulva e no plano focal correto.
   Nota: músculos anteriores à vulva são selecionados como eles refletem os músculos comumente estimulados em experimentos de eletrofisiologia.
10. Mude o caminho da imagem da ocular para a câmera, puxando o botão de alternância e clicando em Live dentro do software de aquisiçãode dados (tabela de materiais).
    Nota: Certifique-se de que a via de estimulação da luz azul está desligada neste ponto para garantir que a channelrhodopsina não seja ativada antes de capturar imagens.
11. Concentre a imagem dentro do software de aquisição de dados usando o foco fino do microscópio.
12. Uma vez que o músculo está claramente em foco, desligue a imagem ao vivo, descarregando o botão ao vivo .
13. Clique no botão ROI no software de aquisição de dados e crie uma caixa em torno do músculo que está sendo focado.
14. No estimulador, ligue a via de estimulação de luz azul que foi previamente programada no passo 1,10.
15. Clique em adquirir no software de imagem para capturar a imagem através da câmera CMOS. Para fazer isso, defina o tempo de exposição para 10 s com 1.000 quadros e 2x binning.

3. análise de dados

1. Abra o arquivo de dados no software de imagem (tabela de materiais) e, usando a ferramenta Polygon, delinear o músculo de interesse. Este é o ROI.
2. Ir para imagem | Stacks | Plotar o perfil do eixo Z e exportar os pontos de dados resultantes para o software de planilha (tabela de materiais). Essa função plota o valor médio de seleção de ROI versus o ponto de tempo.
3. Mova o ROI muscular criado com a ferramenta Polygon fora do animal para obter uma medição de fluorescência de fundo usando as etapas descritas em 3,2. Exporte os dados resultantes para a pasta de trabalho da planilha.
4. Na pasta de trabalho da planilha, subtraia os valores de fluorescência de fundo dos valores de fluorescência muscular em cada ponto de tempo. Isto fornece o fundo subtraído sinal fluorescente.
5. A média do fundo subtraída fluorescência para os primeiros 2 s de pontos de dados. Isto dará a medição de fluorescência basal, F.
6. Use a medição de fluorescência basal para calcular o nível de fluorescência normalizado em cada ponto de tempo. Para fazer isso, use a equação (ΔF/F) + 1. ΔF representa (F (t)-F), onde F (t) é a medida de fluorescência em um determinado ponto de tempo e F é o valor da linha de base. O + 1 é adicionado como um deslocamento do eixo y.
7. Repita as etapas 3.2-3.6 para cada imagem muscular que é coletada. O uso de células musculares únicas ou múltiplas por imagem é a critério do pesquisador. O n do experimento pode ser determinado realizando-se uma análise de potência.
8. Use os dados processados das etapas 3.2-3.6 para fazer um traço dos valores fluorescentes no software de representação gráfica de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
9. Deste traço, meça a cinética do transiente do cálcio, tal como a ascensão ao tempo de pico e a metade do tempo de deterioração, usando as ferramentas fornecidas no software do gráfico de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Essa técnica avaliou alterações nos mutantes que se achavam afetar o manuseio do cálcio ou a despolarização muscular. Os níveis de fluorescência basal e os transientes fluorescentes foram visualizados e a cinética de cálcio e cálcio citosólico em repouso no músculo foi avaliada. É importante que os animais foram cultivados em todos-trans retiniana por pelo menos três dias para garantir a incorporação bem-sucedida da retina, ativando assim subsequentemente a channelrhodops...

Discussão

GECIs são uma ferramenta poderosa em C. elegans neurobiologia. O trabalho anterior utilizou técnicas de imagem de cálcio para examinar uma ampla variedade de funções em ambos os neurônios e células musculares, incluindo respostas sensoriais e comportamentais, com variados métodos de estimulação. Alguns estudos utilizaram estímulos químicos para desencadear transientes de cálcio em neurônios de cinzas sensoriais^22,23 ou para induzir ondas de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line