C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

要約

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。

要約

モデル生物C.エレガンスは、生体内カルシウムイメージングを行うための優れたシステムを提供します。その透明なボディおよび遺伝的な操作性は遺伝的にコードされたカルシウムセンサーの標的化された発現を可能にする。このプロトコルは、標的細胞におけるカルシウムダイナミクス、特にワームの体壁筋の生体内イメージングに対するこれらのセンサの使用を概説する。シナプス前チャネルロドプシンの共発現を利用することにより、興奮性運動ニューロンからのアセチルコリン放出の刺激は、青色光パルスを用いて誘導され、細胞質カルシウムの筋肉脱分極および再現性の変化をもたらすレベル。2 つのワーム固定化手法は、さまざまなレベルの難易度で説明されています。これらの技術の比較は、両方のアプローチが神経筋接合部の生理学を維持し、カルシウム過渡の再現可能な定量を可能にすることを示しています。光遺伝学と機能性カルシウムイメージングを組み合わせることで、後代カルシウム取り扱いと恒常性の変化を様々な変異型の背景で評価することができます。提示されたデータは、固定化技術の両方を検証し、具体的には、C.エレガンスサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPaseと体壁筋カルシウム調節におけるカルシウム活性化BKカリウムチャネルの役割を調べます。

概要

本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。

GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光^強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物^{内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワーム神経筋接合部(NMJ)での研究を可能にする2}.

チャネルロドプシンの使用は、C.エレガンスの神経筋接合部を脱分極するための電気刺激の必要性をバイパスし、解剖製剤でのみ達成できるため、この技術を使用しやすく、より正確に行うことができる。特定の組織を標的にする場合。例えば、チャネルロドプシンは、以前にC.エレガンスで特定のニューロンを可逆的に活性化するために使用され、興奮性または阻害性^{ニューロン3、4}の堅牢な活性化のいずれかにつながる。光刺激脱分極の使用はまた、直接電気刺激による神経損傷の問題を回避する。これは、持続および繰り返し刺激を含む多くの異なる刺激プロトコルが、経例カルシウム^{ダイナミクス4}に及ぼす影響を調べる機会を提供する。

C.エレガンスの透明な性質は蛍光イメージング機能分析にとって理想的である。しかし、NMJで興奮性アセチルコリンニューロンを刺激する場合、動物は即時の筋肉^収縮4で応答することが期待され、離散的なカルシウム変化を視覚化する上でワームの固定化が重要である。伝統的に、薬理学的薬剤は、動物を麻痺させるために使用されてきました。使用されるそのような薬物の1つは、レバミソール、コリン作動性アセチルコリン受容体アゴ^{ニスト5、6、7}である。レバミソールは興奮性筋受容体のサブタイプの持続的な活性化につながるので、この試薬は筋肉カルシウムダイナミクスの研究には不向きである。レバミソールの作用は、シナプス後脱分極、細胞体カルシウムの上昇、およびシナプス前刺激後の観察を遮断する。麻痺薬の使用を避けるために、我々はC.エレガンスを固定する2つの代替方法を検討した。動物を接着し、次いで体壁の筋肉を露出させるために開いて解剖した動物は、既存のC.エレガンスNMJ電気生理学^法8と同様に、またはナノビーズを無傷の^動物9を固定するために使用した。両方の手順は、安静時の再現可能な測定を可能にし、容易に定量化可能な筋肉カルシウム過渡を誘発した。

この論文の方法は、C.エレガンスにおける後体壁筋細胞における基サイトソー酸カルシウムレベルおよび過渡性のベースラインを測定するために使用することができる。2つの異なる固定化技術を用いたデータの例が示される。両方の技術は、電気刺激を使用せずに筋肉細胞を脱分極するために光遺伝学を利用します。これらの例は、ワームにおける後質カルシウム処理に影響を与える変異を評価する際にこの方法の実現可能性を示し、2つの固定化アプローチの長所と短所を指摘する。

プロトコル

1. 顕微鏡セットアップ

1. 蛍光機能を備えた複合顕微鏡を使用します。本研究では、励起用のLEDを装着した直立顕微鏡(材料の表)でデータを収集した。
2. 体壁筋の蛍光変化を適切に可視化するためには、高倍率の目的を使用します。
   1. 解剖された調製物には、60x NA 1.0水浸漬目的(材料表)を使用してください。
   2. ナノビーズを用いる調製物には、60x NA 1.4オイル浸漬目的(材料表)を使用してください。この倍率はカメラセンサーの筋肉の十分な決断を保障する。
3. 顕微鏡に取り付けられた高感度カメラを使用して、高フレームレートで画像をキャプチャし、カルシウムレベルの急激な変化を追跡します。本研究では、Ca²⁺信号の立ち上がり時間が数十ミリ秒と同じくらい速くなるように、100 Hzでフルフレームイメージングが可能なsCMOSシステム(材料表)を用いた画像を用いた画像を用いた。
4. メーカーの指示に従ってImageJ¹⁰で実行されているマイクロマネージャソフトウェアでカメラの取得とLED蛍光励起を制御します(材料の表)。
5. 外部オープンソースマイクロコントローラボード(材料の表)を接続するオープンソースの電子プラットフォームプラグインを使用して、外部タイミングパルスを管理して蛍光励起を制御します。
   注:デジタル出力は、出力ビット0~5を提供するデジタルピン8~13から利用できます。これらは、1、10、100 などの基本 2 値として扱うことができます。シリアルポートの設定は表1に示され、マイクロマネージャーの Web サイト (材料の表)から入手できます。マイクロコントローラボードのファームウェアは、同様にこのウェブサイトで利用可能です。
6. タイミングロジックを制御するには、製造元の指示に従ってソフトウェアでマイクロマネージャ集録プロトコルを有効にします(材料の表)。
   注:これは同時に、プリセットカメラフレームの持続時間とアクティブにするフレームの数だけでなく、蛍光励起のための論理シャッターとプリセットアンバーLEDを開始します。この場合、オレンジ色のLEDソリッドステートスイッチは、ピン9を介したマイクロコントローラビット1出力によって制御されます。カメラフレームアウトTTL(バックプレートアウト3コネクタ)は、刺激器をトリガします。これは、画像化配列の活性化後の一定時間におけるチャネルロドプシンの活性化のための青色光LEDの活性化を正確に回す。
7. 青色光でチャネロドプシンを刺激し、RCaMP の変化を記録するには、2 つの LED を使用します。470 nmのピーク発光波長とバンドパスフィルタ(455~490nm)を持つLEDでチャネロドプシンを活性化し、ピーク発光波長594nmとバンドパスフィルタ(570~600nm)のLEDでRCaMPを励起します。
8. チャネロドプシンを同時に活性化し、RCaMP蛍光レベルの変化を捕捉するために、両方のLEDを同時に照射し、ダイクロイックビームコンバイナを使用して同じ光路に光を送信します。
9. TTL信号によって制御されるソリッドステートスイッチ(材料表)によるLED照明のタイミングを制御します(最大定格ターンオン時間、1ミリ秒、ターンオフ時間0.3ms:0~90%ターンオン、<100 μs)。
10. 現在制御された低ノイズリニア電源(材料の表)でLED強度を設定します。
11. 青色光LEDの正確なタイミングを確保するには、刺激器からソリッドステートリレーにTTLパルスで直接アクティブにします。青色光刺激プロトコルを刺激器(材料の表)にプログラムし、画像取得開始から青色LED照明までの正確なタイマーとして機能します。この実験では、RCaMP蛍光のみを捕捉した2秒後に青色光刺激をオンにし、50msインターパルス間隔を持つ5、2msの青色光パルスの列車を使用してチャネロドプシンを活性化する。
    注:青色光パルスの前の遅延、青色光パルスの持続時間、パルス間の時間、および列車内のパルスの数はすべて、この時点で設定することができ、実験的な関心のある特定のパラメータを反映する必要があります。

2. C. エレガンスサンプルの準備とデータ取得

1. 前シナプスニューロンを光学的に刺激するために、興奮性コリン作動性ニューロンでチャネルロドプシンを発現する動物を得る, unc-17プロモーター領域で駆動,そして、myo-3プロモーターで駆動されるすべての体壁筋肉で発現RCaMPリージョン².
   注:対応する細胞タイプの可変発現がデータ獲得の信頼性に影響を与える可能性があるため、統合されたトランスジェネと強いレベルの蛍光を持つ動物のみ使用することをお勧めします。
2. エタノールでレチナルパウダー(材料の表)を希釈して全トランスレチナルの作業ストックを作り、最終的な濃度を100mMにし、-20°Cで保存します。この稼働株は約1年間安定しています。
3. LB培中に成長したOP50大腸菌のストックを作成し、ステップ2.2で作られた作業ストックから全トランスレチナルを補充し、最終的な濃度は80 μMです。OP50+レチンストックに使用される体積は、実験に必要なプレートの数に依存します。
4. 種子線虫成長培地(NGM)プレートは、OP50+再生ストックの約300 μLで、プレートが暗闇の中で室温で一晩乾燥することを可能にします。
5. 20°CでOP50+軟経NGMプレート上の暗闇の中で所望の年齢にC.エレガン株を成長させます。この実験では、成人ワームを使用します。
   1. 解剖調製を用いての実験では、若い小動物に対して解剖を行うのと同じように、灰色の成虫のみを使用することは非常に困難である。効果的なチャネルロドプシン活性化のために、OP50-retinalプレート上の動物を最低3日間放置します。
6. 解剖調^製8、11(図1A)を用いて、低照光下で解剖を行う。
   1. 150 mM Ca²⁺ 5 mM KCl、1 mM CaCl 2、4 mM MgCl_2、10mM ブドウ糖、5 mM スクロース、および15 mM HEPES で満たされたシリコーンコーティングされたカバースリップ ベースで解剖皿に動物を配置します。、-340オスム)。
   2. 虫の背中に沿って青色の着色で液体局所皮膚接着剤を使用して動物を接着し、ガラス針を使用して接着剤/ワームインターフェースに沿って横キューティクル切開を行います。
   3. 口のピペットを使用して、虫の空洞から内内臓を取り除きます。
   4. 動物のキューティクルフラップを接着して、イメージング用の腹部中間体壁筋を露出させます。
7. ナノビーズ製剤を用いれば(図1B)
   1. ddH₂Oを使用して溶融5%アガロース溶液を100mLの最終容積にします。
   2. パストゥールピペットを使用して、溶融アガロース溶液の滴をガラススライド上に置き、すぐに最初に垂直に、第1に垂直な上に2番目のガラススライドを置き、穏やかな圧力を使用してアガロースパッドを作成します。使用前に上部スライドを取り外します。
   3. アガロースパッドの中央に約4μLのポリスチレンナノビーズ(材料表)を加えます。
   4. 低照光では、4-6 C.エレガンをナノビーズ溶液に取り入れ、動物が互いの上に横たわないようにし、慎重に上にカバースリップを置きます。
8. 準備されたスライドまたは解剖皿を顕微鏡の上に置き、10倍の倍率と薄暗い明るい分野の照明を使用してワームを見つけて焦点を合わせます。
9. 60倍の倍率とRCaMP蛍光励起に切り替えて、外陰部と正しい焦点面に付着する心室体壁筋を識別します。
   注:外陰部の筋肉は、電気生理学の実験で一般的に刺激される筋肉を反映するように選択されます。
10. トグルを引き出し、データ取得ソフトウェア内のLiveをクリックして、アイピースからカメラへの画像経路を変更します (材料の表)。
    注: 画像をキャプチャする前に、チャネロドプシンがアクティブにならないように、この時点で青色光刺激経路がオフになっていることを確認してください。
11. 顕微鏡の細かい焦点を使用して、データ集録ソフトウェア内の画像に焦点を合わせます。
12. 筋肉がはっきりとピントが合ったら、ライブボタンをクリック解除してライブ画像をオフにします。
13. データ取得ソフトウェアのROIボタンをクリックし、焦点を当てている筋肉の周りにボックスを作成します。
14. 刺激器で、ステップ1.10で以前にプログラムされた青色光刺激経路をオンにします。
15. イメージング ソフトウェアで [取得]をクリックして、CMOS カメラを介して画像をキャプチャします。これを行うには、1,000 フレームと 2x ビンで露出時間を 10 秒に設定します。

3. データ分析

1. イメージング ソフトウェア (材料の表)でデータ ファイルを開き、ポリゴン ツールを使用して、対象の筋肉の輪郭を描きます。これがROIです。
2. 画像へ |スタック|Z 軸プロファイルをプロットし、結果のデータ ポイントをスプレッドシート ソフトウェア (材料の表)に書き出します。この関数は、ROI 選択平均値と時点点をプロットします。
3. ポリゴンツールで作成した筋肉ROIを動物の外側に移動し、3.2で概説したステップを使用して背景蛍光測定を取得します。結果のデータをスプレッドシート ブックにエクスポートします。
4. スプレッドシート ブックで、各時点での筋肉蛍光値から背景蛍光値を減算します。これにより、背景減算蛍光信号が提供される。
5. データポイントの最初の2sの蛍光を差し引いた背景を平均します。これにより、ベースライン蛍光測定、Fが与える。
6. ベースライン蛍光測定を使用して、各時点で正規化された蛍光レベルを計算します。これを行うには、式 (ΔF/F)+1 を使用します。ΔFは(F(t)-F)を表し、F(t)は任意の時点における蛍光測定であり、Fはベースライン値である。+1 は Y 軸オフセットとして追加されます。
7. 収集された筋肉画像ごとに手順 3.2-3.6 を繰り返します。画像あたりの単一または複数の筋肉細胞を使用することは、研究者の裁量であります.実験のnは、電力解析を行うことによって決定することができる。
8. ステップ3.2-3.6の処理データを使用して、製造元の指示に従ってソフトウェアの蛍光値をトレースします(材料の表)。
9. このトレースから、製造元の指示に従ってグラフソフトウェアに付属のツールを使用して、ピーク時間と半分の減衰時間に上昇するなど、一過性のカルシウムの動態を測定します。

結果

この技術は、カルシウムの取り扱いや筋肉の脱分極に影響すると考えられている変異体の変化を評価した。ベースライン蛍光レベルおよび蛍光過渡を可視化し、筋肉内の細胞質カルシウムおよびカルシウム動態を休止して評価した。動物は、少なくとも3日間全トランス形直結で成長し、その後、チャネルロドプシンを活性化することが重要である(図2A...

ディスカッション

GECはC.エレガンス神経生物学の強力なツールです。これまでの研究では、カルシウムイメージング技術を用いて、感覚反応や行動反応など、ニューロンと筋肉細胞の両方で多種多様な機能を調べ、様々な刺激方法を用いた。いくつかの研究は、感覚ASH^{ニューロン22、23、}または咽頭^筋肉24でカルシウム波を誘導するために化学...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line