In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

Riepilogo

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

Abstract

L'organismo modello C. elegans fornisce un ottimo sistema per eseguire l'imaging in vivo del calcio. Il suo corpo trasparente e la sua manipolabilità genetica consentono l'espressione mirata di sensori di calcio geneticamente codificati. Questo protocollo delinea l'uso di questi sensori per l'imaging in vivo della dinamica del calcio nelle cellule mirate, in particolare i muscoli della parete corporea dei vermi. Utilizzando la co-espressione della channelrhodopsin presintica, la stimolazione del rilascio dell'acetilcolina dai motoneuroni eccitatori può essere indotta utilizzando impulsi di luce blu, con conseguente depolarizzazione muscolare e cambiamenti riproducibili nel calcio citoplastico Livelli. Due tecniche di immobilizzazione dei vermi sono discusse con diversi livelli di difficoltà. Il confronto di queste tecniche dimostra che entrambi gli approcci preservano la fisiologia della giunzione neuromuscolare e consentono la quantificazione riproducibile dei transitori di calcio. Associando l'optogenetica e l'imaging funzionale del calcio, i cambiamenti nella manipolazione post-sinaptica del calcio e nell'omeostasi possono essere valutati in una varietà di background mutanti. I dati presentati convalidano entrambe le tecniche di immobilizzazione ed esaminano specificamente i ruoli del c. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase e il canale di potassio BK attivato dal calcio nella regolazione del calcio muscolare della parete corporea.

Introduzione

Questo articolo presenta metodi per l'imaging del calcio in vivo dei muscoli della parete corporea di C. elegans utilizzando la stimolazione neuronale optogenetica. L'associazione di un muscolo ha espresso indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) con la depolarizzazione neuronale innescata dalla luce blu e fornisce un sistema per osservare chiaramente i transitori di calcio postsinaptico evocati. Questo evita l'uso della stimolazione elettrica, consentendo un'analisi non invasiva dei mutanti che influenzano la dinamica post-sinaptica del calcio.

I GECI a singolo fluoroforo, come GCaMP, utilizzano una singola molecola proteica fluorescente fusa nel dominio M13 della catena luminosa miosina chinasi all'estremità terminale N e al calmodulin (CaM) al C-terminus. Al momento del legame del calcio, il dominio CaM, che ha un'alta affinità per il calcio, subisce un cambiamento conformazionale che induce un successivo cambiamento conformazionale nella proteina fluorescente che porta ad un aumento dell'intensità fluorescenza¹. La fluorescenza GCaMP è eccitata a 488 nm, rendendola inadatta per essere utilizzata in combinazione con la channelrhodopsin, che ha una lunghezza d'onda di eccitazione simile di 473 nm. Pertanto, al fine di accoppiare le misurazioni del calcio con la stimolazione della channelrhodopsin, la proteina fluorescente verde di GCaMP deve essere sostituita con una proteina fluorescente rossa, mRuby (RCaMP). Utilizzando il muscolo espresso RCaMP, in combinazione con l'espressione del neurone motorio colinergico della channelrhodopsin, permette studi presso la giunzione neuromuscolare del verme (NMJ) con l'uso simultaneo di optogenetica e imaging funzionale all'interno dello stesso animale ².

L'uso della channelrhodopsin bypassa la necessità che la stimolazione elettrica depolarizzi le giunzioni neuromuscolari di C. elegans, che possono essere raggiunte solo in preparati sezionati, rendendo così questa tecnica più facile da impiegare e più precisa quando si prendono di mira tessuti specifici. Ad esempio, la channelrhodopsin è stata precedentemente utilizzata in C. elegans per attivare in modo reversibilizzato neuroni specifici, portando all'attivazione robusta di neuroni eccitatori o inibitori^3,4. L'uso della depolarizzazione stimolata dalla luce elude anche il problema dei danni neuronali dovuti alla stimolazione elettrica diretta. Questo offre l'opportunità di esaminare gli effetti di molti protocolli di stimolazione diversi, tra cui stimolazioni sostenute e ripetute, sulla dinamica post-sinaptica del calcio⁴.

La natura trasparente di C. elegans lo rende ideale per l'analisi funzionale dell'imaging fluorescente. Tuttavia, quando si stimolano i neuroni eccitatori di acetilcolina al NMJ, gli animali sono tenuti a rispondere con una contrazione muscolare immediata⁴, rendendo l'immobilizzazione dei vermi critici nella visualizzazione dei cambiamenti discreti di calcio. Tradizionalmente, gli agenti farmacologici sono stati utilizzati per paralizzare gli animali. Uno di questi farmaci utilizzati è levamisole, un agonista recettore acetilcolina colinergico^5,6,7. Poiché levamisole porta all'attivazione persistente di un sottotipo di recettori muscolari eccitatori, questo reagente non è adatto per lo studio della dinamica del calcio muscolare. L'azione di levamisole induce depolarizzazione post-sinaptica, elevando il calcio citosolico, e osservazioni occlude a seguito di stimolazione pressinaptica. Per evitare l'uso di farmaci paralizzanti, abbiamo esaminato due metodi alternativi per immobilizzare C. elegans. Gli animali sono stati incollati e poi sezionati aperti per esporre i muscoli della parete del corpo, simile al metodo elettrofisiologia C. elegans NMJ^{esistente 8}, o nanosfere sono state utilizzate per immobilizzare gli animali intatti⁹. Entrambe le procedure hanno permesso le misurazioni riproducibili dei transitori di calcio muscolare a riposo ed evocate che erano facilmente quantificabili.

I metodi in questo documento possono essere utilizzati per misurare i livelli di calcio citosolico di base e transitori nelle cellule muscolari post-sinaptiche della parete del corpo in C. elegans. Vengono forniti esempi di dati che utilizzano le due diverse tecniche di immobilizzazione. Entrambe le tecniche sfruttano l'optogenetica per depolarizzare le cellule muscolari senza l'uso di stimolazione elettrica. Questi esempi dimostrano la fattibilità di questo metodo nella valutazione delle mutazioni che influenzano la manipolazione post-sinaptica del calcio nei vermi e sottolineano i pro e i contro dei due approcci di immobilizzazione.

Protocollo

1. Configurazione del microscopio

1. Utilizzare un microscopio composto con capacità di fluorescenza. Per questo studio, sono stati raccolti dati su un microscopio verticale (Tabella dei materiali) dotato di LED per l'eccitazione.
2. Al fine di visualizzare correttamente i cambiamenti di fluorescenza nei muscoli della parete del corpo, utilizzare un obiettivo di ingrandimento elevato.
   1. Per i preparati sezionati, utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x NA 1.0 (Tabella dei materiali).
   2. Per i preparati utilizzino nanosfere, utilizzare un obiettivo di immersione dell'olio 60x NA 1.4 (Tabella dei materiali). Questo ingrandimento garantisce una risoluzione sufficiente dei muscoli sul sensore della fotocamera.
3. Utilizzare una fotocamera ad alta sensibilità collegata al microscopio per catturare immagini ad alta frequenza fotogrammi al fine di monitorare i rapidi cambiamenti nei livelli di calcio. Per questo studio, l'immagine con un sistema sCMOS (Tabella dei materiali) in grado di immagini complete del telaio a 100 Hz, in quanto i tempi di salita per i segnali Ca² o possono essere rapidi quanto decine di millisecondi.
4. Controllare l'acquisizione della telecamera e l'eccitazione a fluorescenza a LED con un software di micro-manager in esecuzione in ImageJ¹⁰ secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
5. Utilizzare un plug-in della piattaforma elettronica open source, che collega una scheda microcontrollore open source esterna (Table of Materials), per gestire gli impulsi di temporizzazione esterni per controllare l'eccitazione a fluorescenza.
   NOTA: i digital out sono disponibili da pin digitali da 8 a 13 che forniscono bit di uscita da 0 a 5. Questi possono essere indirizzati come valori di base 2 di 1, 10, 100, ecc. Le impostazioni delle porte seriali sono indicate nella tabella 1 e sono disponibili dal sito web del micro-manager ( Tabelladei materiali). Il firmware per la scheda microcontroller è disponibile in modo analogo su questo sito Web.
6. Per controllare la logica di temporizzazione, attivare il protocollo di acquisizione del micromanager nel software secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   NOTA: Questo avvia contemporaneamente una durata preimpostata del fotogramma della fotocamera e il numero di fotogrammi da attivare, così come l'otturatore logico e il LED ambra preimpostato per l'eccitazione a fluorescenza. In questo caso, l'interruttore a stato solido a LED ambra è controllato dall'uscita del microcontrollore bit 1 attraverso il pin 9. La fotocamera inquadra il TTL (piastra posteriore su 3 connettore) attiva uno stimolatore. Questo è spesso l'attivazione del LED a luce blu per l'attivazione della channelrhodopsin in un momento prestabilito dopo l'attivazione della sequenza di imaging.
7. Per stimolare la channelrhodopsin con la luce blu e registrare i cambiamenti RCaMP, utilizzare due LED. Attivare channelrhodopsin con un LED con una lunghezza d'onda di picco di emissione di 470 nm e un filtro passabanda (455 a 490 nm) ed eccitare RCaMP con un LED con una lunghezza d'onda di picco di emissione di 594 nm e un filtro passabanda (da 570 a 600 nm).
8. Al fine di attivare contemporaneamente channelrhodopsin e catturare i cambiamenti nei livelli fluorescenti RCaMP, co-illuminare entrambi i LED e trasmettere la luce allo stesso percorso ottico utilizzando un combinatore di fascio dicroico.
9. Controllare la temporizzazione dell'illuminazione a LED con interruttori a stato solido (Tabella dei materiali) controllati da segnali TTL (tempo di accvito con punteggio massimo, 1 ms, tempo di spegnimento di 0,3 ms: da 0 a 90% di acconto e tempo di spegnimento di < 100 s).
10. Impostare l'intensità del LED con gli alimentatori lineari a basso rumore controllati (Tabella dei materiali).
11. Per garantire la tempistica precisa del LED a luce blu, attivarlo direttamente con l'impulso TTL al relè allo stato solido da uno stimolatore. Programmare il protocollo di stimolazione della luce blu in uno stimolatore (Tabella dei materiali), che agisce come un timer preciso dall'inizio dell'acquisizione dell'immagine all'illuminazione LED blu. In questo esperimento, attivare la stimolazione della luce blu dopo 2 s di catturare solo la fluorescenza RCaMP e utilizzare un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu con intervalli interpulsivi 50 ms per attivare la channelrhodopsin.
    NOTA: il ritardo prima degli impulsi di luce blu, la durata degli impulsi della luce blu, il tempo tra gli impulsi e il numero di impulsi nel treno possono essere tutti impostati a questo punto e devono riflettere i parametri specifici di interesse sperimentale.

2. Preparazione e acquisizione di dati del campione di C. elegans

1. Per stimolare otticamente i neuroni presintici, ottenere animali che esprimono channelrhodopsin in neuroni colinergici eccitatori, guidati con la regione promotrice unc-17, e RCaMP espresso in tutti i muscoli della parete del corpo guidati con il promotore myo-3 regione².
   NOTA: Si raccomanda solo l'uso di animali con transgeni integrati e robusti livelli di fluorescenza, in quanto l'espressione variabile nei tipi di cellule corrispondenti può influire sull'affidabilità dell'acquisizione dei dati.
2. Fare uno stock di lavoro di tuttala retina dissuasivo diluindo la polvere retinica ( Tabelladei materiali) in etanolo per creare una concentrazione finale di 100 mM e conservare a -20 gradi centigradi. Questo stock di lavoro sarà stabile per circa un anno.
3. Creare uno stock di OP50 E. coli, coltivato in supporti LB, integrato con retieria tuttatrans dal magazzino di lavoro realizzato al punto 2.2, ad una concentrazione finale di 80 M. Il volume utilizzato per lo stock di OP50-retinale dipenderà dal numero di lastre necessarie per l'esperimento.
4. Piastre di prosciugamento del nematode (NGM) con circa 300 -L del brodo OP50-retinale e permettono alle piastre di asciugarsi durante la notte a temperatura ambiente al buio.
5. Coltiva ceppi di C. elegans fino all'età desiderata al buio su piastre NGM OP50-retinali a 20 gradi centigradi. Per questo esperimento, utilizzare vermi adulti.
   1. Per l'esperimento che utilizza la preparazione sezionata, utilizzare solo vermi adulti gravidi come eseguire la dissezione su animali più giovani e più piccoli è estremamente impegnativo. Lasciare gli animali sulle placche op50-retinale per un minimo di 3 giorni per un'attivazione efficace della channelrhodopsin.
6. Se si utilizza la preparazione sezionata^8,11 (Figura 1A), eseguire dissezioni in condizioni di scarsa illuminazione.
   1. Mettere gli animali in un piatto di dissezione con una base in vetrittaio rivestito in silicone che viene riempito con una soluzione extracellulare da 1 mM Ca^{2 o più} composta da 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 10 mM di glucosio, 5 mM di saccarosio e 15 mM HEPES (pH 7.3 , -340 Osm).
   2. Incolla gli animali usando l'adesivo della pelle topica liquida con colorazione blu lungo il lato dorsale del verme e fai un'incisione cuticola laterale lungo l'interfaccia colla/verme utilizzando aghi di vetro.
   3. Utilizzare una pipetta bocca per cancellare le viscere interne dalla cavità del verme.
   4. Incollare il lembo cuticola dell'animale per esporre i muscoli ventrali della parete corporea per l'imaging.
7. Se si utilizza la preparazione della nanosfera (Figura 1B)
   1. Fare una soluzione fusa 5% agarose utilizzando ddH₂O ad un volume finale di 100 mL.
   2. Utilizzando una pipetta Pasteur, mettere una goccia di soluzione agarose fusa su uno scivolo di vetro e posizionare immediatamente un secondo vetrino sopra la parte superiore, perpendicolare al primo, utilizzando una leggera pressione per creare un pad agarose uniforme. Rimuovere la diapositiva superiore prima dell'uso.
   3. Aggiungere circa 4 -L di nanosfere di polistirolo (Tabella dei materiali) al centro del cuscinetto di agarose.
   4. Nella luce bassa, scegli 4-6 C. elegannella nella soluzione di nanosfera, assicurandoti che gli animali non si sdraino l'uno sull'altro e posiziona con attenzione un coperchio sulla parte superiore.
8. Posizionare il piatto di scivolo o dissezione preparato al microscopio e trovare e mettere a fuoco su un verme utilizzando l'ingrandimento 10x e l'illuminazione del campo luminoso fioca.
9. Passare all'ingrandimento 60x e all'eccitazione a fluorescenza RCaMP per identificare un muscolo della parete corporea ventromediale che si trova anteriormente alla vulva e nel piano focale corretto.
   NOTA: I muscoli anteriori alla vulva vengono selezionati in quanto riflettono i muscoli comunemente stimolati negli esperimenti di elettrofisiologia.
10. Modificare il percorso dell'immagine dall'oculare alla fotocamera estraendo l'interruttore e facendo clic su Live all'interno del software di acquisizione dati (Tabella dei materiali).
    NOTA: Assicurarsi che il percorso di stimolazione della luce blu sia disattivato a questo punto per assicurarsi che la channelrhodopsin non venga attivata prima di acquisire le immagini.
11. Mettere a fuoco l'immagine all'interno del software di acquisizione dati utilizzando la messa a fuoco fine del microscopio.
12. Quando il muscolo è chiaramente a fuoco, disattiva l'immagine dal vivo deselezionando il pulsante Live.
13. Fare clic sul pulsante ROI nel software di acquisizione dati e creare una casella intorno al muscolo su cui ci si concentra.
14. Sullo stimolatore, attivare il percorso di stimolazione della luce blu che è stato precedentemente programmato nel passaggio 1.10.
15. Fare clic su Acquisisci nel software di imaging per acquisire l'immagine tramite la fotocamera CMOS. A tale scopo, impostare il tempo di esposizione su 10 s con 1.000 fotogrammi e 2x binning.

3. Analisi dei dati

1. Aprire il file di dati nel software di imaging (Tabella dei materiali) e, utilizzando lo strumento Polygon, delineare il muscolo di interesse. Questo è il ROI.
2. Vai all'immagine . Proprietà Stacks . Tracciare il profilo dell'asse z ed esportare i punti dati risultanti nel software del foglio di calcolo ( Tabella deimateriali). Questa funzione traccia il valore medio di selezione del ROI rispetto al punto temporale.
3. Spostare il ROI muscolare creato con lo strumento Poligono all'esterno dell'animale per ottenere una misurazione della fluorescenza di fondo utilizzando i passaggi descritti nella versione 3.2. Esportare i dati risultanti nella cartella di lavoro del foglio di calcolo.
4. Nella cartella di lavoro del foglio di calcolo, sottrarre i valori di fluorescenza di sfondo dai valori di fluorescenza muscolare in ogni punto temporale. Questo fornisce lo sfondo sottratto segnale fluorescente.
5. Media dello sfondo sottratto fluorescenza per i primi 2 s di punti dati. Questo darà la misurazione della fluorescenza di base, F.
6. Utilizzare la misurazione della fluorescenza linea di base per calcolare il livello di fluorescenza normalizzato in ogni punto temporale. A tale scopo, utilizzare l'equazione (F/F) . La F rappresenta (F(t)-F), dove F(t) è la misurazione della fluorescenza in un determinato punto temporale e F è il valore della linea di base. L'1 viene aggiunto come offset dell'asse y.
7. Ripetere i passaggi da 3.2 a 3.6 per ogni immagine muscolare raccolta. Utilizzando singole o più cellule muscolari per immagine è a discrezione del ricercatore. La n dell'esperimento può essere determinata eseguendo un'analisi di potenza.
8. Utilizzare i dati elaborati dai passaggi 3.2-3.6 per tracciare i valori fluorescenti nel software grafico secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
9. Da questa traccia, misurare la cinetica del calcio transitorio, come ad esempio l'aumento al tempo di picco e il tempo di decadimento, utilizzando gli strumenti forniti nel software grafico secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Questa tecnica ha valutato i cambiamenti nei mutanti che si ritiene influenzino la manipolazione del calcio o la depolarizzazione muscolare. Sono stati visualizzati i livelli di fluorescenza di base e i transitori fluorescenti e sono stati valutati il calcio citosolico a riposo e la cinetica di calcio all'interno del muscolo. È importante che gli animali siano stati coltivati su una retina tutta trans per almeno tre giorni per garantire la corretta incorporazione della retina, attivando ...

Discussione

I GECI sono un potente strumento nella neurobiologia di C. elegans. Il lavoro precedente ha utilizzato tecniche di imaging del calcio per esaminare un'ampia varietà di funzioni sia nei neuroni che nelle cellule muscolari, comprese le risposte sensoriali e comportamentali, con vari metodi di stimolazione. Alcuni studi hanno utilizzato stimoli chimici per innescare transitori di calcio nei neuroni sensoriali ASH^22,23 o per indurre le onde di calcio nei mu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line