In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Resumen

Este método proporciona una manera de acoplar optogenéticas y sensores de calcio codificados genéticamente para crear imágenes de los niveles basales de calcio citosólico y cambios en los transitorios de calcio evocados en los músculos de la pared corporal del organismo modelo C. elegans.

Resumen

El organismo modelo C. elegans proporciona un excelente sistema para realizar imágenes de calcio in vivo. Su cuerpo transparente y su manipulabilidad genética permiten la expresión específica de sensores de calcio codificados genéticamente. Este protocolo describe el uso de estos sensores para la toma de imágenes in vivo de la dinámica de calcio en células objetivo, específicamente los músculos de la pared corporal de los gusanos. Mediante la utilización de la co-expresión de la carredopsina presináptica, la estimulación de la liberación de acetilcolina de las neuronas motoras excitatorias se puede inducir utilizando pulsos de luz azul, lo que resulta en la despolarización muscular y cambios reproducibles en el calcio citoplasmático Niveles. Dos técnicas de inmovilización de gusanos se discuten con diferentes niveles de dificultad. La comparación de estas técnicas demuestra que ambos enfoques preservan la fisiología de la unión neuromuscular y permiten la cuantificación reproducible de los transitorios de calcio. Al combinar la optogenética y las imágenes funcionales de calcio, los cambios en el manejo del calcio postsináptico y la homeostasis se pueden evaluar en una variedad de orígenes mutantes. Los datos presentados validan ambas técnicas de inmovilización y examinan específicamente las funciones de la C. elegans sarco(endo)plasmático DE calcio reticular ATPase y el canal de potasio BK activado por calcio en la regulación del calcio muscular de la pared corporal.

Introducción

Este artículo presenta métodos para la toma de imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared corporal de C. elegans utilizando estimulación neuronal optogenética. El emparejamiento de un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) con luz azul desencadenó la despolarización neuronal y proporciona un sistema para observar claramente los transitorios de calcio postsináptico salidados. Esto evita el uso de estimulación eléctrica, permitiendo un análisis no invasivo de mutantes que afectan a la dinámica de calcio postsináptica.

Los GECI de un solo fluoróforo, como GCaMP, utilizan una sola molécula de proteína fluorescente fusionada al dominio M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina en su extremo N-terminal y calmodulina (CaM) en el C-terminus. Tras la unión al calcio, el dominio CaM, que tiene una alta afinidad por el calcio, sufre un cambio conformacional que induce un cambio conformacional posterior en la proteína fluorescente que conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia¹. La fluorescencia GCaMP se excita a 488 nm, por lo que no es adecuado para ser utilizado en combinación con la canalrodilina, que tiene una longitud de onda de excitación similar de 473 nm. Por lo tanto, con el fin de acoplar las mediciones de calcio con la estimulación de la canalroditina, la proteína fluorescente verde de GCaMP debe ser reemplazada por una proteína fluorescente roja, mRuby (RCaMP). El uso del músculo rCaMP expresado, en combinación con la expresión de la neurona motora colinérgica de la canalrodiasina, permite estudios en la unión neuromuscular del gusano (NMJ) con el uso simultáneo de la optogenética y la imagen funcional dentro del mismo animal ².

El uso de la cedrodonina evita la necesidad de la estimulación eléctrica para despolarizar las uniones neuromusculares de C. elegans,lo que sólo se puede lograr en preparaciones diseccionadas, haciendo así esta técnica más fácil de emplear y más precisa cuando se dirige a tejidos específicos. Por ejemplo, channelrhodopsin se ha utilizado previamente en C. elegans para activar de forma reversible neuronas específicas, lo que conduce a la activación robusta de las neuronas excitatorias o inhibitorias^3,4. El uso de la despolarización estimulada por la luz también elude el problema del daño neuronal debido a la estimulación eléctrica directa. Esto proporciona una oportunidad para examinar los efectos de muchos protocolos de estimulación diferentes, incluyendo estimulaciones sostenidas y repetidas, en la dinámica de calcio postsináptica⁴.

La naturaleza transparente de C. elegans lo hace ideal para el análisis funcional de imágenes fluorescentes. Sin embargo, al estimular las neuronas de acetilcolina excitatorias en el NMJ, se espera que los animales respondan con una contracción muscular inmediata^4,haciendo que la inmovilización de los gusanos crítico para visualizar cambios discretos de calcio. Tradicionalmente, se han utilizado agentes farmacológicos para paralizar a los animales. Uno de estos fármacos utilizados es levamisol, un agonista del receptor de acetilcolina colinérgico^5,6,7. Dado que el levamisol conduce a la activación persistente de un subtipo de receptores musculares excitatorios, este reactivo no es adecuado para el estudio de la dinámica muscular de calcio. La acción del levamisol induce la despolarización postsináptica, elevando el calcio citosólico y ocluiendo observaciones después de la estimulación presináptica. Para evitar el uso de medicamentos paralizantes, examinamos dos métodos alternativos para inmovilizar C. elegans. Los animales fueron pegados y luego diseccionados abiertos para exponer los músculos de la pared del cuerpo, similar al método de electrofisiología C. elegans NMJ^{existente 8,}o nanoperlas se utilizaron para inmovilizar animales intactos^9. Ambos procedimientos permitían las mediciones reproducibles del reposo y evocaban transitorios musculares de calcio que eran fácilmente cuantificables.

Los métodos en este artículo se pueden utilizar para medir los niveles basales de calcio citosólico y transitorios en las células musculares de la pared del cuerpo postsináptico en C. elegans. Se proporcionan ejemplos de datos que emplean las dos técnicas de inmovilización diferentes. Ambas técnicas aprovechan la optogenética para despolarizar las células musculares sin el uso de estimulación eléctrica. Estos ejemplos demuestran la viabilidad de este método en la evaluación de mutaciones que afectan el manejo de calcio postsináptico en los gusanos y señalan los pros y los contras de los dos enfoques de inmovilización.

Protocolo

1. Configuración del microscopio

1. Utilice un microscopio compuesto con capacidades de fluorescencia. Para este estudio, se recogieron datos en un microscopio vertical(Tabla de Materiales)equipado con LEDs para excitación.
2. Con el fin de visualizar adecuadamente los cambios de fluorescencia en los músculos de la pared del cuerpo, utilizar un objetivo de aumento alto.
   1. Para preparaciones diseccionadas, utilice un objetivo de inmersión en agua 60x NA 1.0(Tabla de materiales).
   2. Para preparaciones con nanoperlas, utilice un objetivo de inmersión en aceite 60x NA 1.4(Tabla de materiales). Este aumento garantiza una resolución suficiente de los músculos en el sensor de la cámara.
3. Utilice una cámara de alta sensibilidad conectada al microscopio para capturar imágenes a una velocidad de fotogramas alta con el fin de realizar un seguimiento de los cambios rápidos en los niveles de calcio. Para este estudio, la imagen con un sistema sCMOS(Tabla de Materiales)capaz de imágenes de marco completo a 100 Hz, ya que los tiempos de subida para las señales Ca²⁺ pueden ser tan rápidos como decenas de milisegundos.
4. Controle la adquisición de cámaras y la excitación por fluorescencia LED con un software de microadministrador que se ejecuta en ImageJ¹⁰ de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
5. Utilice un plugin de plataforma electrónica de código abierto, que conecta una placa externa de microcontrolador de código abierto(Tabla de materiales),para gestionar los pulsos de temporización externos para controlar la excitación de la fluorescencia.
   NOTA: Las salidas digitales están disponibles en los pines digitales 8 a 13, proporcionando los bits de salida 0 a 5. Estos se pueden abordar como valores base 2 de 1, 10, 100, etc. La configuración del puerto serie se indica en la Tabla 1 y está disponible en el sitio web del microadministrador(Tabla de materiales). El firmware de la placa del microcontrolador está disponible de forma similar en este sitio web.
6. Para controlar la lógica de temporización, active el protocolo de adquisición de micromanageres en el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
   NOTA: Esto inicia simultáneamente una duración de fotograma de cámara preestablecida y el número de fotogramas que se activarán, así como el obturador lógico y el LED ámbar preestablecido para la excitación de la fluorescencia. En este caso, el interruptor de estado sólido LED ámbar es controlado por la salida de bit 1 del microcontrolador a través del pin 9. La cámara enmarca TTL (placa trasera hacia fuera 3 conector) activa un estimulador. Esto precisamente multiplica la activación del LED de luz azul para la activación de la cedrodrodina en un tiempo establecido después de la activación de la secuencia de imágenes.
7. Para estimular la cedrodrodina con luz azul y registrar los cambios de RCaMP, utilice dos LED. Active la canalrodicina con un LED con una longitud de onda de emisión máxima de 470 nm y un filtro de paso de banda (455 a 490 nm) y excite RCaMP con un LED con una longitud de onda de emisión máxima de 594 nm y un filtro de paso de banda (570 a 600 nm).
8. Con el fin de activar simultáneamente la cedredopsina y capturar los cambios en los niveles fluorescentes de RCaMP, co-ilumine ambos LED y transmita la luz a la misma trayectoria óptica utilizando un combinador de haz dicroico.
9. Controle el tiempo de iluminación LED con interruptores de estado sólido(Tabla de materiales)controlados por señales TTL (tiempo máximo de encendido nominal, 1 ms, tiempo de apagado 0,3 ms: 0 a 90% de encendido y tiempo de apagado de < 100 s).
10. Ajuste la intensidad del LED con las fuentes de alimentación lineales de bajo ruido controladas por corriente(Tabla de materiales).
11. Para asegurar la sincronización precisa del LED de luz azul, actívelo directamente por pulso TTL al relé de estado sólido desde un estimulador. Programe el protocolo de estimulación de la luz azul en un estimulador(Tabla de materiales),que actúa como un temporizador preciso desde el inicio de la adquisición de imágenes hasta la iluminación LED azul. En este experimento, activa la estimulación de la luz azul después de 2 s de capturar la fluorescencia RCaMP solamente y usa un tren de 5, 2 ms pulsos de luz azul con intervalos interpulsos de 50 ms para activar channelrhodopsin.
    NOTA: El retardo antes de los pulsos de luz azul, la duración de los pulsos de luz azul, el tiempo entre pulsos y el número de pulsos en el tren se pueden ajustar en este punto y deben reflejar los parámetros específicos de interés experimental.

2. Preparación de muestras de C. elegans y adquisición de datos

1. Para estimular ópticamente las neuronas presinápticas, obtener animales que expresan cdicrodopina en neuronas colinérgicas excitatorias, impulsados con la región promotora unc-17, y RCaMP expresado en todos los músculos de la pared del cuerpo impulsados con el promotor de mio-3 región².
   NOTA: Sólo se recomienda el uso de animales con transgenes integrados y niveles robustos de fluorescencia, ya que la expresión variable en los tipos de células correspondientes puede afectar a la fiabilidad de la adquisición de datos.
2. Hacer un stock de trabajo de la retinatrans diluyendo el polvo de la retina(Tabla de Materiales)en etanol para crear una concentración final de 100 mM y almacenar a -20 oC. Este stock de trabajo será estable durante aproximadamente un año.
3. Crear un stock de OP50 E. coli,cultivado en medios LB, complementado con laretina trans de la culata de trabajo hecha en el paso 2.2, a una concentración final de 80 m. El volumen utilizado para el material de retina OP50+retinal dependerá del número de placas necesarias para el experimento.
4. Placas de medios de crecimiento de nematodos de semillas (NGM) con aproximadamente 300 l de la planta de retina OP50+retinal y permiten que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
5. Cultivar C. elegans cepas a la edad deseada en la oscuridad en placas OP50 + retinal NGM a 20 oC. Para este experimento, utilice gusanos adultos.
   1. Para el experimento utilizando la preparación diseccionada, sólo utilizar gusanos adultos gravídicos como realizar la disección en animales más jóvenes y más pequeños es extremadamente difícil. Deje a los animales en las placas de retina OP50 durante un mínimo de 3 días para una activación eficaz de la canalrodilina.
6. Si utiliza la preparación diseccionada^8,11 (Figura 1A),realice disecciones con poca luz.
   1. Coloque los animales en un plato dissecting con una base de cubreobjetos recubierta de silicona que esté llena de una solución extracelular de 1 mM Ca²⁺ compuesta de 150 mM de NaCl, 5 mM De KCl, 1 mM de CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 10 mM de glucosa, sacarosa de 5 mM y 15 mM DEHE (pH 7.3 , -340 Osm).
   2. Pegue a los animales usando el adhesivo líquido tópico de la piel con coloración azul a lo largo del lado dorsal del gusano y haga una incisión de cutícula lateral a lo largo de la interfaz de pegamento/gusano usando agujas de vidrio.
   3. Utilice una pipeta bucal para eliminar las vísceras internas de la cavidad del gusano.
   4. Pegue el colgajo de la cutícula del animal para exponer los músculos de la pared corporal medial ventral para la toma de imágenes.
7. Si utiliza la preparación de nanoperlas (Figura 1B)
   1. Hacer una solución fundida de agarosa al 5% utilizando ddH₂O a un volumen final de 100 ml.
   2. Usando una pipeta Pasteur, coloque una gota de solución de agarosa fundida en un portaobjetos de vidrio e inmediatamente coloque un segundo tobogán de vidrio sobre la parte superior, perpendicular a la primera, usando una presión suave para crear una almohadilla de agarosa uniforme. Retire la diapositiva superior antes de usarla.
   3. Añadir aproximadamente 4 l de nanoperlas de poliestireno(Tabla de materiales)al centro de la almohadilla de agarosa.
   4. En la luz baja, recoger 4-6 C. elegans en la solución de nanoperla, asegurándose de que los animales no se coloquen uno encima del otro, y coloque cuidadosamente un cubreobjetos en la parte superior.
8. Coloque la diapositiva o la placa de disección preparada en el microscopio, y busque y concéntrese en un gusano usando aumento 10x e iluminación de campo brillante tenue.
9. Cambie a aumento de 60x y excitación por fluorescencia RCaMP para identificar un músculo de pared del cuerpo ventromedial que es anterior a la vulva y en el plano focal correcto.
   NOTA: Los músculos anteriores a la vulva se seleccionan ya que reflejan los músculos comúnmente estimulados en experimentos de electrofisiología.
10. Cambie la ruta de la imagen del ocular a la cámara extrayendo el interruptor y haciendo clic en Vivir dentro del software de adquisición de datos(Tabla de materiales).
    NOTA: Asegúrese de que la vía de estimulación de la luz azul esté apagada en este punto para asegurarse de que la canalrodrodina no se active antes de capturar imágenes.
11. Enfoque la imagen dentro del software de adquisición de datos utilizando el enfoque fino del microscopio.
12. Una vez que el músculo está claramente enfocado, apague la imagen en vivo deshaciendo clic en el botón Live.
13. Haga clic en el botón ROI en el software de adquisición de datos y cree una caja alrededor del músculo en el que se está centrando.
14. En el estimulador, encienda la vía de estimulación de la luz azul que se ha programado previamente en el paso 1.10.
15. Haga clic en Adquirir en el software de imágenes para capturar la imagen a través de la cámara CMOS. Para ello, establezca el tiempo de exposición a 10 s con 1.000 fotogramas y 2x binning.

3. Análisis de datos

1. Abra el archivo de datos en el softwarede imágenes (Tabla de materiales)y, utilizando la herramienta Polígono, delinee el músculo de interés. Este es el ROI.
2. Ir a la imagen de la imagen de la imagen de la imagen de Pilas ? Trazar el perfil del eje Z y exportar los puntos de datos resultantes en el software de hoja de cálculo(Tabla de materiales). Esta función traza el valor medio de selección de ROI frente al punto de tiempo.
3. Mueva el ROI muscular creado con la herramienta Polígono fuera del animal para obtener una medición de fluorescencia de fondo utilizando los pasos descritos en 3.2. Exporte los datos resultantes al libro de hojas de cálculo.
4. En el libro de hoja de cálculo, reste los valores de fluorescencia de fondo de los valores de fluorescencia muscular en cada punto de tiempo. Esto proporciona la señal fluorescente restada de fondo.
5. Promedio del fondo restado fluorescencia para los primeros 2 s de puntos de datos. Esto dará la medición de fluorescencia basal, F.
6. Utilice la medición de fluorescencia basal para calcular el nivel de fluorescencia normalizado en cada punto de tiempo. Para ello, utilice la ecuación (F/F)+1. •F representa (F(t)-F), donde F(t) es la medición de fluorescencia en un punto de tiempo dado y F es el valor de referencia. El +1 se agrega como un desplazamiento del eje Y.
7. Repita los pasos 3.2-3.6 para cada imagen muscular que se recopile. El uso de células musculares individuales o múltiples por imagen es a discreción del investigador. La n del experimento se puede determinar realizando un análisis de potencia.
8. Utilice los datos procesados de los pasos 3.2-3.6 para hacer un seguimiento de los valores fluorescentes en el software de gráficos de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
9. A partir de este rastro, medir la cinética del transitorio de calcio, como el aumento de tiempo pico y la mitad del tiempo de descomposición, utilizando las herramientas proporcionadas en el software de gráficos según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Esta técnica evaluó los cambios en los mutantes que se cree que afectan el manejo del calcio o la despolarización muscular. Se visualizaron los niveles basales de fluorescencia y los transitorios fluorescentes y se evaluó la cinética de calcio y calcio citosólico en reposo dentro del músculo. Es importante que los animales fueron cultivados en la retina trans durante al menos tres días para asegurar la incorporación exitosa de la retina, activando así posteriormente la canalrodi...

Discusión

Las GECIs son una herramienta poderosa en neurobiología de C. elegans. El trabajo anterior ha utilizado técnicas de diagnóstico por imágenes de calcio para examinar una amplia variedad de funciones tanto en las neuronas como en las células musculares, incluidas las respuestas sensoriales y conductuales, con diversos métodos de estimulación. Algunos estudios han utilizado estímulos químicos para desencadenar transitorios de calcio en las neuronas ash sensoriales^22,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line