In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Zusammenfassung

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

Zusammenfassung

Der Modellorganismus C. elegans bietet ein ausgezeichnetes System zur Durchführung von In-vivo-Calcium-Bildgebung. Sein transparenter Körper und seine genetische Manipulierbarkeit ermöglichen die gezielte Expression genetisch kodierter Kalziumsensoren. Dieses Protokoll skizziert den Einsatz dieser Sensoren für die In-vivo-Bildgebung der Kalziumdynamik in Zielzellen, insbesondere der Körperwandmuskulatur der Würmer. Durch die Verwendung der Ko-Expression von präsynaptischem Kanalrhodopsin kann die Stimulation der Acetylcholin-Freisetzung aus exzitatorischen motorischen Neuronen mit blauen Lichtimpulsen induziert werden, was zu einer Muskeldepolarisation und reproduzierbaren Veränderungen des zytoplasmatischen Kalziums führt. Ebenen. Zwei Schneckenimmobilisierungstechniken werden mit unterschiedlichen Schwierigkeitsgraden besprochen. Der Vergleich dieser Techniken zeigt, dass beide Ansätze die Physiologie der neuromuskulären Kreuzung erhalten und die reproduzierbare Quantifizierung von Kalziumtransienten ermöglichen. Durch die Kombination von Optogenetik und funktioneller Kalziumbildgebung können Veränderungen der postsynaptischen Kalziumhandhabung und Homöostase in einer Vielzahl mutierter Hintergründe bewertet werden. Die vorgestellten Daten validieren sowohl Immobilisierungstechniken als auch untersucht speziell die Rolle des C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase und des calciumaktivierten BK Kaliumkanals in der Körperwandmuskel-Calciumregulation.

Einleitung

Dieses Papier stellt Methoden zur In-vivo-Calcium-Bildgebung von C. elegans Körperwandmuskeln mit optogenetischer neuronaler Stimulation vor. Die Kombination eines muskelexprimierten genetisch kodierten Kalziumindikators (GECI) mit blauem Licht löste eine neuronale Depolarisation aus und bietet ein System, um die evozierten postsynaptischen Calciumtransienten klar zu beobachten. Dies vermeidet den Einsatz elektrischer Stimulation, was eine nicht-invasive Analyse von Mutanten ermöglicht, die die postsynaptische Kalziumdynamik beeinflussen.

Single-Fluorophor-GECIs, wie GCaMP, verwenden ein einzelnes fluoreszierendes Proteinmolekül, das mit der M13-Domäne der Myosin-Lichtkettenkinase an seinem N-Terminal-Ende und Calmodulin (CaM) am C-Terminus verschmolzen wird. Bei der Kalziumbindung erfährt die CaM-Domäne, die eine hohe Affinität zu Kalzium aufweist, eine Konformationsänderung, die eine nachfolgende Konformationsänderung im fluoreszierenden Protein zur Folge hat, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität¹führt. GCaMP Fluoreszenz ist bei 488 nm angeregt, so dass es ungeeignet ist, in Verbindung mit Channelrhodopsin verwendet zu werden, das eine ähnliche Anregungswellenlänge von 473 nm hat. Um Kalziummessungen mit der Stimulation des Kanalrhodopsins zu koppeln, muss daher das grüne fluoreszierende Protein von GCaMP durch ein rotes fluoreszierendes Protein, mRuby (RCaMP), ersetzt werden. Die Verwendung des muskelausgedrückten RCaMP in Kombination mit der cholinergen motorischen Neuronenexpression von Channelrhodopsin ermöglicht Studien an der neuromuskulären Schnittstelle des Wurms (NMJ) bei gleichzeitiger Anwendung von Optogenetik und funktioneller Bildgebung innerhalb desselben Tieres. ².

Der Einsatz von Channelrhodopsin umgeht die Notwendigkeit der elektrischen Stimulation, um die neuromuskulären Knoten von C. eleganszu depolarisieren, die nur in sezierten Präparaten erreicht werden können, wodurch diese Technik sowohl einfacher zu verwenden als auch präziser zu machen ist. wenn bestimmte Gewebe gezielt werden. Zum Beispiel, Channelrhodopsin wurde zuvor in C. elegans verwendet, um bestimmte Neuronen reversibel zu aktivieren, was entweder zu einer robusten Aktivierung der exzitatorischen oder hemmenden Neuronen^3,4. Der Einsatz einer lichtstimulierten Depolarisation umgeht auch das Problem der neuronalen Schäden durch die direkte elektrische Stimulation. Dies bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen vieler verschiedener Stimulationsprotokolle, einschließlich anhaltender und wiederholter Stimulationen, auf die postsynaptische Kalziumdynamik⁴zu untersuchen.

Die transparenzliche Natur von C. elegans macht es ideal für die fluoreszierende bildgebende funktionelle Analyse. Jedoch, bei der Stimulierung der exzitatorischen Acetylcholin-Neuronen an der NMJ, Tiere werden erwartet, mit einer sofortigen Muskelkontraktion reagieren⁴, so dass die Immobilisierung der Würmer entscheidend bei der Visualisierung diskreter Kalziumveränderungen. Traditionell werden pharmakologische Wirkstoffe verwendet, um die Tiere zu lähmen. Ein solches Medikament verwendet wird, ist Levamisol, ein cholinerge Acetylcholin-Rezeptor-Agonist^5,6,7. Da Levamisol zur anhaltenden Aktivierung eines Subtyps von exzitatorischen Muskelrezeptoren führt, ist dieses Reagenz für die Untersuchung der Muskelkalziumdynamik ungeeignet. Die Wirkung von Levamisol induziert eine postsynaptische Depolarisation, erhöht das zytosolische Kalzium und schließt Beobachtungen nach präsynaptischer Stimulation aus. Um die Verwendung von lähmenden Medikamenten zu vermeiden, untersuchten wir zwei alternative Methoden, um C. elegansimmobilisieren. Die Tiere wurden entweder verklebt und dann aufgeschnitten, um die Körperwandmuskeln freizulegen, ähnlich der bestehenden C. elegans NMJ Elektrophysiologie-Methode⁸, oder Nanoperlen wurden verwendet, um intakte Tiere immobilisieren⁹. Beide Verfahren ermöglichten reproduzierbare Messungen der ruhenden und evozierten Muskelkalziumtransienten, die leicht quantifizierbar waren.

Die Methoden in diesem Papier können verwendet werden, um die grundlegenden zytosolischen Kalziumspiegel und Transienten in postsynaptischen Körperwandmuskelzellen in C. eleganszu messen. Beispiele für Daten, die die beiden verschiedenen Immobilisierungstechniken verwenden, werden genannt. Beide Techniken nutzen die Optogenetik, um die Muskelzellen ohne elektrische Stimulation zu depolarisieren. Diese Beispiele zeigen die Machbarkeit dieser Methode bei der Bewertung von Mutationen, die die postsynaptische Kalziumbehandlung in den Würmern beeinflussen, und weisen auf die Vor- und Nachteile der beiden Immobilisierungsansätze hin.

Protokoll

1. Mikroskop-Setup

1. Verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop mit Fluoreszenzfähigkeiten. Für diese Studie wurden Daten auf einem aufrechten Mikroskop(Materialtabelle) gesammelt, das zur Anregung mit LEDs ausgestattet war.
2. Um Fluoreszenzänderungen in den Körperwandmuskeln richtig zu visualisieren, verwenden Sie ein zielweises hohe Vergrößerung.
   1. Für sezierte Präparate verwenden Sie ein 60x NA 1.0 Wasserimmerziel (Materialtabelle).
   2. Für Präparate mit Nanoperlen verwenden Sie ein 60x NA 1.4 Öl Immersion objektiv (Tabelle der Materialien). Diese Vergrößerung sorgt für eine ausreichende Auflösung der Muskeln auf den Kamerasensor.
3. Verwenden Sie eine hochempfindliche Kamera, die am Mikroskop befestigt ist, um Bilder mit einer hohen Bildrate zu erfassen, um schnelle Veränderungen des Kalziumspiegels zu verfolgen. Für diese Studie, Bild mit einem sCMOS-System (Tabelle der Materialien) in der Lage, Vollbild-Bildgebung bei 100 Hz, wie Anstiegszeiten für die Ca²⁺ Signale können so schnell wie Dutzende von Millisekunden sein.
4. Steuerung der Kameraaufnahme und LED-Fluoreszenzanregung mit einer Micro-Manager-Software, die in ImageJ¹⁰ gemäß den Anweisungen des Herstellers läuft (Materialtabelle).
5. Verwenden Sie ein Open-Source-E-Mail-Plugin, das ein externes Open-Source-Mikrocontroller-Board (Tabelle der Materialien )verbindet, um die externen Timing-Impulse zu verwalten, um die Fluoreszenzerregung zu steuern.
   HINWEIS: Digitale Outs sind von den digitalen Pins 8 bis 13 verfügbar, die die Ausgangsbits 0 bis 5 bereitstellen. Diese können als Basiswerte von 1, 10, 100 usw. adressiert werden. Die Einstellungen für serielle Ports sind in Tabelle 1 angegeben und auf der Micro-Manager-Website (Materialtabelle )verfügbar. Firmware für das Mikrocontroller-Board ist ebenfalls auf dieser Website verfügbar.
6. Um die Timing-Logik zu steuern, aktivieren Sie das Micromanager-Erfassungsprotokoll in der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Dies initiiert gleichzeitig eine voreingestellte Kamerarahmendauer und die Anzahl der zu aktivierenden Frames sowie den logischen Verschluss und die voreingestellte Gelbe LED für die Fluoreszenzerregung. In diesem Fall wird der gelbe LED-Vollzustandsschalter über den Mikrocontroller-Bit 1-Ausgang durch Pin 9 gesteuert. Die Kamera rahmen TTL (Rückplatte aus 3 Stecker) löst einen Stimulator aus. Dies genau mal die Aktivierung der Blaulicht-LED zur Aktivierung von Channelrhodopsin zu einem festgelegten Zeitpunkt nach Aktivierung der Bildsequenz.
7. Um Channelrhodopsin mit blauem Licht zu stimulieren und RCaMP-Änderungen aufzuzeichnen, verwenden Sie zwei LEDs. Aktivieren Sie Channelrhodopsin mit einer LED mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 470 nm und einem Bandpassfilter (455 bis 490 nm) und erregen Sie RCaMP mit einer LED mit einer Peak-Emissionswellenlänge von 594 nm und einem Bandpassfilter (570 bis 600 nm).
8. Um kanalrhodopsin gleichzeitig zu aktivieren und Veränderungen der RCaMP-Fluoreszenzwerte zu erfassen, beleuchten Sie beide LEDs und übertragen Sie das Licht mit einem dichroitischen Strahlkombinator auf denselben optischen Pfad.
9. Steuern Sie das Timing der LED-Beleuchtung mit Festkörperschaltern(Materialtabelle), die durch TTL-Signale gesteuert werden (maximale Einschaltzeit, 1 ms, Abschaltzeit 0,3 ms: 0 bis 90 % Einschalt- und Ausschaltzeit von < 100 s).
10. Stellen Sie die LED-Intensität mit den stromgesteuerten linearen Netzteilen mit geringem Rauschen ein (Tabelle der Materialien).
11. Um das genaue Timing der Blaulicht-LED zu gewährleisten, aktivieren Sie sie direkt per TTL-Impuls vom Stimulator aus an das Festkörperrelais. Programmieren Sie das Blaulichtstimulationsprotokoll in einen Stimulator (Tabelle der Materialien), der als präziser Timer vom Beginn der Bildaufnahme bis zur blauen LED-Beleuchtung fungiert. Schalten Sie in diesem Experiment die Blaulichtstimulation nach 2 s nur rCaMP-Fluoreszenz ein und verwenden Sie einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulsintervallen, um Channelrhodopsin zu aktivieren.
    HINWEIS: Die Verzögerung vor blaulichten Impulsen, die Dauer der Blaulichtimpulse, die Zeit zwischen den Impulsen und die Anzahl der Impulse im Zug können an dieser Stelle eingestellt werden und sollten die spezifischen Parameter von experimentellem Interesse widerspiegeln.

2. C. elegans Probenvorbereitung und Datenerfassung

1. Um präsynaptische Neuronen optisch zu stimulieren, erhalten Tiere, die Kanalrhodopsin in exzitatorischen cholinergen Neuronen exprimieren, angetrieben mit der Unc-17-Promotorregion, und RCaMP, ausgedrückt in allen Körperwandmuskeln, die mit dem Myo-3-Promotor angetrieben werden Region².
   HINWEIS: Es wird nur die Verwendung von Tieren mit integrierten Transgenen und robusten Fluoreszenzgehalten empfohlen, da die variable Expression in den entsprechenden Zelltypen die Zuverlässigkeit der Datenerfassung beeinträchtigen kann.
2. Machen Sie einen Arbeitsbestand vonAll-Trans-Retinal durch Verdünnung der Netzhautpulver ( Tabelle derMaterialien) in Ethanol, um eine endgültige Konzentration von 100 mM zu schaffen und lagern bei -20 °C. Dieser Arbeitsbestand wird für etwa ein Jahr stabil bleiben.
3. Erstellen Sie einen Bestand von OP50 E. coli, der in LB-Medien angebaut wird, ergänzt durchAll-Trans-Retinal aus dem Arbeitsbestand in Schritt 2.2, bei einer Endkonzentration von 80 m. Das für den OP50+Retinal-Bestand verwendete Volumen hängt von der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Platten ab.
4. Samennematoden-Wachstumsmedienplatten (NGM) mit ca. 300 l op50+retinalen Vorrat und lassen Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht trocknen.
5. Wachsen C. elegans Stämme bis zum gewünschten Alter im Dunkeln auf OP50 + retinale NGM Platten bei 20 °C. Verwenden Sie für dieses Experiment erwachsene Würmer.
   1. Für das Experiment mit der sezierten Zubereitung, verwenden Sie nur gravid erwachsene Würmer als Durchführung der Sezieren an jüngeren, kleineren Tieren ist extrem anspruchsvoll. Lassen Sie die Tiere für eine effektive Kanalrhodopsin-Aktivierung mindestens 3 Tage auf den OP50-Retinalen Platten.
6. Wenn Sie das sezierte Präparat^8,11 (Abbildung 1A) verwenden, führen Sie Sezierungen bei schwachem Licht durch.
   1. Legen Sie die Tiere in eine Sezierensteller mit einer silikonbeschichteten Deckslipbasis, die mit einer 1 mM Ca²⁺ extrazellulären Lösung bestehend aus 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 10 mM Glukose, 5 mM Saccharose und 15 mM HEPES (pH 7.3) gefüllt ist. , -340 Osm).
   2. Kleben Sie Tiere mit dem flüssigen topischen Hautkleber mit blauer Färbung entlang der Dorsalseite des Wurms und machen Sie einen seitlichen Cuticle-Schnitt entlang der Leim-Wurm-Schnittstelle mit Glasnadeln.
   3. Verwenden Sie eine Mundpipette, um die innere Eingeweide aus der Wurmhöhle zu löschen.
   4. Kleben Sie die Nagelhautklappe des Tieres herunter, um die ventralen medialen Körperwandmuskeln für die Bildgebung freizulegen.
7. Bei Verwendung des Nanoperlenpräparats (Abbildung 1B)
   1. Machen Sie eine geschmolzene 5% Agarose-Lösung mit ddH₂O bis zu einem Endvolumen von 100 ml.
   2. Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose-Lösung auf eine Glasrutsche legen und sofort eine zweite Glasrutsche über die Oberseite legen, senkrecht zur ersten, mit sanftem Druck, um ein gleichmäßiges Agarose-Pad zu schaffen. Entfernen Sie die obere Folie vor der Verwendung.
   3. Fügen Sie etwa 4 L Polystyrol-Nanoperlen (Tabelle der Materialien) in die Mitte des Agarose-Pads.
   4. Wählen Sie bei schwachem Licht 4-6 C. Elegane in die Nanobead-Lösung, um sicherzustellen, dass die Tiere nicht übereinander liegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlappen auf die Oberseite.
8. Legen Sie die vorbereitete Rutsche oder Sezierschale auf das Mikroskop, und finden und konzentrieren Sie sich auf einen Wurm mit 10-facher Vergrößerung und trüber heller Feldbeleuchtung.
9. Wechseln Sie zu 60x Vergrößerung und RCaMP Fluoreszenzerregung, um einen ventromedialen Körperwandmuskel zu identifizieren, der vor der Vulva und in der richtigen Fokalebene ist.
   HINWEIS: Muskeln, die der Vulva voranstehen, werden ausgewählt, da sie Muskeln reflektieren, die häufig in elektrophysiologischen Experimenten stimuliert werden.
10. Ändern Sie den Bildweg vom Okular zur Kamera, indem Sie den Umschalter herausziehen und innerhalb der Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien )auf Live klicken.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsweg für blaues Licht an dieser Stelle ausgeschaltet ist, um sicherzustellen, dass das Channelrhodopsin vor der Aufnahme von Bildern nicht aktiviert wird.
11. Fokussieren Sie das Bild innerhalb der Datenerfassungssoftware mit dem Mikroskop Feinfokus.
12. Sobald der Muskel klar im Fokus ist, schalten Sie das Live-Bild aus, indem Sie auf die Live-Taste klicken.
13. Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche in der Datenerfassungssoftware, und erstellen Sie eine Box um den Muskel, auf den sie fokussiert sind.
14. Schalten Sie am Stimulator den zuvor in Schritt 1.10 programmierten Blaulichtstimulationsweg ein.
15. Klicken Sie in der Bildverarbeitungssoftware auf Übernehmen, um das Bild über die CMOS-Kamera zu erfassen. Stellen Sie dazu die Belichtungszeit mit 1.000 Frames und 2x Binning auf 10 s ein.

3. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Datendatei in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) und skizzieren Sie mit dem Polygon-Toolden Interessensmuskel. Das ist der ROI.
2. Gehen Sie zu Bild | Stapel | Plotten Sie das Z-Achsenprofil und exportieren Sie die resultierenden Datenpunkte in die Tabellenkalkulationssoftware (Tabelle der Materialien). Diese Funktion zeichnet den Mittelwert der ROI-Auswahl im Vergleich zum Zeitpunkt.
3. Verschieben Sie den Mitdemkraft-ROI des Muskels, der mit dem Polygon-Werkzeug außerhalb des Tieres erstellt wurde, um eine Fluoreszenzmessung im Hintergrund mithilfe der in 3.2 beschriebenen Schritte zu erhalten. Exportieren Sie die resultierenden Daten in die Tabellenarbeitsmappe.
4. Subtrahieren Sie in der Tabellenarbeitsmappe die Hintergrundfluoreszenzwerte von den Muskelfluoreszenzwerten zu jedem Zeitpunkt. Dadurch wird das im Hintergrund subtrahierte Fluoreszenzsignal zur Verfügung.
5. Durchschnitt der im Hintergrund subtrahierten Fluoreszenz für die ersten 2 s Datenpunkte. Dadurch wird die Basisfluoreszenzmessung F.
6. Verwenden Sie die Basisfluoreszenzmessung, um den normalisierten Fluoreszenzpegel zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Verwenden Sie dazu die Gleichung (F/F)+1. F steht für (F(t)-F), wobei F(t) die Fluoreszenzmessung zu einem bestimmten Zeitpunkt und F der Basiswert ist. Die +1 wird als y-Achsenversatz hinzugefügt.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.6 für jedes gesammelte Muskelbild. Die Verwendung einzelner oder mehrerer Muskelzellen pro Bild liegt im Ermessen des Forschers. Das n des Experiments kann durch durchführung einer Leistungsanalyse bestimmt werden.
8. Verwenden Sie die verarbeiteten Daten aus den Schritten 3.2-3.6, um eine Spur der Fluoreszenzwerte in der Graphik-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien) zu erstellen.
9. Messen Sie anhand dieser Spur die Kinetik des Kalziumtransienten, wie z. B. Anstieg auf Spitzenzeit und halbzerfallszeit, mit den Indizierungswerkzeugen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Diese Technik bewertete Veränderungen bei Mutanten, von denen angenommen wird, dass sie die Kalziumhandhabung oder Muskeldepolarisation beeinflussen. Die Grundfluoreszenzspiegel und fluoreszierenden Transienten wurden visualisiert und ruhende zytosolische Kalzium- und Calciumkinetik innerhalb des Muskels wurden ausgewertet. Es ist wichtig, dass die Tiere mindestens drei Tage lang auf All-Trans-Retina angebaut wurden, um die erfolgreiche Integration der Netzhaut zu gewährleisten und so a...

Diskussion

GECIs sind ein leistungsfähiges Werkzeug in c. elegans Neurobiologie. Frühere Arbeiten haben Kalzium-Bildgebungstechniken verwendet, um eine Vielzahl von Funktionen in Neuronen und Muskelzellen zu untersuchen, einschließlich sensorischer und Verhaltensreaktionen, mit verschiedenen Methoden der Stimulation. Einige Studien haben chemische Reize verwendet, um Kalziumtransienten in sensorischen ASH-Neuronen^22,23 auszulösen oder Kalziumwellen in den Rache...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line