В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

Резюме

Этот метод обеспечивает способ для пары оптогенетики и генетически закодированных датчиков кальция для изображения базовых уровней цитосолика кальция и изменения в вызванных переходных кальция в мышцах стенки тела модельного организма C. elegans.

Аннотация

Модель организма C. elegans обеспечивает отличную систему для выполнения виво-изображения кальция. Его прозрачное тело и генетическая манипулируемость позволяют целенаправленно выражать генетически закодированные датчики кальция. Этот протокол описывает использование этих датчиков для in vivo изображения динамики кальция в целевых клетках, в частности, мышцы стенки тела червей. Используя совместное выражение пресинаптического каналародопсина, стимуляция ацетилхолина от возбуждающих моторных нейронов может быть индуцирована с помощью импульсов синего света, что приводит к деполяризации мышц и воспроизводимым изменениям цитоплазмического кальция Уровней. Два червя иммобилизации методы обсуждаются с различными уровнями сложности. Сравнение этих методов показывает, что оба подхода сохраняют физиологию нервно-мышечного соединения и позволяют воспроизводимую количественную оценку переходных кальция. При сопряжении оптогенетики и функциональной визуализации кальция, изменения в постсинаптической обработки кальция и гомеостаза могут быть оценены в различных мутантных фонов. Представленные данные подтверждают как методы иммобилизации, так и конкретно рассматривают сяосматривает роли C. elegans sarco (endo)plasmic reticular calcium ATPase и кальциевый канал BK калия в регуляции кальция мышцы стенки тела.

Введение

В этой статье представлены методы для in vivo изображения кальция C. elegans мышцстены тела с использованием оптогенетической стимуляции нейронов. Сопряжение мышцы, выраженной генетически закодированным индикатором кальция (GECI) с синим светом, спровоцировав нейрональную деполяризацию и обеспечивает систему для четкого наблюдения вызываемых постсинаптических переходных кальций. Это позволяет избежать использования электрической стимуляции, что позволяет неинвазивный анализ мутантов, влияющих на динамику постсинаптического кальция.

Однофторофорные ГКИ, такие как GCaMP, используют одну флуоресцентную молекулу белка, сливную с доменом M13 миозиновой легкой цепи киназы в конце N-терминала и стодулина (CAM) в C-терминине. После связывания кальция, домен CaM, который имеет высокое сродство к кальцию, подвергается конформационным изменениям, вызывая последующее конформационное изменение флуоресцентного белка, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции^1. GCaMP флуоресценция возбужденных на 488 нм, что делает его непригодным для использования в сочетании с channelrhodopsin, который имеет аналогичную длину волн возбуждения 473 нм. Таким образом, для того, чтобы соединить измерения кальция со стимуляцией channelrhodopsin, зеленый флуоресцентный белок GCAMP должен быть заменен красным флуоресцентным белком, мруби (RCaMP). Использование мышцы выразилRCaMP, в сочетании с холинергической двигательной нейронной экспрессии channelrhodopsin, позволяет исследования на червя нервно-мышечного соединения (NMJ) с одновременным использованием оптогенетики и функциональной визуализации в рамках одного и того же животного ².

Использование channelrhodopsin обходит необходимость электрической стимуляции для деполяризации нервно-мышечных соединений C. elegans, которые могут быть достигнуты только в расчлененных препаратов, что делает этот метод как легче использовать и более точным при ориентации на конкретные ткани. Например, channelrhodopsin ранее был использован в C. elegans для обратимой активации конкретных нейронов, что приводит либо к надежной активации возбуждательных или ингибирующих нейронов^3,4. Использование светостимулируемой деполяризации также обходит вопрос о повреждении нейронов из-за прямой электрической стимуляции. Это дает возможность изучить влияние многих различных протоколов стимуляции, в том числе устойчивых и повторяющихся стимуляций, на постсинаптической динамике кальция⁴.

Прозрачный характер C. elegans делает его идеальным для флуоресцентного изображения функционального анализа. Однако, при стимулировании возбуждающих ацетилхолина нейронов на NMJ, животные, как ожидается, реагировать с немедленной сокращения мышц⁴, что делает иммобилизацию червей решающее значение в визуализации дискретных изменений кальция. Традиционно, фармакологические агенты были использованы, чтобы парализовать животных. Одним из таких препаратов используется левамизол, холинергический ацетилхолин рецептор агониста^5,6,7. Так как левамизол приводит к постоянной активации подтипа возбуждающих мышечных рецепторов, этот реагент не подходит для изучения динамики мышечного кальция. Действие левамизола вызывает постинаптическую деполяризацию, повышение цитозолического кальция и окклюзионные наблюдения после пресинаптической стимуляции. Чтобы избежать применения парализующих препаратов, мы рассмотрели два альтернативных метода обездвиживания C. elegans. Звери были либо склеены, а затем расчленены открытыми, чтобы разоблачить мышцы стенки тела, похожие на существующие C. elegans NMJ электрофизиологии метод⁸, или нанобусы были использованы для обездвиживания нетронутых животных⁹. Обе процедуры позволили для воспроизводимых измерений отдыха и вызвали мышечного кальция переходных, которые были легко поддаются количественной оценке.

Методы в этой работе могут быть использованы для измерения базовых уровней цитосолика кальция и переходных в постсинаптических клеток мышц стенки тела в C. elegans. Приводятся примеры данных, использующих два различных метода иммобилизации. Оба метода воспользоваться оптогенетики деполяризации мышечных клеток без использования электрической стимуляции. Эти примеры демонстрируют осуществимость этого метода при оценке мутаций, которые влияют на постсинаптическую обработку кальция у червей, и указывают на плюсы и минусы двух иммобилизационных подходов.

протокол

1. Установка микроскопа

1. Используйте сложный микроскоп с возможностями флуоресценции. Для этого исследования были собраны данные по вертикальному микроскопу(Таблица материалов),оснащенному светодиодами для возбуждения.
2. Для того, чтобы правильно визуализировать изменения флуоресценции в мышцах стенки тела, используйте цель высокого увеличения.
   1. Для вскрытия препаратов используйте цель погружения воды 60x NA 1.0(Таблица материалов).
   2. Для приготовления с использованием нанобий, используйте 60x NA 1.4 цель погружения масла(Таблица материалов). Это увеличение обеспечивает достаточное разрешение мышц на датчик камеры.
3. Используйте камеру высокой чувствительности, прикрепленную к микроскопу, для захвата изображений с высокой частотой кадров, чтобы отслеживать быстрые изменения в уровнях кальция. Для этого исследования, изображение с системой sCMOS (Таблица материалов), способный полный кадр изображения на 100 Гц, как время подъема для сигналов Ca^{2 "может} быть столь же быстрым, как десятки миллисекунд.
4. Управление приобретением камеры и светодиодной флуоресценцией с помощью программного обеспечения микро-менеджера, работая в ImageJ¹⁰ в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
5. Используйте электронный плагин с открытым исходным кодом, который соединяет внешнюю доску микроконтроллера с открытым исходным кодом(Таблица материалов),чтобы управлять внешними импульсами синхронизации для управления возбуждением флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровые выходы доступны из цифровых контактов от 8 до 13, обеспечивая выходные биты от 0 до 5. Они могут быть рассмотрены в качестве базовых 2 значений 1, 10, 100 и т.д. Параметры серийных портов указаны в таблице 1 и доступны на веб-сайте микроменеджера(Таблица материалов). Прошивка для микроконтроллерной платы также доступна на этом веб-сайте.
6. Чтобы контролировать логику синхронизации, активируйте протокол приобретения микроменеджера в программном обеспечении в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это одновременно инициирует заданные кадры камеры продолжительность и количество кадров, которые будут активированы, а также логический затвор и предустановленный светодиод янтаря для флуоресценции возбуждения. В этом случае янтарный светодиодный твердотельный переключатель управляется микроконтроллером, отбиваемым 1 выходом через контактный 9. Камера кадры из TTL (задняя пластина из 3 разъема) вызывает стимулятор. Это точно раз активации синего света светодиоддля активации channelrhodopsin в установленное время после активации последовательности изображений.
7. Для стимуляции канала с синим светом и записи Изменений RCaMP, используйте два светодиода. Активировать каналродопсин со светодиодом с пиковой длиной волны выбросов 470 нм и фильтром полосы (455 до 490 нм) и возбудить RCaMP со светодиодом с пиковой длиной волны выбросов 594 нм и фильтром bandpass (570 до 600 нм).
8. Для того, чтобы одновременно активировать каналродопсин и захватить изменения в rCaMP флуоресцентных уровней, совместно освещать оба светодиода и передать свет на тот же оптический путь с помощью дихроического пучка комбайна.
9. Контролируйте время светодиодной подсветки с помощью твердотельных выключателей(Таблица материалов),управляемых сигналами TTL (максимально рассчитанное время включения, 1 мс, время выключения 0,3 мс: от 0 до 90% включения и выключение времени lt; 100 s).
10. Установите интенсивность светодиодов с текущим контролируемым низким уровнем шума линейных источников питания(Таблица материалов).
11. Для обеспечения точного времени светодиода синего света активируйте его непосредственно импульсом TTL в твердотельную ретранслятор от стимулятора. Программа синий протокол стимуляции света в стимулятор(Таблица материалов), который выступает в качестве точного таймер с начала приобретения изображения до синего светодиодного освещения. В этом эксперименте, включите синего света стимуляции после 2 с захвата RCaMP флуоресценции только и использовать поезд 5, 2 мс синий свет импульсов с 50 мс межпульсовых интервалов для активации channelrhodopsin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка перед импульсами синего света, продолжительность импульсов синего света, время между импульсами, и количество импульсов в поезде все могут быть установлены в этой точке и должны отражать конкретные параметры экспериментального интереса.

2. C. elegans подготовка образца и получение данных

1. Чтобы оптически стимулировать пресинаптических нейронов, получить животных, выражающих channelrhodopsin в возбуждающих холинергических нейронов, управляемых с unc-17 промоутер области, и RCaMP выражается во всех мышц стенки тела приводом с мио-3 промоутер регион².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать только животных со встроенными трансгенами и устойчивыми уровнями флуоресценции, поскольку переменное выражение в соответствующих типах клеток может повлиять на надежность получения данных.
2. Сделать рабочий запасвсе-транс жетины путем разбавления порошок женеливой(Таблица материалов) в этанол, чтобы создать окончательную концентрацию 100 мм и хранить при -20 градусов по Цельсию. Этот рабочий запас будет стабильным в течение примерно одного года.
3. Создайте запас OP50 E. coli,выращенный в LB-медиа, дополненный все-транс-жеренной из рабочего запаса, сделанного в шаге 2.2, при конечной концентрации 80 мкм. Объем, используемый для ОП50-ретинального запаса, будет зависеть от количества пластин, необходимых для эксперимента.
4. Семена нематод роста средств (NGM) пластины с примерно 300 л из OP50 "ретинального запаса и позволяют пластины высохнуть на ночь при комнатной температуре в темноте.
5. Выращивайте C. elegans штаммов до желаемого возраста в темноте на OP50'retinal NGM пластин при 20 градусах Цельсия. Для этого эксперимента используйте взрослых червей.
   1. Для эксперимента с использованием вскрытых подготовки, только использовать gravid взрослых червей, как выполнение вскрытия на молодых, мелких животных является чрезвычайно сложной задачей. Оставьте животных на OP50-ретинальных пластин на не менее 3 дней для эффективной активации канала.
6. При использовании расчлененный препарат^8,11 (Рисунок 1А),выполнять вскрытия в низкой освещенности.
   1. Поместите животных в рассекающее блюдо с силиконовым покрытием крышкой базы, которая заполнена 1 мМ Ca 2 "внеклеточное решение состоит из 150 мМ NaCl, 5 мм KCl, 1 мМ CaCl₂, 4 мМ MgCl₂, 10 мм глюкозы, 5 мм сахарозы, и 15 мМ HEPES (pH 7.3 , -340 Осм).
   2. Клей вниз животных, используя жидкость актуальные кожи клей с голубой окраской вдоль содвождения стороне червя и сделать боковой разрез кутикулы вдоль клея / червя интерфейс с помощью стеклянных игл.
   3. Используйте пипетку для очистки внутренней внутренности от полости червя.
   4. Клей вниз кутикулы лоскут животного подвергать брюшной медиальной мышцы стенки тела для визуализации.
7. При использовании препарата нанобивок(рисунок 1B)
   1. Сделайте расплавленный 5% агарозный раствор с помощью ddH₂O до конечного объема 100 мл.
   2. Используя пипетку Pasteur, поместите каплю расплавленного раствора агарозы на стеклянную горку и немедленно поместите вторую стеклянную горку поверх, перпендикулярно первому, используя нежное давление, чтобы создать ровную агарозную площадку. Удалите верхний слайд перед использованием.
   3. Добавьте примерно 4 злитрона нанобусов полистирола(Таблица материалов)к середине агарозной площадки.
   4. При слабом освещении выберите 4-6 C. elegans в раствор нанобищ, убедившись, что животные не лежат друг на друге, и аккуратно поместите крышку сверху.
8. Поместите подготовленную горку или блюдо вскрытия на микроскоп, и найти и сосредоточиться на червя с помощью 10x увеличение и тусклый яркое освещение поля.
9. Переключитесь на 60-кратное увеличение и возбуждение флуоресценции RCaMP для определения вентромедиаальной мышцы стенки тела, которая является передней к вульве и в правильной координационной плоскости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы передвульвиной выбраны, поскольку они отражают мышцы обычно стимулируются в экспериментах электрофизиологии.
10. Измените путь изображения от окуляра к камере, потянув за переключатель и нажав Live в рамках программного обеспечения для сбора данных (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что синий свет стимуляции путь выключен в этой точке, чтобы убедиться, что channelrhodopsin не активируется перед захватом изображений.
11. Сосредоточьте изображение в программном обеспечении для сбора данных с помощью тонкого фокуса микроскопа.
12. После того, как мышца явно в фокусе, выключите живое изображение, отключив кнопку Live.
13. Нажмите кнопку рентабельности инвестиций в программном обеспечении для сбора данных и создайте окно вокруг мышц, на которых сосредоточено внимание.
14. На стимуляторе включите путь стимуляции синего света, который ранее был запрограммирован в шаге 1.10.
15. Нажмите Приобрести в изображении программного обеспечения для захвата изображения через камеру CMOS. Для этого установите время экспозиции до 10 с 1000 кадров и 2x binning.

3. Анализ данных

1. Откройте файл данных в программном обеспечении для визуализации(Таблица материалов)и, используя инструмент Polygon, наметить мышцы интереса. Это рентабельность инвестиций.
2. Перейти к изображению Стеки Участок профиля оси и экспортировать полученные точки данных в программное обеспечение электроннойтаблицы (Таблица материалов). Эта функция указывает на среднее значение выбора ROI по сравнению с точкой времени.
3. Перемещение мышечной рентабельности, созданной с помощью инструмента Polygon за пределами животного, чтобы получить фон флуоресценции измерения с помощью шагов, изложенных в 3.2. Экспорт полученных данных в электронную таблицу.
4. В таблице таблицы учебник, вычесть фоновых значений флуоресценции из значений флуоресценции мышц в каждой временной точке. Это обеспечивает фон вычитается люминесцентный сигнал.
5. Среднее фон вычитается флуоресценции для первых 2 с точек данных. Это даст базовые измерения флуоресценции, F.
6. Используйте базовые измерения флуоресценции для расчета нормализованного уровня флуоресценции в каждой временной точке. Для этого используйте уравнение (ЗФ/Ф)1. ЗФ представляет (F(t)-F), где F(t) является измерением флуоресценции в любой момент времени, а F является базовым значением. No 1 добавляется в качестве смещения y-оси.
7. Повторите шаги 3.2-3.6 для каждого собранного мышечного изображения. Использование одиночных или множественных мышечных клеток на изображение находится на усмотрение исследователя. N эксперимента можно определить путем выполнения анализа мощности.
8. Используйте обработанные данные из шагов 3.2-3.6, чтобы сделать след флуоресцентных значений в программном обеспечении для графиков в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
9. Из этого следа, измерить кинетику кальция переходных, таких как подъем к пиковому времени и половина времени распада, используя инструменты, представленные в программном обеспечении для графиков в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

Этот метод оценивал изменения в мутантах, как полагают, влияют на обработку кальция или деполяризацию мышц. Базовые уровни флуоресценции и флуоресцентные переходные были визуализированы и отдыхациозного кальция и кинетики кальция в мышцах были оценены. Важно, чтобы ?...

Обсуждение

GECIs являются мощным инструментом в C. elegans нейробиологии. Предыдущая работа использовала методы визуализации кальция для изучения широкого спектра функций в нейронах и мышечных клетках, включая сенсорные и поведенческие реакции, с различными методами стимуляции. Некоторые исслед?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
all-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED			RCaMP illumination
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	Controls fluorescence illumination
Blue LED			channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope	Olympus		Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply	Ametek	Sorenson	Controls LED intensity
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	Graphing software
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4	Olympus		Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator	A.M.P.I		Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager		micro-manager.org	Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera	pco.	4.2	High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4	Olympus		Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres	Polysciences, Inc.	00876-15	For worm immobilization
solid state switches	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab	SY1627	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond Lab		Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk Lab	ZX1659	Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line