Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Summary

التقنيات التقليدية المستندة إلى كدنا overexpression انطباقاً محدودا overexpression الكشف فضله منذ فترة طويلة بسبب أشكالها لصق متعددة مع الوظائف المحتملة. هذا الاستعراض تقارير بروتوكول باستخدام تكنولوجيا كريسبر إلى أوفيريكسبريس متعددة المتغيرات لصق الحمض النووي الريبي فضله منذ وقت طويل.

Abstract

منذ فترة طويلة فضله الحمض النووي الريبي (لنكرنا) البيولوجيا حقل جديد ومثير للبحوث، مع عدد المنشورات من هذا الحقل تزايد أضعافاً مضاعفة منذ عام 2007. هذه الدراسات قد أكدت على أن يتم تغيير لنكرناس في تقريبا جميع الأمراض. بيد دراسة الأدوار الوظيفية لنكرناس في سياق المرض لا يزال صعباً بسبب عدم وجود منتجات البروتين، التعبير الخاصة بالانسجة، مستويات منخفضة من التعبير، والتعقيدات في لصق الأشكال، وعدم الحفظ فيما بين الأنواع. نظراً للتعبير إبلاغها، دراسات لنكرنا غالباً ما تنحصر في سياقات البحوث البشرية عند دراسة عمليات المرض. حيث تعمل لنكرناس على المستوى الجزيئي، هو طريقة واحدة لتشريح الأحياء لنكرنا إزالة لنكرنا أو أوفيريكسبريس لنكرنا وقياس آثار الخلوية. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مكتوب وتصور أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. كتجربة ممثل، يرد لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، انترفيرون غاما Antisense 1 (إيفنج-AS1)، أن overexpressed في نموذج جوركات تي خلية. لإنجاز هذا، استخدام التقنية يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) بتفعيل متفاوت المسافات لتمكين أوفيريكسبريشن في المكاني الجينوم الذاتية. التقنية كريسبر تفعيل الأهداف مجموعة من عوامل النسخ إلى موقع بدء النسخي الجينات، تمكن overexpression قوية متعددة الأشكال لصق لنكرنا. هذا الإجراء سيتم تقسيمها إلى ثلاث خطوات، هي: (ط) دليل الحمض النووي الريبي (جرنة) التصميم وناقلات البناء والجيل (الثاني) فيروس وتوصيل والفرز (ثالثا) مستعمرة ل overexpression. لهذه التجربة التمثيلية، أكبر مما لوحظ تعزيز برنامج في IFNG-AS1 في خلايا تي جوركات.

Introduction

حين ركزت البحوث الطبية الحيوية الأكثر على نصوص ترميز البروتين، يتألف غالبية الجينات يدون فعلا الكشف فضله (الإصدار انسيمبل 93). البحث الحالي هو بداية لاستكشاف هذا المجال، مع عدد المنشورات بشأن لنكرناس في عمليات المرض ترتفع أضعافاً مضاعفة بين 2007 و 2017¹. هذه المنشورات تبين أن الكثير من لنكرناس ترتبط بالمرض. ومع ذلك، يصعب الآليات الجزيئية لهذه لنكرناس من الدراسة بسبب وظائفها المتنوعة بالمقارنة مع مرناس. مما يضاعف من مشكلة فهم دور لنكرناس في المرض، لنكرناس غالباً ما يعبر عنها مستويات أدنى من الترميز الكشف². بالإضافة إلى ذلك، لنكرناس هي سيئة حفظت، مما يحد من الدراسات الفنية في تقنيات الإنسان-خط-يستند إلى الخلية³. أسلوب واحد لدراسة إليه هذه الجينات الجديدة اندوجينوسلي أوفيريكسبريس لهم في الخلايا المستزرعة. الدراسات overexpression يمكن أن توفر معلومات أساسية بشأن الوظيفة الجينات محددة وتمكن الباحثين من تشريح المسارات الجزيئية الرئيسية.

يستند أسلوب جديد لتفعيل نسخ جينات لنكرنا كريسبر التقنيات المتقدمة في البداية المختبرات جيرسباتش⁴. هذا البروتوكول قد تم تكييفها للاستخدام في علم الأحياء لنكرنا و للتعبير عن هذه الجينات في نظم نموذجية أخرى. في كريسبر overexpressing تقنية، بروتين يسمى البروتين المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) يمكن أن توجه نحو تسلسل الحمض النووي عن طريق جرنة العقاقير يتم التعرف عليه بواسطة Cas9. عادة، سوف تحفز Cas9 الانقسام والحمض النووي؛ ومع ذلك، إلغاء الطفرات في Cas9، سبق أن وضعت لهذه التقنية أوفيريكسبريشن، هذه الخطوة⁵. عندما يتم تنصهر فيها منشط النسخي Cas9 "ميتة" (dCas9)، ويمكن أن overexpression الذاتية من لنكرناس ترانسدوسيد في خطوط الخلايا، حققت^4،6. إضافة تعديلات إضافية لجرنا، تمكين عوامل النسخي إضافية لربط جرنا، زيادة كفاءة نظام التنشيط الجيني dCas9 إذ⁷. الأهم من ذلك، اتضح أن يتطلب التنشيط النسخي مقربة (< 200 شركة بريتيش بتروليوم) النسخي ابدأ الجينات الموقع، تمكن من أوبريجوليشن محددة في المناطق الغنية جين⁷. خلافا لتكنولوجيات بالضربة القاضية كريسبر، أشرطة dCas9 وجرنة بحاجة إلى أن تدمج في الجينوم للسماح للخلايا للاحتفاظ أوفيريكسبريشن على مدى أجيال متعددة. أسلوب واحد لتحقيق هذا الهدف استخدام لينتيفيروسيس لدمج الأشرطة التي تحتوي على dCas9 وجرنة. بعد التكامل، يمكن تحديد التعبير الجيني لنكرنا.

في هذه المقالة، سوف يتجلى بروتوكول أوفيريكسبريشن لنكرنا في نموذج جوركات تي خلية. إجراء خطوة بخطوة ويمكن تكييفها أيضا للخلايا ملتصقة.

Protocol

ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يستخدم lentiviruses تفتقر إلى النسخ المتماثل. تنفيذ معالجة الفيروسية إلا بعد التدريب على السلامة مختبر المناسبة. بليتش جميع البنود والأسطح التي تأتي في اتصال مع فيروسات حية للحد أدنى من 10 دقيقة بعد المناولة. استخدام حماية الوجه/العين ومعطف معمل المتاح، فضلا عن قفازات مزدوج، في جميع الأوقات. أداء عمل الفيروس في السلامة الأحيائية المستوى 2 + مختبرات مع شهادة الفيروسية. أهدى أغطية زراعة الأنسجة وحاضنات الأعمال الفيروسية.

1. ناقلات تصميم و توليد

ملاحظة: أفضل طريقة لتحديد تسلسل جرنة لاستخدام أدوات التصميم على الإنترنت (على سبيل المثال، http://crispr-era.stanford.edu) (تكميلية الشكل 1: تصميم جرنة). للتجربة التمثيلية المصاحبة، شركة تصميم وإنشاء ناقلات جرنة المستخدمة في تجربة تمثيلية. كما تم شراء بلازميد dCas9 على الإنترنت.

1. تسلسل جرنة يقع المنبع لتسلسل النوكليوتيدات "نج"، حيث "N" هو أي النوكليوتيدات، الذي أيضا ضمن أزواج قاعدة 100 موقع النسخي ابدأ. البحث في قواعد البيانات الوراثية مثل بلاط (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) للتسلسل جرنة، للتأكد من أن هناك لا مواقع أخرى في الجينوم مع تسلسل مماثلة (تكميلية الشكل 2: بلاط). وهذا سيضمن أن تسلسل جرنا فريدة من نوعها للجينات للفائدة (غوي).
2. تخزين والبلازميدات جرنة و dCas9، التي تأتي كبذرة البكتيرية، عند 4 درجة مئوية. متواصلة من الإشريكيّة القولونية في لوريا أجار مرق (رطل) لوحة مع الأمبيسلّين (تكميلية الجدول 1) وتنمو هذه البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. اختيار مستعمرة وتنمو البكتيريا في 5 مل رطل مع الأمبيسلّين (تكميلية الجدول 1) بين عشية وضحاها، قوة تهز اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي إضافة 2 مل من البكتيريا إلى 200 مل رطل مع الأمبيسلّين تنمو في قارورة 2 لتر، قوة تهز قارورة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية.
4. تدور إلى أسفل بالبكتيريا في س 3,724 ز لإزالة الوسائط 20 دقيقة ومكان الأنبوب الذي يحتوي على البكتيريا على الجليد.
5. تنقية الحمض النووي البكتيري باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد الواحدة والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   ملاحظة: مجموعات تنقية بلازميد يحتوي على المخزن المؤقت لاستثارة الملكية وتحلل المخزن المؤقت والمخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، والمخزن المؤقت للموازنة وشطف المخزن المؤقت.
   1. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت لاستثارة من الطقم للبكتيريا وبيبيت البكتيريا في الحل. ثم أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل من الطقم للبكتيريا ريسوسبينديد ومزجها بعكس الأنبوب. انتظر 5 دقائق للبكتيريا؛ ثم أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتحييد المثلج من الطقم للبكتيريا ليسيد ومزجها بعكس الأنبوب.
   2. حجته العمود الحمض النووي من هذه المجموعة مع 10 مل من المخزن المؤقت للموازنة لأدنى 5 صب العينات في العمود الحمض النووي تصفية واسمحوا أن الحل يمر من خلال عامل تصفية.
   3. تغسل العينات 2 x مع 30 مل من يغسل المخزن المؤقت، وثم الوت الحمض النووي مع 30 مل من المخزن المؤقت شطف في أنبوب مخروطي 15 مل. طبقة 10.5 مل الكحول في درجة حرارة الغرفة على الحمض النووي الوتيد ببطء وعكس الأنبوب فورا أنها تدور في 16,200 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   4. إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل إيثانول 70% إلى بيليه الحمض النووي. ريسوسبيند بيليه خلال يسددها الأنبوب. أنها تدور في 16,200 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية واستخدام تلميح بيبيت 200 ميكروليتر لإزالة معظم الإيثانول. ريسوسبيند أنه في 200 ميكروليتر من المياه، أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وتخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية. وسيكون تركيز المتوقعة > 1 ميكروغرام/ميكروليتر.

2-الفيروسات الجيل و الجسيمات العد

1. عندما تكون جاهزاً لإنشاء لينتيفيروس التي تحتوي على dCAS9، معطف أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم مع 5 مل من 0.01 ٪ بولي-L-يسين (تكميلية الجدول 1). إزالة السائل الزائد تماما من اللوحات والسماح لهم أيردري لبضع دقائق في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
2. لوحة 5 × 10⁶ HEK 293T الخلايا من كل طبق في 10 مل من إكمال دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (دميم) (تكميلية الجدول 1) واحتضانها لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂. وفي اليوم التالي إزالة المتوسطة من الأطباق 293T HEK وإضافة 10 مل دميم كاملة.
3. ميكروغرام 6.5 مزيج من بلازميد بمدلج/بري تتضمن هفوة/pol (مكونات الفيروس)، 3.5 ميكروغرام من pMDG2.G بلازميد يحتوي على منظمة-ز (مكون من الفيروس)، 2.5 ميكروغرام المحتوية على برسف Rev بلازميد Rev (مكون من الفيروس)، 10 ميكروغرام المحطة منذ فترة طويلة (تكرار لتر)--التي تحتوي على ناقل جرنة أو dCas9 التي تحتوي على لتر ناقل وإضافة المياه إلى إجمالي حجم 450 ميكروليتر. قم بتصفية الخليط من خلال تلميح فلتر 0.2 ميكرون تعلق بحقنه.
4. إضافة 50 ميليلتر من 2.5 م كاكل₂ (تكميلية الجدول 1) إلى كل تعداء عينة من الحمض النووي وتخلط برفق. قم بتصفية الخليط الكالسيوم/الحمض النووي من خلال تلميح فلتر 0.2 ميكرون تعلق بحقنه. بيبيت 500 ميليلتر x HBS 2 (تكميلية الجدول 1) في أنبوب البوليستيرين 5 مل. قم بإضافة 500 ميليلتر الحمض النووي/كاكل₂ ميكس دروبويسي ولطف دوامة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
5. ببطء أضف 1 مل من الحمض النووي/كاكل₂/HBS تعليق لكل طبق. فورا عباب الأطباق توزيع المحتويات بشكل متساو. احتضان كل طبق بين عشية وضحاها في 5% CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية.
6. في يوم 3، ببطء إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من الأطباق. أغسل بعناية الخلايا 1 x مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 6 مل دميم كاملة وتستكمل مع 20 مم هيبيس و butyrate الصوديوم 10 ملم. احتضان الخلايا ح 5 – 6 في 5% CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية.
7. تغسل الخلايا 1 x مع برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل دميم كاملة مع 20 مم حبيس إلى خلايا HEK 293T. احتضانها ح 12 بين عشية وضحاها في 5% CO₂ حاضنة في 37 درجة مئوية.
8. في يوم 4، جمع supernatants خلية 293T HEK وتصفية المادة طافية. تجميد مختبرين 1 مل في-80 درجة مئوية.
9. عندما تكون جاهزاً لاستخدام الفيروس، وذوبان الجليد قاسمة الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على تكييف وسائل الإعلام (تخزين كما هو موضح في الخطوة 2.8) على الجليد. إحضار جميع المواد الكاشفة لدرجة حرارة الغرفة.
10. استخدام أدوات مقايسة الممتز Enzyme-Linked (ELISA) p24 لقياس عدد الجسيمات الفيروسية في المليلتر.
    1. تمييع الركاز يغسل من الطقم بإضافة أجزاء 19 من المياه المقطرة. تضعف السيطرة الإيجابية من الطقم إلى 200 نانوغرام/ملليلتر، استخدام 1640 رمبي مخفف، وجعل أنابيب تخفيف للمنحنى المعياري في 1.5 مل وفقا p24 أليسا تمييع الجدول (تكميلية الجدول 2).
    2. إضافة 20 ميكروليتر من 5% X-100 تريتون لجميع الآبار إلا الركيزة فارغة. إضافة 200 ميكروليتر من 1640 ربمي لآبار المراقبة السلبية. إضافة 200 ميكروليتر من كل معيار (في تكرار) للآبار المعينة.
    3. باستخدام جهاز المطياف الضوئي، قياس تركيز الفيروس في العينات، باستخدام منحنى قياسي. بدء تمييع عينة في 1:1,000 وتعديل حجم حسب الاقتضاء، بغية أن تكون ضمن نطاق المنحنى المعياري. تمييع العينات مع X-100 تريتون إلى تركيز نهائي من 0.5% وإضافة 200 ميكروليتر من كل عينة في RPMI 1640 إلى الآبار المعينة. ختم اللوحة واحتضان من أجل ح 2 في 37 درجة مئوية.
    4. أغسل لوحة 6 x مع 300 ميكروليتر 1 × أغسل المخزن المؤقت لكل بئر. قم بإزالة أي السوائل الزائدة بعكس اللوحة والتنصت على أنه على منشفة ورقية. إضافة 100 ميكروليتر من الكشف عن الأجسام المضادة من الطقم لجميع الآبار إلا الركيزة فارغة. ختم اللوحة واحتضان من أجل ح 1 في 37 درجة مئوية. أغسل اللوحة، وثم إزالة أي السوائل الزائدة بعكس اللوحة والتنصت على أنه على منشفة ورقية.
    5. ولقياس الأجسام المضادة كاشف، إعداد ستريبتافيدين-الفجل البيروكسيديز (SA-HRP) خلال 15 دقيقة من الاستخدام. تمييع سا-برنامج الصحة الإنجابية في 1: 100 مع مخفف سا-برنامج الصحة الإنجابية. مزيج المخفف سا-برنامج الصحة الإنجابية جيدا وإضافة 100 ميكروليتر إلى جميع الآبار باستثناء الفارغة. ختم واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. أغسل اللوحة مع 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واضغط بعيداً من أي سائل الزائدة كما في الخطوة 2.10.4. استخدم الحل الركيزة اورثو phenylenediamine (العيادات الخارجية)، التي تنص على البيروكسيديز ركائز ضرورية لإنتاج تشيميلومينيسسينسي، في غضون 15 دقيقة من إعداد. استخدم حبة واحدة من العيادات الخارجية لمل 11 من الركازة مادة لكل لوحة.
    7. دوامة الحل العيادات الخارجية بقوة حله تماما وحمايتها من الضوء. إضافة 100 ميكروليتر من العيادات الخارجية الركيزة الحل لجميع الآبار، بما في ذلك الفراغ. استخدام جهاز المطياف الضوئي، قراءة امتصاص 450 نانومتر فورا، كرر هذا x 10 فترات s 1، وتأخذ بقياس متوسط.

3-dCas9-نائب الرئيس64 توصيل

1. الخلايا T جوركات الثقافة في دميم كاملة في قارورة T75 مع كثافة 2 × 10⁶ خلايا في 15 مل من وسائل الإعلام. ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
2. وتدور أسفل الخلايا لمدة 5 دقائق في 233 س ز ، ثم، ريسوسبيند منهم في 10 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
3. ريسوسبيند ولوحة 1 × 10⁶ جوركات الخلايا في 5 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام مع بوليبريني (تكميلية الجدول 1) في قارورة T75. إضافة وسائط الإعلام المكيفة 293T HEK الذي يحتوي على 1 × 10⁶ المحتوية على dCas9 من الجسيمات الفيروسية. ويمكن حساب عدد الجسيمات الفيروسية تقريبا من p24 أليسا لأن 1 ميكروغرام/مل p24 يساوي 1 × 10⁷ الجسيمات الفيروسية. وضعت في قوارير في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.

4-اختيار و استنساخ إنشاء

1. ثلاثة أيام بعد الإصابة، تدور أسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في 10 مل دميم كاملة مع بوروميسين (تكميلية الجدول 1). لوحة الخلايا في قوارير T75 والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂. تدور أسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق كل يوم ثالث، لمدة 9 أيام، واستبدال وسائط الإعلام مع دميم كاملة مع بوروميسين.
2. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية. على لوحة 96-جيدا التعامل مع زراعة الأنسجة، لوحة خلايا 10,000 في 100 ميكروليتر من دميم كاملة مع بوروميسين في الأول جيدا ومتسلسل تمييع 1:1 محتويات الآبار التالية مع دميم كاملة مع بوروميسين. إجراء تخفيف 24 وكرر هذا x 4 للوحة الواحدة بغية ضمان وجود عدد كاف من الخلايا كل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
3. توسيع نطاق خلايا الاستنساخ إلى اثنين 24-جيدا لوحات، ثم إلى لوحة 6-جيدا، وفي نهاية المطاف إلى قارورة T75. بغية التركيز على ثلاثة من الحيوانات المستنسخة، لوحة 2 × 10⁶ خلايا كل من لوحة 6-جيدا جيدا لثلاثة من النسخ. لوحة الآبار الثلاثة الأخرى مع نونترانسدوسيد جوركات الخلايا كعناصر تحكم. وضع الخلايا في حاضنة ثقافة خلية بين عشية وضحاها.
4. لاستخراج الحمض النووي الريبي، استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي متاحة تجارياً. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة الوسائط. استخدام تلميح بيبيت 1 مل إلى ريسوسبيند الخلايا في ميكروليتر 350 من تحلل المخزن المؤقت. إضافة 350 ميكروليتر من الإيثانول 70% في الخلايا ليسيد ومزيج دقيق مع بيبيت 1 مل ونقل العينة إلى العمود بالجيش الملكي النيبالي.
5. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالة التدفق من خلال إضافة ميكروليتر 700 يغسل التقشف المنخفضة المخزن المؤقت من الطقم إلى العمود. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة 80 ميليلتر من الدناز أنا الحل من الطقم إلى العمود؛ واسمحوا العينات احتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة 700 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل عالية-التشدد من الطقم إلى العمود. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة ميليلتر 700 يغسل التقشف المنخفضة المخزن المؤقت إلى العمود.
7. إزالة العمود من أنبوب جمع وتحويلها إلى أنبوب جمع جديدة. وتدور ليساتيس في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة، ثم قم بنقل العمود الحمض النووي الريبي لأنبوب 1.5 مل. إضافة 50 ميليلتر من المياه إلى العمود وتدور في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
8. استخدام جهاز المطياف الضوئي لقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي. تتوقع تركيز بما بين 100-500 نانوغرام/ميليلتر، مع امتصاص 260/280 بين 1.9-2.1. مخزن الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
9. في 250 ميليلتر الأنابيب، إضافة 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، 4 ميليلتر من المخزن المؤقت لتوليف الحمض النووي (كدنا) مكملة، 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية، ومن المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر. تتضمن أية عناصر تحكم المنتسخة العكسية. في cycler حرارية، توليف كدنا 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط المنتسخة العكسية. تمييع كدنا مع 60 ميليلتر من الماء بعد التوليف.
10. إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (تقارير إتمام المشروعات) التي تحتوي على 5 ميليلتر من سيبر الخضراء، 4 ميليلتر من كدنا، 0.5 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، و 0.5 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرون). تشغيل بكر النحو التالي: الخطوة 1 = 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، الخطوة 2 = 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، الخطوة 3 = 60 درجة مئوية ل 10 s، وبعد ذلك، كرر الخطوات 2 و 3 ل 30 x.
    ملاحظة: التسلسل للتمهيدي إلى الأمام dCas9 5 '--تكجككاكاجكاتااجاجا والتسلسل للتمهيدي عكس dCas9 5'--كتتتكاتجتاكجككاككت. التمهيدي إلى الأمام هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيريز 1 (HPRT1) 5 '--جاككاجتكاكاجججاكات وعكس التمهيدي 5'--جكتجكجاككتجاككاتكت.

5-جرنا توصيل، والتحديد، واستنساخ إنشاء، والفرز

1. ريترانسدوسي الخلايا جوركات-dCas9 تم التحقق من صحتها مع الفيروسات المحتوية على جرنا كما هو مبين في الباب 3. حدد الخلايا في دميم مع هيجروميسين (تكميلية الجدول 1) لمدة 10 أيام. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وتغيير وسائل الإعلام كل 3 أيام.
2. أداء تسلسلي إضعاف الخلايا (كما هو موضح في الخطوة 4، 2) وتوسيع المستعمرات الفردية (كما هو موضح في الخطوة 4، 3). تنقية الحمض النووي الريبي من المستعمرات بالضبط كما هو موضح في الخطوة 4، 5 وإجراء توليف كدنا كما هو موضح في الخطوة 4.9. إجراء PCR الوقت الحقيقي ضد حكومة الهند و HPRT1 أو جينات مناسبة التدبير المنزلي، وبالمثل لبكر هو موضح في الخطوة 4، 10، في هذه الحالة، باستثناء صورة الآبار كل دورة بعد الخطوة 3.
3. استخدم الأسلوب عتبة (Ct) دورة النسبية لتحديد تغيير غوي⁸إضعاف. بإيجاز، تستخدم المعادلة التالية لحساب مستويات نسخة النسبي (RTLs): 2^{-(متوسط Ct غوي – متوسط الأشعة المقطعية للجينات التدبير المنزلي)}. ثم حساب متوسط RTL لعناصر التحكم والقسمة جميع RTL قيم عنصر التحكم متوسط RTL لتوليد تغيير إضعاف مقارنة بالعينات السيطرة.

النتائج

نظام مزدوج متجه أوفيريكسبريس لنكرنا إيفنج-AS1
هذه التجربة مثال في هذه المخطوطة هو أوفيريكسبريشن جوركات تي خلية نموذج نظام الإعراب عن لنكرنا إيفنج-AS1⁹. إيفنج-AS1 هو لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، التي شهدت تنظيم "انترفيرون غاما"¹⁰. ج?...

Discussion

ويعرض هذه المخطوطة على بروتوكول لاستخدام تنشيط كريسبر إلى أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. هذا أسلوب أهمية خاصة عند دراسة الكشف فضله منذ فترة طويلة كمنتج ترانسكريبتوميك هو وحدة وظيفية. بعد أوفيريكسبريشن، الباحث، ثم استخدام هذه الخلايا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند دراسة الشركاء م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA synthesis kit (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plasmid	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cells	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cells	ATCC	TIB-152	clone E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
Optimem I reduced serum media	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100