Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene

Resumo

Técnicas tradicionais baseados em cDNA superexpressão têm uma aplicabilidade limitada para a superexpressão de tempo não-codificante RNAs devido às suas múltiplas formas de tala com funcionalidade potencial. Esta revisão relata um protocolo utilizando tecnologia CRISPR para overexpress múltiplas variantes da tala de um RNA não-codificante longo.

Resumo

Há muito tempo não codificante biologia do RNA (lncRNA) é um novo e excitante campo de pesquisa, com o número de publicações deste campo crescendo exponencialmente desde 2007. Estes estudos têm confirmado que os lncRNAs sejam alteradas em quase todas as doenças. No entanto, estudar as funções funcionais para lncRNAs no contexto da doença continua a ser difícil devido à falta de produtos proteicos, expressão tecido-específica, níveis baixos de expressão, complexidades em formulários da tala e falta de conservação entre espécies. Dada a expressão espécie-específicas, estudos lncRNA são restritos aos contextos de investigação humana quando estudando processos de doença. Desde que lncRNAs funcionar a nível molecular, uma maneira de dissecar lncRNA biologia é para remover o lncRNA ou overexpress os efeitos celulares lncRNA e medida. Neste artigo, é apresentado um protocolo escrito e visualizado a overexpress lncRNAs in vitro. Como um experimento de representante, um lncRNA associado com doença inflamatória intestinal, Interferon gama antisentido 1 (IFNG-AS1), é mostrado para ser overexpressed em um modelo de células Jurkat T. Para fazer isso, a técnica de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de activação é usada para habilitar a superexpressão no locus genômicos endógenas. A técnica CRISPR activação destina-se um conjunto de factores de transcrição para o site iniciar transcricional de um gene, permitindo um robusto superexpressão de múltiplas formas de tala de lncRNA. Este procedimento irá ser dividido em três etapas, ou seja (i) guia construção design e vetor de RNA (gRNA), (ii) o vírus a geração e transdução e triagem (iii) a colônia para superexpressão. Para esta experiência representativa, um maior do que 20-fold realce em IFNG-AS1 em células Jurkat T foi observada.

Introdução

Enquanto investigação biomédica mais concentrou-se transcritos codificantes de proteínas, a maioria dos genes transcritos na verdade consiste de RNA não-codificante (liberação de Ensembl 93). A pesquisa atual está começando a explorar este campo, com o número de publicações sobre lncRNAs em processos de doença crescente exponencialmente entre 2007 e 2017¹. Estas publicações demonstram que muitos lncRNAs estão associados com doença. No entanto, os mecanismos moleculares de lncRNAs estes são difíceis de estudar devido a suas diversas funções em comparação com os mRNAs. Compondo o problema de compreender o papel da lncRNAs na doença, lncRNAs exprimem-se frequentemente a codificação RNAs²níveis inferiores. Além disso, lncRNAs são mal conservadas, que limita os estudos funcionais na célula linha-humanas técnicas³. Um método para estudar o mecanismo destes genes romance é endogenamente overexpress-los em pilhas cultivadas. Estudos de superexpressão podem fornecer informações chaves sobre a função dos genes específicos e permitir aos investigadores principais vias moleculares de dissecar.

Um novo método para ativar a transcrição de genes lncRNA é baseado em tecnologias CRISPR desenvolvidas inicialmente pela Gersbach laboratório⁴. Este protocolo foi adaptado para uso em lncRNA biologia e para a expressão destes genes em outros sistemas de modelo. No CRISPR superexpressão técnica, uma proteína chamada proteína associada CRISPR 9 (Cas9) pode ser direcionada para uma sequência de DNA através de uma gRNA antisentido é reconhecido por Cas9. Normalmente, Cas9 induzirá a clivagem de DNA; no entanto, mutações em Cas9, anteriormente desenvolvido para a técnica de superexpressão, desativar esta etapa⁵. Quando um ativador transcricional é fundido a uma Cas9 "morto" (dCas9) e transformados em linhas de células, a superexpressão endógena de lncRNAs pode ser alcançado^4,6. A adição de modificações adicionais para a gRNA, permitindo que fatores transcricionais adicionais ligar a gRNA, aumentou a eficácia do sistema de ativação do gene dCas9 10 vezes⁷. Importante, foi demonstrado que a ativação transcricional requer proximidade (< 200 bp) para o transcriptional começar genes local, permitindo uma upregulation específica em áreas ricas gene⁷. Ao contrário de tecnologias de nocaute CRISPR, dCas9 e gRNA cassettes precisam ser integrado no genoma para permitir células reter uma superexpressão ao longo de várias gerações. Um método para alcançar este objectivo é usar lentivírus para integrar as fitas dCas9 e gRNA-contendo. Após a integração, a expressão do gene de lncRNA pode ser determinada.

Neste artigo, será demonstrado um protocolo para superexpressão de lncRNA em um modelo de células Jurkat T. Um procedimento passo a passo é mostrado e também pode ser adaptado para células aderentes.

Protocolo

Nota: É importante notar que este protocolo usa replicação deficiente lentivírus. Execute manipulação viral somente após o treinamento de segurança do laboratório apropriado. Bleach todos os itens e as superfícies que entram em contacto com o vírus vivo por um período mínimo de 10 min após o manuseio. Uso uma proteção descartável laboratório de casaco e rosto/olhos, bem como luvas duplas, em todos os momentos. Realizar o trabalho de vírus em Biossegurança nível 2 + laboratórios com certificação viral. Escreve capuzes de cultura de tecidos e incubadoras trabalho viral.

1. vector Design e geração

Nota: A melhor maneira de identificar sequências de gRNA é usar ferramentas de design on-line (por exemplo, http://crispr-era.stanford.edu) (suplementar Figura 1: projeto de gRNA). Para o experimento de representante que acompanha, uma empresa projetado e criado os vetores de gRNA usados no experimento representativo. O plasmídeo dCas9 também foi comprado on-line.

1. A sequência de gRNA situa-se montante da sequência de nucleotídeos "NGG", onde "N" é qualquer nucleotídeo, que também é dentro de 100 pares de bases do site transcriptional iniciar. Pesquisar bases de dados genéticas como BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) para a sequência de gRNA, para certificar-se de que não há outros sites no genoma com sequências similares (suplementar Figura 2: BLAT). Isto irá assegurar que a sequência de gRNA é exclusiva para o gene de interesse (GI).
2. Armazenar os plasmídeos gRNA e dCas9, que vem como stubs de bacterianas, a 4 ° C. Raia para fora de Escherichia coli em um Luria caldo (LB) ágar da placa com ampicilina (Supplemental tabela 1) e crescem as bactérias durante a noite a 37 ° C.
3. Escolher uma colônia e crescem as bactérias em 5 mL de LB com ampicilina (Supplemental tabela 1) durante a noite, agitando vigorosamente a placa em uma incubadora de 37 ° C. No dia seguinte, adicionar 2 mL de bactérias para 200 mL de LB com ampicilina crescer em um frasco de 2 L, agitando vigorosamente o frasco durante a noite em uma incubadora de 37 ° C.
4. Gire para baixo as bactérias a 3.724 x g por 20 min. remover a mídia e o lugar do tubo contendo a bactéria no gelo.
5. Purifica DNA bacteriano, usando um kit de purificação de plasmídeo por protocolo do fabricante.
   Nota: os kits de purificação de plasmídeo contêm buffer de ressuspensão proprietárias, Lise, tampão de lavagem, buffer de equilibração e tampão de eluição.
   1. Adicione 10 mL de tampão de ressuspensão do kit para as bactérias e pipetar as bactérias na solução. Em seguida, adicionar 10 mL de tampão de lise do kit para a ressuspensa bactéria e misturá-los por inversão do tubo. Espere 5 min para lisar as bactérias; em seguida, adicionar 10 mL de tampão de neutralização gelada do kit para as bactérias lisadas e misturá-los por inversão do tubo.
   2. Equilibrar a coluna de DNA do kit com 10 mL de tampão de equilibração por 5 min. Despeje as amostras na coluna de DNA do filtro e deixem a solução passar através do filtro.
   3. Lavar as amostras 2 x com 30 mL de tampão de lavagem e, então, Eluir o DNA com 30 mL de tampão de eluição em um tubo cônico de 15 mL. Lentamente a camada 10,5 mL de isopropanol à temperatura ambiente para o DNA eluted, inverter o tubo e girá-lo imediatamente a 16.200 x g durante 30 min a 4 ° C.
   4. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol a 70% para a pelota do ADN. Resuspenda o pellet por agredir o tubo. Gire a 16.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C e use a ponta da pipeta 200 μL para remover a maioria do etanol. Secar ao ar livre a pelota por 5 min e Resuspenda-lo em 200 µ l de água e armazenar o DNA a-20 ° C. A concentração esperada será > 1 μg/μL.

2. vírus geração e partículas de contagem

1. Quando estiver pronto para criar o lentivirus contendo dCAS9, casaco pratos de cultura de tecidos de 100 mm com 5 mL de 0,01% poli-L-lisina (Supplemental tabela 1). Retire o excesso de líquido cuidadosamente as chapas e deixe-os secar ao ar por alguns minutos em um armário de biossegurança.
2. Placa de 5 x 10⁶ HEK 293T células por prato em 10 mL de Dulbecco completa modificado médio da águia (DMEM) (Supplemental tabela 1) e incubam-os durante a noite a 37 ° C com 5% de CO₂. No dia seguinte, retire os pratos de 293T HEK a médio e adicionar 10 mL de DMEM completa.
3. Mix 6.5 μg de plasmídeo pMDLg/pRRE contendo a mordaça/pol (componentes do vírus), 3,5 μg do pMDG2.G do plasmídeo contendo o VSV-G (um componente do vírus), 2,5 µ g de pRSV-Rev o plasmídeo que contém Rev (um componente do vírus), 10 μg de um tempo terminal (repetição LTR)-contendo gRNA vetor ou um dCas9 contendo LTR vector e adicionar água a um volume total de 450 μL. Filtre a mistura através de uma dica de filtro de 0,2 µm anexada a uma seringa.
4. Adicionar 50 µ l de 2,5 M CaCl₂ (Supplemental tabela 1) para cada amostra de Transfeccao de DNA e misture delicadamente. Filtre a mistura de cálcio/DNA através de uma dica de filtro de 0,2 µm anexada a uma seringa. Pipetar 500 µ l de 2 x HBS (Supplemental tabela 1) para um tubo de poliestireno de 5 mL. Adicione a 500 µ l DNA/CaCl₂ mistura gota a gota e suavemente vórtice. Incube a temperatura ambiente por 3 min.
5. Lentamente, adicione 1 mL de suspensão /HBS de DNA/CaCl₂para cada prato. Imediatamente rodar os pratos para distribuir o conteúdo de maneira uniforme. Incubar a cada prato a noite numa incubadora 5% CO₂ a 37 ° C.
6. No dia 3, lentamente remova e descarte a mídia desde os pratos. Lavar cuidadosamente as células 1 x com tampão fosfato salino (PBS). Adicione 6 mL de DMEM completo suplementado com 20 mM HEPES e butirato de sódio de 10 mM. Incube as celulas para 5 – 6 h numa incubadora 5% CO₂ a 37 ° C.
7. Lavar as células 1 x com PBS e adicionar 5 mL de DMEM completa com 20 mM HEPES às células HEK 293T. Incubar durante 12 h durante a noite numa incubadora 5% CO₂ a 37 ° C.
8. No dia 4, recolher os sobrenadantes de células HEK 293T e filtrar o sobrenadante. Congelar as alíquotas de 1 mL a-80 ° C.
9. Quando estiver pronto para usar o vírus, descongele uma alíquota da partícula viral contendo mídia condicionada (armazenadas como descrito no passo 2.8) no gelo. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente.
10. Use um kit de ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) p24 para quantificar o número de partículas virais por mililitro.
    1. Dilua o concentrado de lavagem do kit adicionando 19 partes de água destilada deionizada. Diluir o controle positivo do kit a 200 ng/mL, usando RMPI 1640 como o diluente e fazer as diluições para a curva padrão em 1,5 mL tubos de acordo com o p24 tabela de diluição de ELISA (Supplemental tabela 2).
    2. Adicionar 20 μL de 5% Triton X-100 a todos os poços, excepto o branco do substrato. Adicione 200 μL de RPMI 1640 nos poços de controle negativo. Adicione 200 μL de cada norma (em duplicado) nos poços designados.
    3. Usando um spectrophotometer, medir a concentração do vírus dentro das amostras, usando uma curva padrão. Começar a diluição da amostra em 1:1,000 e modificar o volume, se necessário, a fim de estar dentro da faixa da curva padrão. Diluir as amostras com Triton X-100 para uma concentração final de 0,5% e o Adicionar 200 μL de cada amostra em RPMI 1640 poços designados. Selar a placa e incubar, durante 2 h a 37 ° C.
    4. Lavar a placa 6 x com 300 μL de tampão de lavagem por alvéolo 1x. Remova qualquer excesso de líquido, invertendo a placa e batendo-o em uma toalha de papel. Adicione 100 μL de anticorpo detector do kit a todos os poços, excepto o branco do substrato. Selar a placa e incubar isso durante 1 h a 37 ° C. Lave a placa e, em seguida, remover qualquer excesso de líquido, invertendo a placa e batendo-o em uma toalha de papel.
    5. Para medir o anticorpo do detector, prepare peroxidase de rábano e streptavidin (SA-HRP) dentro de 15 minutos de uso. Dilua o HRP-SA em 1: 100 com diluente de SA-HRP. Homogeneizar o SA-HRP diluída e adicionar 100 μL de todos os poços, excepto o espaço em branco. Selar e incubar a placa por 30 min à temperatura ambiente.
    6. Lavar a placa com tampão de lavagem 1x e toque fora qualquer excesso de líquido como na etapa 2.10.4. Use a solução de substrato de orto-fenilenodiamina (OPD), que fornece a peroxidase os substratos necessários para produzir a quimioluminescência, dentro de 15 min. de preparação. Use um comprimido OPD a 11 mL de diluente de substrato para cada placa.
    7. Vórtice a solução OPD vigorosamente para dissolvê-lo completamente e protegê-lo da luz. Adicione 100 μL de solução de substrato OPD a todos os poços, incluindo o espaço em branco. Usando um spectrophotometer, ler a absorvância a 450 nm imediatamente, repita este 10x em intervalos de 1 s e medir a média.

3. dCas9 -VP64 transdução

1. Células Jurkat T de cultura em DMEM completa num balão T75 com uma densidade de 2 x 10⁶ células em 15 mL de mídia. Cultura de células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Spin para baixo as células por 5 min a 233 x g e, então, resuspenda-los em 10 mL de mídia soro reduzida. Conte as células com um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
3. Resuspenda e placa células Jurkat de 1 x 10⁶ em 5 mL de mídia reduzida soro com polybrene (quadro suplementar 1) num balão T75. Adicione mídia 293T-condicionados de HEK contendo 1 x 10⁶ dCas9 contendo partículas virais. O número de partículas virais pode ser calculado cerca do p24 ELISA porque 1 μg/mL p24 é igual a 1 x 10⁷ partículas virais. Colocar os frascos na incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂.

4. seleção e Clone criação

1. Três dias pós infecção, spin para baixo as células a 233 x g por 5 min e Resuspenda-los em 10 mL de DMEM completa com puromicina (Supplemental tabela 1). As células em balões T75 da placa e cultura-los a 37 ° C com 5% de CO₂. Em três dias, durante um período de 9 dias, spin para baixo as células a 233 x g por 5 min e substituir a mídia com DMEM completa com puromicina.
2. Conte as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada. Em uma placa de 96 poços, tratada com cultura de tecidos, placa 10.000 células 100 μL de DMEM completa com puromicina no primeiro bem e serialmente diluir 1:1 o conteúdo dos seguintes poços com DMEM completa com puromicina. Realizar 24 diluições e repita este x 4 por placa a fim de garantir que haja um número adequado de células por poço. Incube a 37 ° C com 5% CO₂células.
3. Expanda as células clonais em duas placas de 24 poços, em seguida, em uma placa de 6 e eventualmente para um balão de T75. Para focar três dos clones, células de⁶ placa de 2 x 10 por bem de uma placa de 6 para três dos clones. Os outros três poços da placa com nontransduced células Jurkat como controles. Colocar as células em uma incubadora de cultura celular durante a noite.
4. Para a extração de RNA, use um kit de isolamento de RNA comercialmente disponível. Gire para baixo as células a 233 x g durante 5 min à temperatura ambiente e remova a mídia. Use a ponta da pipeta de 1 mL para Ressuspender as células em 350 μL de tampão de Lise. Adicionar 350 μL de etanol a 70% para as células lisadas, misture bem com uma pipeta de 1 mL e transferir a amostra para a coluna de RNA.
5. Girar os lysates a 10.000 x g por 1 min, retire o escoamento e adicione 700 μL de tampão de lavagem do baixo-rigor do kit para a coluna. Girar os lysates a 10.000 x g por 1 min, retire o escoamento e adicione 80 µ l de DNase eu solução do kit para a coluna; Deixe as amostras incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
6. Girar os lysates a 10.000 x g por 1 min, retire o escoamento e adicione 700 µ l de tampão de lavagem de alta-rigor do kit para a coluna. Girar os lysates a 10.000 x g por 1 min, retire o escoamento e adicione 700 µ l de tampão de lavagem do baixo-rigor à coluna.
7. Remova a coluna do tubo da coleção e transferi-lo para um novo tubo de coleta. Girar os lysates a 10.000 x g por 1 min e, em seguida, transfira a coluna de RNA para um tubo de 1,5 mL. Adicione 50 µ l de água para a coluna e centrifugação a 10.000 x g por 1 min.
8. Use um espectrofotômetro para quantificar a concentração de RNA. Esperar que a operação de concentração entre 100-500 ng / µ l, com uma absorvância de 260/280 entre 1.9 – 2.1. Armazenar o RNA a-80 ° C.
9. Em 250 µ l tubos, adicione 1 µ g de RNA, 4 µ l de tampão de síntese de DNA (cDNA) complementar, 1 µ l de transcriptase reversa, e água até um volume final de 20 µ l. não incluir nenhum controle de transcriptase reversa. Em um termociclador, sintetiza cDNA a 42 ° C por 30 min e a 95 ° C por 5 min inactivar o transcriptase reversa. Dilua o cDNA com 60 µ l de água após a síntese.
10. Prepare-se reacções em cadeia do polymerase (PCR) contendo 5 µ l de SYBR verde, 4 µ l do cDNA, 0,5 µ l de primer para a frente (10 µM) e 0,5 µ l de primer reverso (10 µM). Executar o PCR da seguinte forma: passo 1 = 95 ° C por 3 min, passo 2 = 95 ° C por 10 s, passo 3 = 60 ° C durante 10 s e em seguida, repetir passos 2 e 3 para x 30.
    Nota: A sequência para o dCas9 para a frente da primeira demão é 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA e a sequência para o primer reverso dCas9 é 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. O primer para a frente para hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1) é 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT e o primer reverso é 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.

5. gRNA transdução, seleção, Clone , criação e triagem

1. Retransduce as células Jurkat-dCas9 validadas com gRNA contendo vírus, conforme descrito na seção 3. Selecione células em DMEM com hptII (quadro suplementar 1) por 10 dias. Gire para baixo as células e alterar os meios de comunicação a cada 3 dias.
2. Realizar uma diluição serial de células (conforme descrito na etapa 4.2) e expanda colônias individuais (como descrito no passo 4.3). Purificar o RNA das colônias exatamente como descrito na etapa 4.5 e realizar a síntese do cDNA, conforme descrito na etapa 4.9. Realizar o PCR em tempo real contra o governo indiano e HPRT1 ou um gene de limpeza adequada, da mesma forma que a PCR descrito na etapa 4.10, exceto neste caso, imagem que dos poços cada ciclo após a etapa 3.
3. Use o método de limiar (Ct) do ciclo comparativo para determinar mudança dobra no GOI⁸. Brevemente, use a seguinte equação para calcular os níveis de transcrição relativa (RTLs): 2^{-(média Ct de GOI – média Ct do gene das tarefas domésticas)}. Em seguida, calcular a média RTL dos controles e dividir todos os valores RTL pelo controle média RTL para gerar uma mudança de dobra em comparação com as amostras de controle.

Resultados

Um sistema dual de vetor para overexpress o lncRNA IFNG-AS1
O experimento de exemplo neste manuscrito é a superexpressão de um sistema de células Jurkat T modelo expressando a lncRNA IFNG-AS1⁹. IFNG-AS1 é um lncRNA associado com doença inflamatória intestinal, que tem sido vista regular de interferão gama¹⁰. O gene IFNG-AS1 contém três variantes da tala, que todos usam o mesmo site iniciar transcriptional (

Discussão

Este manuscrito apresenta um protocolo para usar ativação CRISPR para overexpress lncRNAs in vitro. Esta é uma técnica especialmente importante quando estudar há muito tempo não codificante RNAs como o produto do transcriptomic é a unidade funcional. Depois superexpressão, o pesquisador pode, então, usar essas células para aumentar a relação sinal-ruído quando estudar parceiros de ligação e nem medir as consequências celulares de aumento dos níveis de lncRNAs. Além disso, como lncRNAs frequentemente age...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA synthesis kit (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plasmid	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cells	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cells	ATCC	TIB-152	clone E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
Optimem I reduced serum media	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100