Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

요약

전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.

초록

긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.

서문

가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 2017¹사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs²보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술³기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.

LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소⁴에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계⁵를 비활성화 합니다. "죽은" Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된^4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진⁷. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역⁷에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.

이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜에서는 복제 불충분 한 lentiviruses 중요 하다. 적절 한 실험실 안전 훈련 후에 바이러스 처리를 수행 합니다. 모든 항목 및 표면 처리 후 최소 10 분에 대 한 라이브 바이러스 접촉에 표 백제. 사용 일회용 랩 코트와 얼굴/눈 보호로 이중 장갑, 항상. Biosafety 수준 2 + 실험실 바이러스 인증 바이러스 작업을 수행 합니다. 바이러스 성 일 조직 문화 후드와 인큐베이터를 칩니다.

1. 벡터 디자인 및 생성

참고: GRNA 시퀀스를 식별 하는 가장 좋은 방법은 온라인 설계 도구 (예: http://crispr-era.stanford.edu)을 사용 하는 것입니다 (보충 그림 1: gRNA 디자인). 함께 대표적인 실험에 대 한 회사는 설계 및 대표 실험에 사용 된 gRNA 벡터를 만든. DCas9 플라스 미드 또한 온라인 구입 했다.

1. GRNA 순서는 뉴클레오티드 순서 "NGG", 여기서 "N"은 또한 transcriptional 시작 사이트의 100의 기본적인 쌍은 어떤 뉴클레오티드의 상류 위치 이다. GRNA 시퀀스 비슷한 시퀀스 게놈에 있는 다른 사이트 되도록 BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) 같은 유전자 데이터베이스 검색 (보충 그림 2: 공격기). 이렇게 하면 gRNA 시퀀스 (GOI)의 유전자에 고유 하다는 것.
2. 4 ° c.에 세균성 명세서로 서 gRNA와 dCas9 플라스 저장 국물 (파운드) 천 암 피 실린 (보충 표 1)와 함께 접시 하 고 37 ° c.에 하룻밤 박테리아 성장 Luria에 대장균 에 밖으로 행진
3. 식민지를 선택 하 고 37 ° C 배양 기에서 접시를 적극적으로 떨고 암 피 실린 (보충 표 1),와 파운드의 5 mL에 박테리아를 성장. 다음 날, 추가의 2 mL 암 피 실린과 파운드의 200 mL에 박테리아가 적극적으로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 플라스 크를 흔들어 2 L 플라스 크에 성장.
4. 3,724 x g 20 분 제거 미디어에 박테리아와 장소 얼음에 박테리아를 포함 하는 튜브 아래로 회전 합니다.
5. 제조 업체의 프로토콜 당 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 세균성 DNA를 정화.
   참고: 소유 물의 resuspension 버퍼, 세포의 용 해 버퍼, 워시 버퍼, 재래식 버퍼 및 차입 버퍼를 포함 하는 플라스 미드 정화 장비.
   1. 물의 resuspension 버퍼의 10 mL 키트에서 박테리아를 피펫으로 박테리아에 추가 솔루션. 그런 다음, 키트에서 resuspended 박테리아 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 혼합. 5 분; 박테리아를 lyse 기다립니다 다음, lysed 박테리아 키트에서 차가운 중화 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 믹스.
   2. 재래식 5 분 부 DNA 열에 샘플 필터 고 필터를 통과 하는 솔루션에 대 한 버퍼의 10 mL와 키트에서 DNA 열 equilibrate
   3. 워시 샘플 2의 30 mL x 버퍼를 세척 하 고, 다음, 15 mL 원뿔 튜브에 차입 버퍼의 30 mL와 함께 DNA elute. 소 프로 파 놀 eluted DNA에 실 온에서의 10.5 mL를 천천히 레이어, 튜브, 반전 및 즉시 16200 x g 4 ° c.에 30 분에서 그것을 회전합니다
   4. 제거는 상쾌한 고 DNA 펠 릿을 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 펠 릿을 resuspend. 16200 x g 4 ° C에서 10 분에서 그것을 회전 하 고 200 μ 피펫으로 팁을 사용 하 여 에탄올의 대부분을 제거. 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 물, 200 μ에 resuspend-20 ° c.에 DNA를 저장 예상된 농도 됩니다 > 1 μ g/μ.

2. 바이러스 생성 및 입자 수

1. 때를 포함 하는 dCAS9 lentivirus를 만드는 준비, 100 m m 조직 문화 요리 0.01% 폴 리-L-리 신 (보충 표 1)의 5 mL와 코트. 철저 하 게 격판덮개에서 과잉 액체를 제거 하 고 그들이 biosafety 캐비닛에 몇 분 동안 공기가 건조.
2. 플레이트 5 x 10⁶ HEK 293T 세포 완전 한 Dulbecco의 10 mL에 접시 당이 글의 중간 (DMEM) (보충 표 1)을 수정 하 고 하룻밤 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어. 다음 날, HEK 293T 요리에서 매체를 제거 하 고 완전 한 DMEM의 10 mL을 추가.
3. 플라스 미드 pMDLg/pRRE 개 그/폴 (바이러스의 구성 요소), 포함 된의 μ g 믹스 6.5 VSV G (바이러스의 구성 요소)를 포함 하는 플라스 미드 pMDG2.G의 3.5 μ g 2.5 µ g 포함 하는 플라스 미드 pRSV-레 브의 계 (바이러스의 구성 요소), 긴 단말기 반복 (10 μ g LTR)-벡터 gRNA 벡터 또는 LTR 포함 된 dCas9를 포함 하 고 450 μ의 전체 볼륨에 물을 추가. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 부착을 통해 혼합물을 필터링 합니다.
4. DNA의 각 transfection 샘플을 2.5 M CaCl₂ (보충 표 1)의 50 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 연결 된 통해 칼슘/DNA 혼합물을 필터링 합니다. 피펫으로 500 µ L의 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 2 x HBS (보충 표 1). 추가 500 µ L DNA/CaCl₂ 믹스 dropwise 부드럽게 소용돌이. 3 분 동안 실 온에서 품 어.
5. 천천히 각 접시를 DNA/CaCl₂/HBS 서 스 펜 션의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 요리를 균등 하 게 내용을 소용돌이 친다. 37 ° c.에 5% CO₂ 배양 기에서 하룻밤 각 접시를 품 어
6. 3 일에 천천히 제거 하 고 요리에서 미디어를 삭제. 신중 하 게 씻어 세포 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. 완전 한 DMEM 20 mM HEPES와 10mm 나트륨 낙 산 염 보충의 6 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5% CO₂ 배양 기에서 5-6 h에 대 한 셀을 품 어
7. 1 세포를 씻어 PBS 가진 x HEK 293T 세포에 20 mm HEPES 완전 한 DMEM의 5 mL을 추가. 37 ° c.에 5% CO₂ 배양 기에서 하룻밤 12 h에 대 한 품 어
8. 하루에 4, HEK 293T 세포 supernatants 수집 하 고 필터링 하는 상쾌한. 1 mL aliquots-80 ° c.에 고정
9. 때 사용 하는 바이러스, 바이러스 성 입자를 포함 하는의 약 수를 녹여 준비 얼음에 (에서 설명한 단계 2.8로 저장 된) 미디어를 조절. 실내 온도에 모든 시 약을 가져다.
10. P24 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트를 사용 하 여 계량 밀리 리터 당 바이러스 입자의 수 있습니다.
    1. 이온을 제거 된 증류수의 19 부분을 추가 하 여 키트에서 세척 농축액을 희석. 키트에서 긍정적인 컨트롤 200 ng/mL을 희석, 희석제, 및 확인 RMPI 1640을 사용 하 여 1.5 mL에 표준 곡선에 대 한 희석 튜브는 p24 따라 ELISA 희석 표 (보충 표 2).
    2. 추가 5%의 20 μ 빈 기판 제외 하 고 모든 우물에 트라이 톤 X-100. 부정적인 통제 우물에 RPMI 1640의 200 μ를 추가 합니다. 지정 된 웰 스를 (중복)에서 각 표준의 200 μ를 추가 합니다.
    3. 분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선을 사용 하 여 샘플 내의 바이러스의 농도 측정. 1:1,000에서 샘플 희석을 시작 하 고 표준 곡선의 범위 내에 있을 필요에 따라 볼륨을 수정 합니다. 0.5%의 최종 농도에 Triton X-100와 샘플을 희석 하 고 지정 된 웰 스 RPMI 1640에 각 샘플의 200 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 2 h에 그것을 품 어
    4. 6 접시를 씻고 잘 당 워시 버퍼 x 1의 300 μ x. 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 모든 초과 액체를 제거 합니다. 키트에서 빈 기판 제외 하 고 모든 우물 검출기 항 체의 100 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 1 시간을 위해 그것을 품 어 접시를 세척 하 고, 다음, 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 어떤 과잉 액체를 제거.
    5. 검출기 항 체를 측정 하기 위하여 사용의 15 분 이내 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP SA)를 준비 합니다. SA-HRP 희석제와 1: 100에 SA HRP를 희석. 희석된 SA HRP를 철저 하 게 혼합 하 고 추가 100 μ 빈 제외 하 고 모든 우물. 밀봉 하 고 상 온에서 30 분 동안 접시를 품 어.
    6. 워시 버퍼 x 1 접시를 세척 하 고 멀리 단계 2.10.4에서 어떤 초과 액체를 누릅니다. 직교 phenylenediamine (OPD) 기판 솔루션 제공는 과산화 효소 화학 준비 15 분 이내를 생산 하기 위해 필요한 기질을 사용 합니다. 한 OPD 타블렛 기판 희석제의 11 mL를 사용 하 여 각 접시.
    7. 완전히 녹이 고 빛 으로부터 보호를 적극적으로 OPD 솔루션 소용돌이. 공백을 포함 하 여 모든 우물에 OPD 기판 솔루션의 100 μ를 추가 합니다. 사용 하는 분 광 광도 계, 450에서 흡 광도 읽고 nm는 즉시 1 s 간격이 10 배를 반복 하 고 평균 측량을가지고 가십시오.

3. dCas9-부사장64 변환

1. 완전 한 DMEM 미디어의 15 mL에 2 x 10⁶ 세포의 밀도와 T75 플라스 크에 있는 문화 Jurkat T 세포. 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.
2. 233 x g 에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고, 다음, 감소 된 혈 청 미디어의 10 ml에서 그들을 resuspend. hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.
3. Resuspend 및 polybrene (보충 표 1) T75 플라스 크에 감소 된 혈 청 미디어의 5 mL에 1 x 10⁶ Jurkat 세포 접시. 1 x 10⁶ 바이러스 성 입자를 포함 하는 dCas9 포함 된 HEK 293T 조절 미디어를 추가 합니다. 바이러스 성 입자의 수는 p24에서 대략 계산할 수 있다 ELISA 1 μ g/mL p24 같음 1 x 10⁷ 바이러스 성 입자 때문에. 5% CO₂배양 기 37 ° C에에서는 플라스 크를 넣어.

4. 선택 하 고 복제 생성

1. 3 일 후 감염, 233 x g 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 완전 한 DMEM puromycin (보충 표 1)와 10 mL에 그들을 resuspend. T75 플라스 크에 세포 격판덮개 그리고 5% CO₂와 37 ° C에서 문화. 9 일 동안 3 매일 5 분 233 x g 에서 셀 아래로 회전 하 고 puromycin와 완전 한 DMEM 미디어 바꿉니다.
2. hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 조직 문화 치료 96 잘 접시에 처음에 puromycin와 완전 한 DMEM의 100 μ 접시 10000 셀 잘하고 직렬 희석 1:1 완벽 한 DMEM puromycin와 함께 다음 우물의 내용을. 수행 24 희석 하 고 잘 당 세포의 충분 한 숫자 인지 확인 하기 위해 접시 당 4 x이를 반복 합니다. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포를 품 어.
3. 2 개의 24-잘 접시로 6 잘 플레이트에 그리고 결국 T75 플라스 크에 클론 세포를 확장 합니다. 위해 클론, 클론의 3 6 잘 플레이트의 잘 당 플레이트 2 x 10⁶ 세포의 3에 초점. 컨트롤로 nontransduced Jurkat 세포와 다른 3 개의 우물을 접시. 넣어 셀 셀 문화 인큐베이터에서 하룻밤.
4. RNA 추출, 상용 RNA 격리 키트를 사용 하 여. 실 온에서 5 분 동안 233 x g 에서 셀 아래로 회전 시키십시오 하 고 미디어를 제거 합니다. 1 mL 피펫으로 팁을 사용 하 여 세포 세포의 용 해 버퍼의 350 μ에 resuspend. Lysed 세포에 70% 에탄올의 350 μ를 추가 하 고 1 mL 피펫으로 철저 하 게 혼합 한 RNA 열 샘플을 전송.
5. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 추가 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 μ 키트에서 열. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 DNase의 80 µ L을 추가 내가 열; 키트에서 솔루션 실 온에서 15 분 동안 품 어 샘플을 보자.
6. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열에는 키트에서 높은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열을 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가.
7. 컬렉션 튜브에서 열을 제거 하 고 새로운 컬렉션 튜브에 그것을 전송. 10000 x g 1 분 동안에 lysates 회전 하 고, 다음, 1.5 mL 튜브에 RNA 열을 전송. 1 분 동안 10000 x g 에서 스핀을 물 50 µ L를 추가 합니다.
8. RNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 100-500 ng / µ L, 1.9-2.1 사이 260/280 흡 광도와 사이 농도 기대 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장
9. 250 µ L에서 튜브, RNA, DNA (cDNA) 합성 버퍼 보완의 4 µ L, 역전사의 1 µ L의 1 µ g를 추가 하 고 20 µ L의 최종 볼륨을 물 아무 역전사 컨트롤을 포함 합니다. 열 cycler에서 cDNA는 역전사 비활성화를 5 분 동안 95 ° C와 30 분 동안 42 ° C에 음성 합성. 합성 후 물 60 µ L로 cDNA를 희석.
10. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) SYBR 녹색의 5 µ L, cDNA의 4 µ L, 0.5 µ L의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 그리고 반전 뇌관 (10 µ M)의 0.5 µ L을 포함 준비. PCR를 다음과 같이 실행: 1 = 95 ℃ 3 분에 대 한 단계, 단계 2 = 95 ° C 10 s, 단계 3 = 60 ° C에 대 한 10, 고 후, 반복 2 단계와 3 단계 30 x에 대 한.
    참고: dCas9 앞으로 뇌관을 위한 순서는 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 그리고 dCas9 반전 뇌관을 위한 순서는 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 앞으로 뇌관 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT 이며 역 뇌관은 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.

5. gRNA 변환, 선택, 복제 생성, 및 심사

1. 섹션 3에에서 명시 된 포함 하는 gRNA 바이러스 검증된 Jurkat dCas9 셀을 retransduce. 10 일 동안 DMEM hygromycin (보충 표 1)과 셀 선택 합니다. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 미디어 3 일 마다 변경.
2. 셀의 직렬 희석 (4.2 단계에서 설명)를 수행 하 고 (단계 4.3에서에서와 같이) 개별 식민지를 확장 합니다. 4.5 단계에서 설명한 대로 식민지에서 RNA를 정화 하 고 cDNA 합성 단계 4.9에에서 설명 된 대로 수행 합니다. GOI에 대 한 실시간 PCR을 수행 하 고 HPRT1 또는 유사 하 게 PCR 적절 한 내부 관리 유전자 단계 4.10에서 설명한 제외 하 고이 경우에, 웰 스 각 3 단계 후에 순환 하는 이미지.
3. GOI⁸배 변화를 확인 하기 위해 비교 주기 임계값 (Ct) 메서드를 사용 합니다. 간단히, 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 상대 성적 수준 (RTLs) 계산: 2^{-(Ct의 GOI 평균-평균 내부 관리 유전자의 Ct)}. 그런 다음, 컨트롤의 평균 RTL을 계산 하 고 평균 제어 컨트롤 샘플에 비해 배 변화를 생성 하는 RTL 모든 RTL 값을 나누어.

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결과

Overexpress lncRNA IFNG-AS1 듀얼 벡터 시스템
이 원고에 예제 실험 lncRNA IFNG AS1⁹표현 Jurkat T 세포 모델 시스템의 overexpression입니다. IFNG-AS1 인터페론 감마¹⁰규제를 본 선 동적인 장 질병과 관련 된 하는 lncRNA입니다. IFNG-AS1 유전자는 모두 동일한 transcriptional 시작 사이트 (그림 1A)를 사용 하는 3 개의 결합 이체?...

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토론

이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA synthesis kit (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plasmid	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cells	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cells	ATCC	TIB-152	clone E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
Optimem I reduced serum media	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100