Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Resumen

Las técnicas tradicionales basados en cDNA sobreexpresión tienen una aplicabilidad limitada para la sobreexpresión de larga noncoding RNAs debido a sus múltiples formas de empalme con la funcionalidad potencial. Esta revisión informa un protocolo usando tecnología de CRISPR para sobreexpresar múltiples variantes de empalme de un ARN largo cubierta.

Resumen

Durante mucho tiempo los RNA (lncRNA) biología es un campo nuevo y emocionante de la investigación, con el número de publicaciones de este campo crece de manera exponencial desde el año 2007. Estos estudios han confirmado que lncRNAs se alteran en casi todas las enfermedades. Sin embargo, estudiando los roles funcionales de lncRNAs en el contexto de la enfermedad sigue siendo difícil debido a la falta de expresión tejido específica, niveles de expresión baja, productos proteicos, complejidades en formas de empalme y la falta de conservación entre las especies. Dada la expresión propios de cada especie, lncRNA estudios son a menudo restringidos a contextos de investigación al estudio de procesos de la enfermedad. Ya que lncRNAs la función a nivel molecular, una forma de diseccionar lncRNA biología es quitar el lncRNA o sobreexpresan los efectos celulares lncRNA y medida. En este artículo, se presenta un protocolo escrito y visualizar que sobreexpresan la lncRNAs in vitro. Como un experimento representativo, un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, 1 de antisentido interferón Gamma (IFNG-AS1), muestra que es overexpressed en un modelo de Jurkat T-cell. Para lograr esto, la técnica activa de regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) agrupado se utiliza para permitir que la sobreexpresión en los lugares geométricos genomic endógenas. La técnica CRISPR activa apunta a un conjunto de factores de transcripción a la página de inicio transcripcional de un gen, lo que permite una fuerte sobreexpresión de múltiples formas de empalme lncRNA. Este procedimiento se divide en tres pasos, a saber (i) guía RNA (gRNA) diseño y vector construcción, generación (ii) virus y transducción de señales y proyección (iii) Colonia de sobreexpresión. Para este experimento representativo, un mayor de 20-fold mejora en AS1 de IFNG en células Jurkat T se observó.

Introducción

Mientras que la investigación biomédica más se ha centrado en la codificación de proteínas transcripción, la mayoría de los genes transcritos consiste en realmente de noncoding RNAs (comunicado 93 de Ensembl). La investigación actual está empezando a explorar este campo, con el número de publicaciones en lncRNAs en procesos de la enfermedad aumentando exponencialmente entre 2007 y 2017¹. Estas publicaciones muestran que muchos lncRNAs se asocian con la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares de estas lncRNAs son difíciles de estudiar debido a sus diversas funciones en comparación con los mRNAs. Agrava el problema de entender el papel de lncRNAs en la enfermedad, lncRNAs a menudo se expresan a niveles inferiores a codificación RNAs². Además, lncRNAs se conservan mal, que limita los estudios funcionales en humanos célula-línea-técnicas basadas en³. Un método para estudiar el mecanismo de estos nuevos genes es endógeno los sobreexpresan en células cultivadas. Estudios de sobreexpresión pueden proporcionar información clave sobre la función de genes específicos y permiten a los investigadores a diseccionar las vías moleculares claves.

Un nuevo método para activar la transcripción de genes lncRNA se basa en tecnologías CRISPR desarrolladas inicialmente por el laboratorio de Gersbach⁴. Este protocolo ha sido adaptado para el uso en biología lncRNA y para la expresión de estos genes en otros sistemas del modelo. En el CRISPR overexpressing técnica, una proteína llamada proteína CRISPR 9 (Cas9) puede estar dirigida hacia una secuencia de ADN a través de un gRNA antisentido que es reconocido por Cas9. Normalmente, Cas9 inducirá la hendidura de la DNA; sin embargo, las mutaciones en el Cas9, desarrollada previamente en la técnica de sobreexpresión, desactivarán este paso⁵. Cuando un activador transcripcional está fusionado a un Cas9 «muertos» (dCas9) y transduced en líneas celulares, la sobreexpresión endógena de lncRNAs puede ser alcanzado^4,6. La adición de modificaciones adicionales a la gRNA, permitiendo otros factores transcripcionales enlazar a la gRNA, aumentó la eficacia del sistema de activación de gen dCas9 10 veces⁷. Lo importante, se demostró que la activación transcripcional requiere proximidad (< 200 bp) empezar el transcripcional genes de sitio, lo que permite un upregulation específico en zonas ricas en genes⁷. A diferencia de tecnologías de nocaut CRISPR, cintas dCas9 y gRNA necesitan integrarse en el genoma para permitir para que las células conservan un énfasis excesivo sobre varias generaciones. Un método para lograrlo es utilizar lentiviruses para integrar los casetes que contienen la dCas9 y la gRNA. Tras la integración, la expresión del gen lncRNA puede ser determinada.

En este artículo, se demostrará un protocolo para lncRNA sobreexpresión en un modelo de Jurkat T-cell. Un procedimiento paso a paso se muestra y puede ser adaptado también a células adherentes.

Protocolo

Nota: Es importante señalar que este protocolo utiliza replicación deficiente lentivirus. Realizar manejo viral sólo después del entrenamiento de seguridad de laboratorio apropiado. Bleach todos los artículos y las superficies que entran en contacto con virus vivos para un mínimo de 10 minutos después de manipularlo. Uso una protección de la capa y el ojo de la cara de laboratorio desechables, así como guantes dobles, en todo momento. Realizar el trabajo de virus en bioseguridad nivel 2 + laboratorios con certificación viral. Dedicar las campanas de cultivo de tejidos e incubadoras a trabajo viral.

1. diseño y generación de vectores

Nota: La mejor manera de identificar secuencias de gRNA es utilizar herramientas de diseño en línea (por ejemplo, http://crispr-era.stanford.edu) (suplementario Figura 1: diseño de gRNA). Para el experimento representativo que lo acompaña, una compañía diseñó y creó el gRNA vectores utilizados en el experimento representativo. El plásmido dCas9 también fue comprado en línea.

1. La secuencia de gRNA es situada aguas arriba de la secuencia de nucleótidos "NGG", donde "N" es cualquier nucleótido, que además está a 100 pares de bases del sitio de inicio transcripcional. Buscar bases de datos genéticos como BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) la secuencia de gRNA, para asegurarse de que hay no hay otros sitios en el genoma con secuencias similares (suplementario Figura 2: BLAT). Esto asegurará que la secuencia de gRNA es única para el gen de interés (GOI).
2. Almacenar la plásmidos gRNA y dCas9, que vienen como talones bacterianas, a 4 ° C. Racha a Escherichia coli en un Luria agar caldo (LB) de la placa con ampicilina (1 tabla suplementaria) y crecer las bacterias durante la noche a 37 ° C.
3. Seleccione una colonia y crecer las bacterias en 5 mL de LB con ampicilina (1 mesa adicional) durante la noche, sacudiendo vigorosamente la placa en una incubadora de 37 ° C. Al día siguiente, añadir 2 mL de desarrollarse bacterias en 200 mL de LB con ampicilina en un matraz de 2 L, sacude vigorosamente el matraz durante la noche en una incubadora de 37 ° C.
4. Desactivación de la bacteria a 3.724 x g durante 20 min retirar los medios de comunicación y el lugar el tubo que contiene las bacterias en el hielo.
5. Purificar el ADN bacteriano, utilizando un kit de purificación de plásmidos según el protocolo del fabricante.
   Nota: los kits de purificación de plásmidos contienen resuspensión propiedad tampón, tampón de lisis, tampón de lavado, tampón de equilibrado y tampón de elución.
   1. Añadir 10 mL de buffer de resuspensión del kit a la pipeta y las bacterias las bacterias en la solución. A continuación, añadir 10 mL de tampón de lisis del kit a la bacteria resuspendida y mezclar por inversión del tubo. Esperar 5 min para lisar las bacterias; a continuación, añadir 10 mL de tampón de neutralización helada del kit a las bacterias sometidas a lisis y mezclar por inversión del tubo.
   2. Equilibrar la columna de la DNA del kit con 10 mL de tampón de equilibrado para 5 minutos verter las muestras en la columna de la DNA del filtro y deje que la solución pase por el filtro.
   3. Lavar las muestras 2 x con 30 mL de tampón de lavado y luego eluir el ADN con 30 mL de tampón de elución en un tubo cónico de 15 mL. Lentamente la capa 10,5 mL de isopropanol a temperatura ambiente sobre el ADN eluído, invertir el tubo y girar inmediatamente a 16.200 x g durante 30 min a 4 ° C.
   4. Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de etanol al 70% para el pellet de DNA. Resuspender el precipitado por agitando el tubo. Vuelta a 16.200 x g por 10 min a 4 ° C y utilizar una punta de pipeta de 200 μL para eliminar la mayor parte del etanol. Secar el pellet por 5 min y resuspender en 200 μL de agua y guardar el ADN a-20 ° C. La concentración prevista será > 1 μg/μL.

2. generación y partículas de virus cuenta

1. Cuando esté listo para crear el lentivirus que contiene dCAS9, capa platos de cultivo de tejidos de 100 mm con 5 mL de 0.01% poly-L-lisina (suplemento tabla 1). Retire el exceso de líquido de fondo de las placas y dejarlas al aire durante unos minutos en un gabinete de bioseguridad.
2. Placa de 5 x 10⁶ HEK 293T células por plato en 10 mL de completa Dulbecco modificación medio de águila (DMEM) (suplemento tabla 1) y les incuban durante una noche a 37 ° C con 5% CO₂. Al día siguiente, retire el medio de los platos HEK 293T y añadir 10 mL de DMEM completo.
3. 6.5 mezcla μg de plásmido pMDLg/pRRE que contienen gag/pol (componentes del virus), 3,5 μg de la pMDG2.G de plásmido que contiene el VSV-G (un componente del virus), 2,5 μg de plásmido pRSV-Rev que contiene Rev (un componente del virus), 10 μg de una (repetición terminal larga LTR)-que contiene un gRNA vector o un dCas9 que contiene el litro vector y agregue agua hasta un volumen total de 450 μL. Filtrar la mezcla a través de una punta de filtro de 0.2 μm unida a una jeringa.
4. Añadir 50 μl de 2.5 M CaCl₂ (suplemento tabla 1) para cada muestra de la transfección de la DNA y mezclar suavemente. Filtrar la mezcla de calcio ADN a través de una punta de filtro de 0.2 μm unida a una jeringa. Pipetear 500 μl de 2 x HBS (suplemento tabla 1) en un tubo de poliestireno de 5 mL. Añadir los 500 μl ADN/CaCl₂ mezclar gota a gota y vortex. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
5. Añadir lentamente 1 mL de la suspensión de ADN/CaCl₂/HBS a cada plato. Inmediatamente remolino los platillos para distribuir el contenido uniformemente. Incubar cada plato durante la noche en una 5% CO₂ incubadora a 37 ° C.
6. El día 3, poco a poco Quite y deseche los medios de comunicación de los platos. Lavar cuidadosamente las células 1 x con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 6 mL de DMEM completo suplementado con 20 mM HEPES y butirato de sodio 10 mM. Incube las células para 5 – 6 h en una 5% CO₂ incubadora a 37 ° C.
7. Lavar las células 1 x con PBS y añadir 5 mL de DMEM completo con 20 mM HEPES a las células HEK 293T. Incubar durante 12 h durante la noche en una 5% CO₂ incubadora a 37 ° C.
8. El día 4, recoger el sobrenadante de células HEK 293T y filtrar el sobrenadante. Congelar en alícuotas de 1 mL a-80 ° C.
9. Cuando esté listo para usar el virus, descongele una alícuota de la partícula viral contiene media condicionada (almacenado como se describe en paso 2.8) en el hielo. Traiga todos los reactivos a temperatura ambiente.
10. Utilice un kit de ensayo genitals del Immunosorbent (ELISA) p24 para cuantificar el número de partículas virales por mililitro.
    1. Diluir el concentrado de lavado desde el kit mediante la adición de 19 partes de agua destilada desionizada. Diluir el control positivo del kit a 200 ng/mL, usando RMPI 1640 como diluyente y hacer las diluciones de la curva estándar de 1,5 mL tubos según el p24 tabla de dilución de ELISA (tabla 2 suplementaria).
    2. Añadir 20 μL del 5% Tritón X-100, a excepción del sustrato en blanco. Añadir 200 μL de RPMI 1640 a los pocillos de control negativo. Añadir 200 μL de cada norma (en duplicado) para los pozos designados.
    3. Mediante un espectrofotómetro, medir la concentración del virus en las muestras, usando una curva estándar. Iniciar la dilución de la muestra en 1:1,000 y modificar el volumen según sea necesario para estar dentro del intervalo de la curva estándar. Diluir las muestras con Triton X-100 para una concentración final de 0.5% y añadir 200 μL de cada muestra en RPMI 1640 a pocillos designados. Sellar la placa e incubar por 2 h a 37 ° C.
    4. Lave la placa de 6 x con 300 μL de 1 x de tampón de lavado por pocillo. Invertir la placa y golpeando sobre una toalla de papel para quitar cualquier exceso de líquido. Añadir 100 μL de anticuerpo detector del kit a excepción del sustrato en blanco. Sellar la placa e incubar durante 1 h a 37 ° C. Lave la placa y, a continuación, quite cualquier exceso de líquido invertir la placa y golpeando sobre una toalla de papel.
    5. Para medir el anticuerpo detector, preparar estreptavidina-peroxidasa (HRP-SA) dentro de 15 minutos de uso. Diluir el SA-HRP en el 1: 100 con diluyente de SA-HRP. Homogeneizar el SA-HRP diluido y agregue 100 μL a excepción del blanco. Sello e incubar la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Lavar la placa con 1 x de tampón de lavado y toque a cualquier exceso de líquido como en el paso 2.10.4. Utilizar solución de sustrato orto-fenilendiamina (OPD), que proporciona a la peroxidasa de los sustratos necesarios para producir la quimioluminescencia, dentro de 15 minutos de preparación. Utilizar una tableta OPD a 11 mL de substrato diluyente para cada placa.
    7. Vórtice de la solución OPD vigorosamente para disolver completamente y proteger de la luz. Añada 100 μL de solución de sustrato OPD en todos los pocillos, incluyendo el espacio en blanco. Utilizando un espectrofotómetro, leer la absorbancia a 450 nm inmediatamente, repita este x 10 a intervalos de 1 s y tomar la medición promedio.

3. dCas9 -VP64 transducción

1. Células de Jurkat T cultura en DMEM completo en un matraz T75 con una densidad de 2 x 10⁶ células en 15 mL de medio. Cultura de las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂.
2. Desactivación de las células por 5 min a 233 x g y, luego, les resuspender en 10 mL de suero reducidos medios. Contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
3. Suspender y placa de 1 x 10⁶ células de Jurkat en 5 mL de medio de suero reducido con polibreno (suplemento tabla 1) en un matraz T75. Añadir HEK 293T acondicionado los medios que contienen partículas virales que contiene dCas9 de 1 x 10⁶ . El número de partículas virales puede calcularse aproximadamente de la p24 ELISA porque 1 p24 μg/mL es igual a 1 x 10⁷ partículas virales. Poner los frascos en incubadora de 37 ° C con 5% CO₂.

4. selección de clones y creación

1. Tres días post-infección, desactivación de las células a 233 x g durante 5 min y resuspender en 10 mL de DMEM completo con puromicina (suplemento tabla 1). Placa las células en frascos T75 y cultivo a 37 ° C con 5% CO₂. Cada tercer día, durante un período de 9 días, desactivación de las células a 233 x g durante 5 min y vuelva a colocar los medios de comunicación con DMEM completo con puromicina.
2. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. En una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos, 10.000 células placa en 100 μL de DMEM completo con puromicina en el primer en serie y así diluir 1:1 el contenido de los siguientes pozos con DMEM completo con puromicina. Realizar 24 diluciones y repita este x 4 por placa para asegurar que haya un número adecuado de células por pocillo. Incube las células a 37 ° C con 5% CO₂.
3. Expandir las células clonales en dos placas de 24 pocillos, luego en una placa de 6 pozos y eventualmente en un matraz T75. Con el fin de centrarse en tres de los clones, placa de 2 x 10⁶ de células por pozo de una placa de 6 pozos para tres de los clones. Los otros tres pozos de la placa con células Jurkat nontransduced como controles. Poner las células en una incubadora de cultivo celular durante la noche.
4. Para la extracción de RNA, utilice un kit de aislamiento de RNA comercialmente disponible. Desactivación de las células a 233 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar los medios de comunicación. Utilice una punta de la pipeta de 1 mL para resuspender las células en 350 μL de tampón de lisis. Añadir 350 μL de etanol al 70% de las células sometidas a lisis y mezclar cuidadosamente con una pipeta de 1 mL, transferir la muestra a la columna de RNA.
5. Girar los lisados a 10.000 x g durante 1 min, quitar el flujo a través y añadir 700 μL de tampón de lavado bajo rigor del kit a la columna. Girar los lisados a 10.000 x g durante 1 min, quitar el flujo a través y añadir 80 μl de DNasa I solución del kit a la columna; dejar las muestras incubar por 15 min a temperatura ambiente.
6. Girar los lisados a 10.000 x g durante 1 min, quitar el flujo a través y añadir 700 μl de tampón de lavado de alto rigor del kit a la columna. Girar los lisados a 10.000 x g durante 1 min, quitar el flujo a través y añadir 700 μl de tampón de lavado de baja astringencia a la columna.
7. Retire la columna del tubo de colección y transferirlo a un tubo nuevo de colección. Girar los lisados a 10.000 x g durante 1 min y, a continuación, transferir la columna de RNA a un tubo de 1,5 mL. Añadir 50 μl de agua a la columna y centrifugado a 10.000 x g durante 1 minuto.
8. Use un espectrofotómetro para cuantificar la concentración de RNA. Esperar que la concentración entre 100-500 ng/μl, con una absorbancia de 260/280 entre 1.9-2.1. Guardar el ARN a-80 ° C.
9. En 250 μl tubos, agregar 1 μg de RNA, 4 μL de tampón de síntesis de DNA (cDNA) complementario, 1 μl de transcriptasa reversa, y agua hasta un volumen final de 20 μl. no incluir ningún control de la transcriptasa reversa. En un termociclador, sintetizar el cDNA a 42 ° C por 30 min y a 95 ° C por 5 min inactivar la transcriptasa inversa. Diluir el cDNA con 60 μL de agua después de la síntesis.
10. Preparar la reacción en cadena de polimerasa (PCRs) que contiene 5 μl de verde de SYBR, 4 μL de cDNA, 0,5 μl de cebador forward (10 μm) y 0,5 μl de cebador reverso (10 μm). Ejecutar la polimerización en cadena como sigue: paso 1 = 95 ° C por 3 min, paso 2 = 95 ° C durante 10 s, paso 3 = 60 º C durante 10 s y luego, repita pasos 2 y 3 de 30 x.
    Nota: La secuencia de la cartilla de dCas9 adelante es 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA y la secuencia de la cartilla de dCas9 inversa es 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. El primer avance de hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) es 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT y el cebador reverso es 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.

5. gRNA transducción, selección, copia , creación y proyección

1. Retransduce las células de Jurkat dCas9 validadas con gRNA que contienen virus como se describe en la sección 3. Seleccionar celdas en DMEM con Higromicina (suplemento tabla 1) durante 10 días. Desactivación de las células y cambiar el medio cada 3 días.
2. Realizar una dilución seriada de las células (como se describe en el paso 4.2) y ampliar las colonias individuales (como se describe en el paso 4.3). Purificar el RNA de las colonias exactamente como se describe en el paso 4.5 y realizar síntesis de cDNA como se describe en el paso 4.9. Realizar PCR en tiempo real contra el GOI y HPRT1 o un gen de limpieza adecuada, de manera similar a la PCR descrita en el paso 4.10, excepto en este caso, imagen que los pozos cada ciclo tras el paso 3.
3. Utilice el método de comparativa ciclo umbral (Ct) para determinar el cambio doble en el GOI⁸. Brevemente, utilice la siguiente ecuación para calcular niveles de transcripción relativa (RTLs): 2^{-(promedio de Ct de GOI-promedio de Ct del gen de la limpieza)}. A continuación, calcular el promedio RTL de los controles y dividir todos los valores de RTL por medio del control RTL para generar un cambio doble en comparación con las muestras de control.

Resultados

Un sistema de doble vector para sobreexpresar lncRNA interferon-AS1
El experimento de ejemplo en este manuscrito es la sobreexpresión de un sistema de modelo de células Jurkat T expresando lncRNA interferon-AS1⁹. Interferon-AS1 es un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, que se ha visto regular interferón Gamma¹⁰. El gen del IFNG-AS1 contiene tres variantes de empalme que todos utilizan el mismo sitio d...

Discusión

Este manuscrito presenta un protocolo para utilizar activar CRISPR para sobreexpresar lncRNAs in vitro. Se trata de una técnica especialmente importante al estudiar la larga noncoding RNAs como producto transcriptómicos es la unidad funcional. Después de sobreexpresión, el investigador puede, entonces, utilizar estas células para aumentar la relación señal a ruido al estudiar a socios de enlace y medir incluso las consecuencias celulares de aumento de los niveles de lncRNAs. Además, como lncRNAs con frecuencia ac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA synthesis kit (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plasmid	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cells	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cells	ATCC	TIB-152	clone E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
Optimem I reduced serum media	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100