CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

要約

伝統的な cDNA を用いた発現技術の潜在的な機能を持つ、複数のスプライス フォームによる長鎖非コード Rna 発現限定適用しています。このレビューは、長鎖非コード RNA の複数のスプライスバリアント ノザンに CRISPR 技術を使用してプロトコルを報告します。

要約

長鎖非コード RNA (lncRNA) 生物学は 2007 年以来指数関数的に成長しているこの分野の出版物の数との研究の新しいでエキサイティングなフィールドです。これらの研究では、lncRNAs は、ほとんどすべての疾患に変更されてことを確認しました。ただし、疾患のコンテキストで lncRNAs の機能的役割を勉強はスプライス フォームの複雑さ、低発現、組織特異的発現タンパク質製品の欠如と種の保全の欠如のために困難。種特異的な発現を与え、lncRNA 研究が多い人間研究の文脈に制限された病気プロセスを学ぶとき。LncRNAs は、分子レベルで機能するので、lncRNA 生物学を分析する方法の 1 つは、lncRNA を削除または lncRNA とメジャーの細胞効果をノザンです。この記事でノザン lncRNAs 体外に書かれ、可視化プロトコルを提案する.代表的な実験としてインターフェロン ガンマ アンチセンス 1 (IFNG AS1)、炎症性腸疾患に関連付けられている、lncRNA は Jurkat T 細胞モデルで過剰に発現するのに表示されます。これを行うには、アクティブ クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 技術を使用して、内因性のゲノム遺伝子の過剰発現を有効に。活性化の CRISPR 技術目標は複数 lncRNA スプライス フォームの堅牢な過剰発現を有効に、遺伝子の転写開始サイトに転写因子のセット。この手順は、3 つのステップ、すなわち (i) ガイド RNA (gRNA) 設計とベクトル建設、(ii) ウイルス生成と伝達、および (iii) コロニー発現スクリーニングに分解されます。この代表的な実験のため Jurkat T 細胞における IFNG AS1 で造影効果が 20 よりも大きいのです。

概要

最も生物医学研究、蛋白質のコーディングの成績に焦点を当て、転写されている遺伝子の大半は実際に非翻訳 Rna (Ensembl リリース 93) ので構成されます。現在の研究は、2007 年と 2017¹間に指数関数的に上昇病気プロセスの lncRNAs の出版物の数と、この分野を開拓し始めています。これらの出版物は、多くの lncRNAs が病気に関連付けられているを示しています。ただし、これらの lncRNAs の分子機構は Mrna と比べて多様な機能のための勉強は難しいです。疾患における lncRNAs の役割を理解することの問題を複合、lncRNAs はコーディング RNAs²よりも低いレベルで表されます。さらに、lncRNAs は、人間のセル行ベース テクニック³機能研究を制限する不完全、保存されます。これらの新規遺伝子のメカニズムを勉強する 1 つの方法は、培養細胞でそれらを内生ノザンすることです。過剰発現研究は特定の遺伝子の機能に関して重要な情報を提供し、重要な分子経路を分析する研究者を有効にできます。

LncRNA 遺伝子の転写をアクティブにする新しいメソッドは、ゲルバッチ研究室⁴によって最初に開発された CRISPR 技術に基づいています。このプロトコルは、lncRNA 生物学で使用するため、他のモデル システムにおけるこれらの遺伝子の表現のために適応されています。テクニックを過剰発現 CRISPR、CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と呼ばれるタンパク質は Cas9 によって認識されるアンチセンス gRNA を介して DNA シーケンスへ送信できます。通常、Cas9 を誘発する DNA 切断;ただし、以前過剰発現手法の開発、Cas9 の突然変異は、このステップ⁵を非アクティブ化します。「死んだ」Cas9 に転写活性化因子を融合するとき (dCas9) 細胞に導入、lncRNAs の内因性の過剰発現は達成^4,6をすることができます。その他の転写因子、gRNA にバインドするを有効にする、gRNA に修正を加える添加 dCas9 遺伝子活性化システムの有効性を増加した 10 倍⁷。重要なは、近接転写活性化が必要であることを示した (< 200 bp)、転写開始サイト遺伝子、遺伝子の豊富なエリア⁷で特定アップレギュレーションを有効にします。CRISPR ノックアウト技術とは異なり dCas9 と gRNA のカセットは、複数世代にわたって過剰発現を保持する細胞では、ゲノムに統合する必要があります。これを達成する 1 つの方法は、レンチを使用して dCas9 と gRNA を含むカセットを統合することです。統合後、lncRNA の遺伝子発現を決定できます。

この記事で Jurkat T 細胞モデルにおける lncRNA 発現のためのプロトコルが表示されます。ステップバイ ステップの手順が表示され、また付着性のセルに適応することができます。

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プロトコル

注:このプロトコルが複製欠損のレンチを使用することに注意してくださいすることが重要です。ラボで適切な安全訓練の後にのみウイルス処理を実行します。すべてのアイテムおよび処理後 10 分の最低の生きているウイルスの接触表面を漂白剤します。使用使い捨て可能な実験室のコートと顔/目の保護だけでなく、二重の手袋はすべての回します。実験室バイオ セーフティ レベル 2 + ウイルス認定でウイルスの仕事を実行します。ティッシュ文化フードとインキュベーターをウイルスの仕事に捧げます。

1. ベクトル設計と生成

注:GRNA シーケンスを識別する最良の方法はオンライン デザイン ツール (http://crispr-era.stanford.edu など) を使用する (補足図 1: gRNA デザイン)。それに伴う代表的な実験の会社が設計し、代表的な実験で使用される gRNA ベクトルを作成します。DCas9 プラスミドもオンラインで購入しました。

1. GRNA シーケンスは、"NGG"、場所"N"はまた 100 塩基対の遺伝子の転写開始サイト内にある任意のヌクレオチド塩基の上流側にあります。類似シーケンスのゲノムに他のサイトがないかどうかを確認する gRNA シーケンスの BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) などの遺伝子のデータベースを検索 (補足図 2: BLAT)。これは gRNA のシーケンスが興味 (GOI) の遺伝子に一意であることが保証されます。
2. 4 ° C での細菌のスタブとして来る gRNA と dCas9 のプラスミドを格納します。寒天スープ (LB) アンピシリン (補足表 1) 板し、37 ° C で一晩バクテリア ルリアのエシェリヒア属大腸菌の縞
3. コロニーをピックアップし、37 ° C の定温器でプレートを精力的に揺れアンピシリン (補足表 1) 一晩、LB の 5 mL 中の細菌を成長します。次の日、追加の 2 mL 2 L フラスコ、37 ° C のインキュベーターで一晩フラスコを精力的に揺れでアンピシリンと LB の 200 mL に細菌成長します。
4. 3,724 x gで 20 分間削除メディアで細菌や氷の上の細菌を含んでいる管の場所をスピンダウンします。
5. 製造元のプロトコルごとのプラスミド精製キットを使用して細菌の DNA を浄化します。
   注:プラスミド精製キットを含む独自の再懸濁バッファー、換散バッファー、洗浄バッファー、平衡バッファー、および溶出バッファー。
   1. 10 mL の再懸濁バッファー キットから細菌やピペットを細菌ソリューションに追加します。キットの再懸濁の細菌に 10 mL の溶解バッファーを追加し、チューブの反転によってそれらをミックスします。細菌を溶解する 5 分を待つキットから分離細菌に 10 mL の氷冷の中和バッファーを追加し、チューブの反転によってそれらをミックスします。
   2. 10 ml の 5 分注ぐ DNA 列にサンプル フィルターし、フィルターを通過するソリューションの平衡バッファーのキットから DNA コラムを平衡させ。
   3. サンプル 2 を洗って 30 ml x 洗浄バッファーと、その後、30 ml の 15 mL の円錐管に溶出バッファーの DNA を溶出します。10.5 mL 室温溶出の DNA にイソプロパノールをゆっくりと層、チューブを反転させるし、すぐに 4 ° C で 30 分間 16,200 x gでスピン
   4. 上澄みを除去し、DNA ペレットを 70% エタノール 1 mL を追加します。チューブをフリックすることでペレットを再懸濁します。4 ° C で 10 分間 16,200 x gでスピンし、エタノールの大部分を除去する 200 μ L ピペット チップを使用します。5 分のペレットを風乾、200 μ L の水でそれを再懸濁します、-20 ° C で DNA を保存予想される濃度になります > 1 μ g/μ L。

2. ウイルスの生成と粒子数

1. DCAS9 を含むレンチ ウイルスを作成する準備ができたら、5 ml の 0.01% ポリ L リジン (補足表 1) の 100 mm ティッシュの培養皿をコートします。プレートから徹底的に余分な液体を削除させ、バイオ セーフティ キャビネットの数分の風乾。
2. 完全なダルベッコの 10 mL の皿あたりプレート 5 x 10⁶ HEK 293 t 細胞はイーグル培地 (DMEM) (補足表 1) を変更し、5% CO₂と 37 ° C で一晩それらを孵化させなさい。次の日、HEK 293 t 料理からメディアを削除して完全な DMEM の 10 mL を加えます。
3. ミックス 6.5 μ g のプラスミド pMDLg/pRRE ギャグ/ポル (ウイルスのコンポーネント) を含む VSV G (ウイルスのコンポーネント) を含むプラスミド pMDG2.G の 3.5 μ g 2.5 μ g のプラスミド pRSV Rev 含む Rev (ウイルスのコンポーネント)、長いターミナル繰り返し (10 μ gLTR)-gRNA ベクトルまたは LTR を含む dCas9 を含むベクトルし、450 μ L の容量に水を追加します。注射器の 0.2 μ m フィルター先端からの混合物をフィルター処理します。
4. DNA の各遺伝子サンプルに 2.5 M CaCl₂ (補足表 1) の 50 μ L を加え、優しく混ぜます。注射器の 0.2 μ m フィルター先端からのカルシウム/DNA 混合物をフィルター処理します。ピペット 500 μ L の 2 x HBS (補足表 1) 5 mL ポリスチレン管に。500 μ L の DNA/CaCl₂ミックス滴と軽く渦を追加します。3 分間室温でインキュベートします。
5. ゆっくりとそれぞれの皿に DNA/CaCl₂/HBS 懸濁液の 1 mL を追加します。すぐに内容を均等に料理を旋回します。各皿 37 ° C で 5% CO₂インキュベーターで一晩インキュベートします。
6. 3 日目、ゆっくりと取り外し、皿からメディアを破棄です。慎重に洗浄セル 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で x。20 mM HEPES と 10 mM 酪と完全な DMEM の 6 mL を追加します。37 ° C で 5% CO₂インキュベーターで 5-6 時間細胞をインキュベートします。
7. 1 セルを洗浄して PBS の x と HEK 293 t 細胞を 20 mm HEPES 完全な DMEM の 5 mL を追加。37 ° C で 5% CO₂インキュベーターで一晩 12 時間インキュベートします。
8. 4 日 HEK 293 t 細胞培養上清を収集し、上清をフィルター処理します。-80 ° C で 1 mL 因数を凍結します。
9. ウイルスを使用する準備ができたら、氷の上のエアコンのメディア (に記載されているステップ 2.8 として格納されます) を含むウイルスの粒子の因数を解凍します。すべての試薬を室温に戻します。
10. 1 ミリリットルあたりのウイルスの粒子の数を定量化するのに p24 酵素結合抗体法 (ELISA) キットを使用します。
    1. 脱イオン蒸留水の 19 のパーツを追加して、キットから洗浄濃縮を希釈します。200 ng/ml のキットから肯定的な制御を希釈、ELISA 希釈表 (補足テーブル 2) の p24 によると管の 1.5 mL の標準曲線の希釈液が希釈剤とする RMPI 1640 を使用しています。
    2. 5% の 20 μ L を追加基板の空白を除くすべてのウェルにトリトン X-100。陰性対照の井戸に RPMI 1640 の 200 μ L を追加します。指定された井戸に (重複) 内の各標準の 200 μ L を追加します。
    3. 分光光度計を使用して、標準曲線を使用して、サンプル内のウイルスの濃度を測定します。縮尺でサンプル希釈を起動し、標準曲線の範囲内であるために必要に応じてボリュームを変更します。最終濃度 0.5% トリトン X-100 とサンプルを希釈し、指定された井戸に RPMI 1640 年に各サンプルの 200 μ L を追加します。プレート シールし、37 ° C で 2 時間インキュベート
    4. 6、洗浄を 1 ウェルあたり洗浄バッファー x 300 μ x。プレートを反転し、ペーパー タオルで軽くたたいて、余分な水分を削除します。空白の基板を除くすべての井戸にキットから検出抗体の 100 μ L を追加します。プレート シールし、37 ° C で 1 時間インキュベート皿を洗うし、その後、プレートを反転し、ペーパー タオルで軽くたたいて、余分な水分を削除します。
    5. 検出抗体を測定するためにストレプトアビジン - hrp SA-) 使用の 15 分以内に準備します。SA HRP 希釈液と 1: 100 で SA HRP を希釈します。希薄化後の SA HRP を徹底的にミックスし、空白を除くすべてのウェルに 100 μ L を追加します。密封し、室温で 30 分間プレートを孵化させなさい。
    6. 洗浄バッファー x 1 を洗浄し、離れてステップ 2.10.4 のように余分な液体をタップします。オルト-フェニレンジアミン (OPD) 基板の解決、ペルオキシダーゼ化学発光、準備 15 分以内を生成する必要な基板を提供するを使用します。各プレートに希釈基板 11 mL に 1 つの OPD タブレットを使用します。
    7. 渦完全に溶解し、光から保護するために、積極的に OPD ソリューション。空白を含むすべての井戸に OPD 基質溶液 100 μ L を追加します。450 で吸光度を読み取り、分光光度計を使用して nm は、すぐにこの 10 倍を 1 秒間隔で繰り返すし、平均測定を取りなさい。

3 dCas9 -VP64 伝達

1. メディアの 15 mL の 2 x 10 の⁶セルの密度と T75 フラスコで完全な DMEM Jurkat T 細胞。5% CO₂と 37 ° C の定温器の細胞を培養します。
2. スピン ・ ダウン 233 × gで 5 分間細胞と、その後、低下した血清中のメディアの 10 mL でそれらを再懸濁します。診断または自動化された細胞カウンターにセルをカウントします。
3. 再懸濁します、T75 フラスコに polybrene (補足表 1) で 1 × 10⁶ 5 mL の低血清培 Jurkat 細胞をプレートします。1 x 10 の⁶ dCas9 を含むウイルス粒子を含む HEK 293 t 付きメディアを追加します。ウイルス粒子の数は、p24 から大体計算できます ELISA 1 μ g/mL p24 1 x 10⁷ウイルス粒子に等しいので。5% CO₂と 37 ° C の定温器で、フラスコを置きます。

4. 選択とクローン作成

1. 3 日後の感染症は、233 x gで 5 分で細胞をスピン、ピューロマイシン (補足表 1) と完全な DMEM の 10 mL でそれらを再懸濁します。T75 フラスコで細胞をプレートし、5% CO₂と 37 ° C でそれらを文化します。9 日の期間に 3 日ごと 233 x gで 5 分で細胞をスピンし、ピューロマイシンと完全な DMEM にメディアを交換します。
2. 診断または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。組織培養と治療 96 ウェル プレート、上最初のピューロマイシンと完全な DMEM の 100 μ l プレート 10,000 のセルも連続希薄と 1:1 ピューロマイシンと完全な DMEM に次の井戸の内容。24 希釈を行い、ウェルあたりの細胞の十分な数があることを確認するためにこの 4 x プレートごとを繰り返します。5% CO₂と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
3. 2 つの 24 ウェル プレートにし、6 ウェル プレートに、最終的に T75 フラスコにクローン細胞を展開します。ために、クローン、クローンの 3 つの 6 ウェル プレートのウェルあたりのプレート 2 x 10⁶細胞の 3 つに焦点を当てます。Nontransduced Jurkat 細胞と他の 3 つの井戸をコントロールとしてプレートします。細胞文化のインキュベーターでセルを一晩置きます。
4. RNA の抽出、市販の RNA 分離キットを使用します。室温で 5 分間 233 x gで細胞をスピン、メディアを取り出します。1 mL のピペット チップを使用すると、換散バッファーの 350 μ L で細胞を再懸濁します。分離セルに 70% のエタノールの 350 μ L を追加、1 mL ピペットで混和し、サンプルを RNA 列に転送します。
5. 1 分の 10,000 x gで lysates をスピン、フローから削除、キットから低金詰りの洗浄バッファーの 700 μ L を列に追加します。1 分の 10,000 x gで lysates をスピン、フローを通じて削除し、DNase の 80 μ L を追加私ソリューション キットから列へサンプルを室温で 15 分間インキュベートをしましょう。
6. 1 分 10,000 x gで lysates をスピン、フローから削除し、キットから高い金詰りの洗浄バッファーの 700 μ L を列に追加します。1 分 10,000 x gで lysates をスピン、フローから削除し、低金詰りの洗浄バッファーの 700 μ L を列に追加します。
7. コレクションの管から列を削除し、新しいコレクションの管にそれを転送します。1 分の 10,000 x gで lysates をスピンし、その後、1.5 mL チューブに RNA 列を転送します。列と 1 分の 10,000 x gでスピンに 50 μ L の水を追加します。
8. 分光光度計を使用して、RNA 濃度を定量化します。100-500 ng/μ L、1.9-2.1 間 260/280 吸光度との間に濃度を期待してください。-80 ° C で RNA を保存します。
9. 250 μ L のチューブ、追加の RNA、相補的 DNA (cDNA) 合成バッファーの 4 μ、1 μ L、逆転写酵素の 1 μ g と水 20 μ L の最終巻には逆転写酵素コントロールを含めません。サーマルサイクラー、42 ° C、30 分、95 ° C、5 分逆転写酵素を不活化する cDNA を合成します。合成後の水の 60 μ L で cDNA を希釈します。
10. SYBR グリーンの 5 μ L、cDNA の 4 μ L、前方のプライマー (10 μ M) の 0.5 μ L、逆プライマー (10 μ M) の 0.5 μ L を含むポリメラーゼ連鎖反応 (Pcr) を準備します。PCR を次のように実行: 1 = 95 ° C 3 分の 2 = 95 ° C の 10 のステップ、s、ステップ 3 = 60 ° C、10 s のため、その後、繰り返し手順 2 と 30 倍の 3。
    注: dCas9 前方プライマー シーケンスは 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA、dCas9 逆プライマー シーケンスは 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT。ヒポキサンチン Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) の前方のプライマーは 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT、逆プライマーは 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT。

5. gRNA伝達、選択、クローン作成、およびスクリーニング

1. セクション 3 で説明したように、検証 Jurkat dCas9 細胞 gRNA を含むウイルスを retransduce します。10 日間 DMEM で hygromycin (補足表 1) のセルを選択します。セルを回し、メディアを変更するごとに 3 日間。
2. (4.2 の手順で説明) セルのシリアル希薄を実行し、(前述の手順 4.3 で) 個々 のコロニーを展開します。4.5 の手順に記載されているとおりのコロニーからの RNA の浄化し、cDNA 合成手順 4.9 を実行します。五井に対してリアルタイム PCR を行い、この場合、各井戸サイクル ステップ 3 の後画像を除く手順 4.10, で説明した HPRT1 または PCR と同様に、適切なハウスキーピング遺伝子。
3. 五井⁸のフォールドの変更を決定するのに比較期間しきい値 (Ct) メソッドを使用します。簡単に言えば、相対的なトラン スクリプト レベル (RTLs) を計算する次の式を使用: 2^{-(五井 Ct の平均-ハウスキーピング遺伝子の Ct を平均)}。コントロールの平均の RTL を計算し、平均コントロール コントロールのサンプルと比較してフォールドの変更を生成する RTL で RTL のすべての値を除算します。

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結果

ノザン lncRNA IFNG AS1 に二重ベクトル システム
本稿では例の実験は IFNG AS1⁹lncRNA を表現する Jurkat T 細胞系の過剰発現です。IFNG AS1 はインターフェロン γ¹⁰を規制する見られている炎症性腸疾患に関連付けられている、lncRNA です。AS1 IFNG 遺伝子には、すべてが同じ遺伝子の転写開始サイト (図 1 a) ?...

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ディスカッション

この原稿は、ノザン lncRNAs 体外に CRISPR のアクティブ化を使用するためのプロトコルを示します。トランスクリプトーム製品は機能ユニット長鎖非コード Rna を勉強するとき、これは特に重要な手法です。過剰発現後研究者は結合パートナーを勉強して、信号対雑音比を増加も lncRNAs の増加レベルの細胞の結果を測定し、これらの細胞を使用できます。さらに、lncRNAs は、cis 遺伝子頻繁に基づ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA synthesis kit (iScript)	BioRad	1708891
dCas9 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Ethanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA plasmid	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T cells	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 forward primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat cells	ATCC	TIB-152	clone E6-1
L-glutamine	Corning	25005Cl
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
Optimem I reduced serum media	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100