استخدام في فيفو تسجيل واحد من الألياف والعقدة الجذر الرحالة سليمة مع العصب الوركي المرفقة لدراسة آلية فشل التوصيل

Summary

تسجيل الألياف الواحدة هو تقنية كهربائية فسيولوجية فعالة تنطبق على الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. جنبا إلى جنب مع إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة ، يتم فحص آلية فشل التوصيل. كلا البروتوكولين تحسين فهم علاقة الجهاز العصبي المحيطي مع الألم.

Abstract

كان تسجيل الألياف الواحدة تقنية كهرولوجية كلاسيكية وفعالة على مدى العقود القليلة الماضية بسبب تطبيقه المحدد للألياف العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تنطبق هذه الطريقة بشكل خاص على العقد الجذرية الظهرية (DRG)، وهي الخلايا العصبية الحسية الأولية التي تظهر بنية شبه أحادية القطب من العمليات العصبية. أنماط وملامح إمكانات العمل مرت على طول المحاور قابلة للتسجيل في هذه الخلايا العصبية. تستخدم هذه الدراسة في تسجيلات الألياف الواحدة في الجسم الحي لمراقبة فشل التوصيل للأعصاب الوركية في الفئران الكاملة التي تعالجها فريوند (CFA). كما لا يمكن دراسة الآلية الأساسية باستخدام في التسجيلات في الجسم الحي من الألياف الواحدة، يتم تنفيذ التصحيح المشبك التسجيلات من الخلايا العصبية DRG على الاستعدادات من DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة. تكشف هذه التسجيلات عن وجود ارتباط إيجابي بين فشل التوصيل والمنحدر الصاعد لإمكانات ما بعد فرط الاستقطاب (AHP) للخلايا العصبية DRG في الحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية. يسمح بروتوكول تسجيلات الألياف أحادية في الجسم الحي بتصنيف الألياف العصبية عن طريق قياس سرعة التوصيل ورصد الظروف غير الطبيعية في الألياف العصبية في بعض الأمراض. DRG سليمة مع العصب المحيطي المرفقة يسمح مراقبة نشاط الخلايا العصبية DRG في معظم الظروف الفسيولوجية. بشكل قاطع، تسجيل الألياف الواحدة جنبا إلى جنب مع تسجيل الكهرولوجية من DRGs سليمة هو وسيلة فعالة لدراسة دور فشل التوصيل أثناء عملية مسكن.

Introduction

يضمن الانتقال الطبيعي للمعلومات على طول الألياف العصبية الوظيفة الطبيعية للجهاز العصبي. وينعكس الأداء غير الطبيعي للجهاز العصبي أيضا في انتقال الإشارات الكهربائية للألياف العصبية. على سبيل المثال ، يمكن تصنيف درجة إزالة التمنة في آفات إزالة المليون المركزية من خلال مقارنة التغيرات في سرعة التوصيل العصبي قبل وبعد تطبيق التدخل¹. من الصعب تسجيل الألياف العصبية داخل الخلايا، إلا في الاستعدادات الخاصة مثل محور الحبار العملاق أكسون². ولذلك، فإن النشاط الكهرولوجيولوجي قابل للتسجيل فقط عن طريق التسجيل خارج الخلية للألياف واحدة. باعتبارها واحدة من الأساليب الكهرولوجية الكلاسيكية، تسجيل الألياف واحدة لديها تاريخ أطول من التقنيات الأخرى. ومع ذلك، فإن عدد أقل من علماء الفيزيولوجيا الكهربائية فهم هذه الطريقة على الرغم من تطبيقها على نطاق واسع. ولذلك، هناك حاجة إلى إدخال مفصل للبروتوكول القياسي لتسجيل الألياف الواحدة من أجل تطبيقه المناسب.

على الرغم من أن تقنيات التصحيح المشبك المختلفة هيمنت على الدراسة الكهرولوجية الحديثة، لا يزال تسجيل الألياف الواحدة يلعب دورا لا بديل له في تسجيل أنشطة الألياف العصبية، وخاصة الألياف التي تنقل الإحساس المحيطي مع جسم الخلية الحسية الموجودة في العقدة الجذرية الأورسية (DRG). ميزة استخدام تسجيل الألياف واحدة هنا هو أنه في تسجيل الألياف الحية يوفر وقت مراقبة طويل مع القدرة على تسجيل الاستجابات للمحفزات الطبيعية في نماذج ما قبل السريرية دون اضطراب في البيئة داخل الخلايا^{3 , 4}.

وقد درس عدد متزايد من الدراسات على مدى العقدين الماضيين وظائف معقدة على طول الألياف العصبية⁵، وفشل التوصيل ، والذي يعرف بأنه حالة من انتقال دفعة العصب غير ناجحة على طول محور، كان موجودا في العديد من مختلف الأعصاب الطرفية^6،7. وجود فشل التوصيل في تحقيقنا بمثابة آلية ذاتية المثبطة الجوهرية لتعديل المدخلات nociceptive المستمرة على طول C-الألياف⁸. وقد تم تخفيف هذا الفشل التوصيل بشكل ملحوظ في ظل ظروف فرط الهالجية^4،9. ولذلك، فإن استهداف العوامل التي ينطوي عليها فشل التوصيل قد يمثل علاجًا جديدًا للألم العصبي. لمراقبة فشل التوصيل، يجب تسجيل نمط إطلاق النار وتحليلها على أساس المسامير التي يتم تصريفها بالتتابع على أساس تسجيل الألياف الواحدة.

لفهم آلية فشل التوصيل بدقة ، من الضروري تحديد خصائص انتقال المحاور ، أو على وجه التحديد ، خصائص غشاء الخلايا العصبية DRG ، استناداً إلى خصائصها التشريحية شبه أحادية القطب. وقد أجريت العديد من الدراسات السابقة في هذا المجال على الخلايا العصبية DRG منفصلة^10,11, والتي قد لا تكون مجدية للتحقيق في فشل التوصيل بسبب اثنين من العقبات. أولا، يتم استخدام مختلف الأساليب الميكانيكية والكيميائية في عملية التفكك لتحرير الخلايا العصبية DRG، والتي قد تؤدي إلى خلايا غير صحية أو تغيير النمط الظاهري / خصائص الخلايا العصبية والخلط بين النتائج. ثانيا، تتم إزالة الأعصاب الطرفية المرفقة أساسا، والظواهر فشل التوصيل لا يمكن ملاحظتها في هذه الاستعدادات. ولذلك، تم تحسين إعداد الخلايا العصبية DRG سليمة مع العصب المرفقة لتجنب العقبات المذكورة أعلاه.

Protocol

ويتبع البروتوكول الحالي دليل سياسة دائرة الصحة العامة في الولايات المتحدة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت اللجنة المعنية بأخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة للجامعة الطبية العسكرية الرابعة على البروتوكول.

1- الحيوانات

1. تقسيم 24 الفئران سبراغ-دولي (4-8 أسابيع من العمر) إلى مجموعتين. إنتاج نموذج فريد كالادفي (CFA) بحقن 100 ميكرولتر من CFA في مجموعة واحدة من 14 الفئران ومجموعة أخرى من 10 الفئران عن طريق العلاج مع المالحة.
   ملاحظة: تم الحصول على جميع الحيوانات من مركز الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة. واستخدمت فئران سبراغ-دولي من الذكور والإناث البالغين (150-200 غرام) في جميع الإجراءات، وتم تعيين الفئران عشوائيا ً في أقفاص. تم إيواء اثنين من الفئران في كل قفص تحت دورة ضوء /الظلام لمدة 12-/12 ساعة في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

2. في فيفو تسجيل واحد من الألياف

1. إعداد وتطهير جميع الأدوات الجراحية (مشرط، ملاقط، مقص العيون، مقص القص، الزجاج إبرة فصل، إبرة خياطة، العظام rongeur) قبل الجراحة. إعداد 1 لتر أو 2 لتر من محلول رينجر العادي خارج الخلية (في MM: NaCl 124، KCl 3، MgSO₄ 1.3، CaCl₂ 2، NaHCO₃ 26، NaH₂PO₄ 1.25، الجلوكوز 15؛ درجة الحموضة 7.4 و 305 منوم). يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يُستعمل.
2. تُدّس الفئران. في الأيام من 3 إلى 7 بعد حقن CFA، استخدم الحقن داخل الصفاق من محلول مختلط (1٪ كلورالوز و 17٪ يوريتان، 5 مل / كغ من وزن الجسم) للحفاظ على الحيوانات في حالة جمالية مستقرة خلال التجربة. تطبيق حقن تكميلية من التخدير، إذا لزم الأمر، بعد فحص التلاميذ والاستجابة لتحفيز الألم. مراقبة والحفاظ على درجة حرارة الجسم بالقرب من 37 درجة مئوية.
3. تعرض جذع العصب الوركي للتسجيل
   1. قطع فتح الجلد والعضلات على الجزء الظهري من الفخذ. إجراء تشريح حاد على طول العضلة ذات الرأسين الفخذية. عزل بعناية جذع العصب الوركي باستخدام مقص العيون وإبرة فصل الزجاج. الحفاظ على الأنسجة الرطبة باستخدام حل رينجر.
   2. إصلاح الحيوان على طوق معدني محلية الصنع (3 سم طويلة، 2 مم طوق معدني واسع مع سلك الحديد 1 ملم في القطر) عن طريق خياطة الجلد في فتحة من حوله. سحب الجلد حتى قليلا وذلك لإنشاء حمام السوائل.
   3. كشف 1 سم من جذع العصب الوركي في الجانب القريب. وضع منصة صغيرة البني تحت الجذع العصب لتعزيز التباين ومراقبة الجذع العصب غرامة بوضوح. تسخين البارافين السائل في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية وأسقطه على الجزء العلوي من جذع العصب لمنع تجفيف سطح الألياف. إزالة بيا ماتر العمود الفقري ودورا ماتر حول العصب الوركي.
4. جلسة التسجيل
   1. حدد خيوط البلاتين (29 ميكرومتر في القطر) كقطب التسجيل. الحرارة أكثر من أجل صب أسهل، وخلق هوك صغيرة في نهاية جدا. قم بإرفاق القطب الكهربائي بمُمِمُمِيّي لنقل القطب الكهربائي حسب الحاجة.
   2. في الحمام، ضع قطبًا مرجعيًا في الأنسجة تحت الجلد المجاورة. تقسيم دورا العمود الفقري والأم بيا. فصل العصب الوركي في ألياف واحدة (15-20 ميكرومتر في القطر) في بركة التسجيل. ثم، التقاط ملزمة غرامة من محور عصبي وتعليق نهاية القريبة من المحور على هوك من قطب التسجيل تحت منظار ستيريو في التكبير 25x.
      ملاحظة: خيوط تشريح فقط تميل إلى أن تكون أكثر سمكا وتتطلب المزيد من الفصل حتى يمكن تسجيل وحدة واحدة.
   3. تحديد المجال تقبلا من الألياف C nociceptive واحد باستخدام التحفيز الميكانيكي (فون فراي الشعر) والتحفيز الحراري (كرة القطن الصغيرة مع 50-55 درجة مئوية المياه). باختصار، إذا كان إطلاق الألياف العصبية تستجيب للمحفزات الميكانيكية والماء الساخن، ثم النظر في ذلك على أنه متعدد الوسائط nociceptive C-الألياف⁴. بعد ذلك، أدخل اثنين من أقطاب التحفيز إبرة (فاصل زمني 2 ملم) في جلد الحقل المحدد لتسليم المحفزات الكهربائية.
   4. عرض الموجي من إمكانية إجراء على الذبذبات واستخدام جهاز كمبيوتر A / D المجلس مع معدل أخذ العينات إشارة من 20 كيلو هرتز لتضخيم وتسجيل المسامير.
   5. جمع البيانات باستخدام برامجالحصول على البيانات (جدول المواد). حفظ البيانات على جهاز كمبيوتر وتحليلهافي وقت لاحق مع البرامج المهنية (جدول المواد).

3. قياس فشل التوصيل

1. تقديم المحفزات الكهربائية المتكررة (0.8 مللي ثانية مدة، 1.5x كثافة عتبة) في ترددات مختلفة (2 هرتز،5 هرتز، 10 هرتز) إلى الألياف C لمدة 60 ثانية 4،^8،9. السماح لفترة 10 دقيقة للألياف للاسترخاء بين المحفزات. حساب نسبة عدد حالات الفشل إلى عدد نبضات التحفيز المتكررة المسلمة ومضاعفة بنسبة 100٪ للحصول على درجة فشل التوصيل.

4. إعداد DRG Iintact تعلق مع العصب الوركي

1. إعداد الأدوات الجراحية والحل خارج الخلية رينجر كما هو موضح في الخطوة 2.1.
2. فصل DRG مع العصب الوركي المرفقة.
   1. التخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 2.2 (في الأيام 3 إلى 7 بعد حقن CFA). قص الشعر على الظهر والساق مع مقص القص، وتعقيم الجلد مع صبغة اليود.
   2. للتعرض DRG، قطع أولا فتح الجلد من خط الوسط من الظهر على مستوى الجزء L4 إلى L5. إزالة العضلات، وعملية العمود الفقري، وفقرة المجلس، وعملية عرضية باستخدام rongeur العظام لفضح الحبل الشوكي والجسم DRG. قم بتغطية الحبل الشوكي المكشوف وDRG بالقطن الذي تم اختراقه من خلال الحل العادي خارج الخلية لـ Ringer للحفاظ على النشاط العصبي. وقف النزيف ومسح الدم في الوقت المناسب.
   3. كشف العصب الوركي من اتجاهين: إزالة الهيكل العظمي L4 إلى S1 فوق اللطواب الفقرية باستخدام مقص العيون لفضح العصب الشوكي المتصل DRG الذي هو في نهاية القريب من العصب الوركي. قطع فتح الجلد لفضح العصب الوركي في الفخذ الأوسط. فصل وفصل العصب الوركي من الطرف القاصي للعصب حيث يذهب داخل العضلات، وligate الجذع العصب مع خط الجراحية في نهاية العصب قبل القطع.
   4. فصل العصب الوركي من النسيج الضام الكامنة باستخدام مقص العيون عن طريق رفع نقطة ربط العصب. إزالة دورا من الحبل الشوكي وفصل DRG من النسيج الضام الكامنة عن طريق رفع الجذر الظهري حتى تصل إلى الجزء المجاور من العصب الوركي. وهكذا، عزل الإعداد كله من DRG مع العصب الوركي المرفقة.
3. مسح سطح DRG.
   1. قم بإزالة الدورة الشوكية بعناية على أسطح L4−L6 DRG باستخدام ملاقط تحت منظار مجسم في التكبير 4x.
   2. وضع DRG مع العصب الوركي المرفقة في أنبوب زجاجي يحتوي على 1 مل من الإنزيمات المختلطة (0.2٪ بروتيناز و 0.32٪ كولاجيناز) وهضم في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (ضربة قليلا مع قطرة بلاستيكية في فاصل زمني من 5 دقائق).
   3. ارفع نهاية خط الربط وحرّك التحضير إلى طبق مليء بمحلول الرينجر العادي خارج الخلية لغسل الإنزيم. ثم نقل DRG هضمها إلى حاوية (الشكل1A)مليئة محلول المؤكسج رينجر خارج الخلية للتسجيل.
4. جلسة التسجيل
   1. إعداد حل داخل الخلايا (في MM: غلوكونات البوتاسيوم 120، KCl 18، MgCl₂ 2، الإيثيلين غليكول-بيس (β-aminoethyl الأثير)-N، N، N،N'، N'-tetraacetic Acid [EGTA] 5، HEPES 10، Na 2-ATP 5، Na-GTP 0.4، CaCl₂ 1؛ pH 7.2 و 300 mOsm). يُحفظ عند درجة حرارة 0 درجة مئوية حتى يُستعمل.
   2. استقرار العقد باستخدام مرساة شريحة وربط نهاية العصب إلى قطب تحفيز شفط (الشكل1A). تصور وحدد الخلايا العصبية DRG مع هدف غمر المياه في التكبير 40X.
   3. سحب قطبكهربائي (جدول المواد) وملء مع حل داخل الخلايا. إدراج القطب الكهربائي على حامل وتطبيق الضغط الإيجابي في ماصة مع المقاومة النهائية من 4-7 MΩ.
   4. ارفع القطب الكهربائي إلى الخلية والمسها. إعطاء ضغط سلبي في ماصة، بمجرد أن يتم التوصل إلى ختم GΩ، تعيين إمكانات الغشاء في حوالي -60 ملفولت ثم إنشاء وضع تسجيل الخلية الكاملة.
   5. تقديم محفزات متكررة من 5-50 هرتز إلى العصب الوركي من خلال قطب الشفط لفحص فشل التوصيل. قياس سعة إمكانات ما بعد الاستقطاب (AHP) من خط الأساس إلى الذروة، ومدة AHP 80٪.
      ملاحظة: تم استخدام تحليل التباين في اتجاه واحد (ANOVA؛ لأكثر من مجموعتين) أو اختبار t للطلاب (لمجموعتين فقط) لتحليل البيانات. يتم عرض البيانات كوسيلة ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). وقد حُدِّد المستوى الإحصائي الهام بـ p < 0.05.
5. إنهاء التجربة
   1. عند الانتهاء من المهمة التجريبية في حين أن الفئران لا تزال تحت حالة التخدير، يتم قتل الفئران إنسانيا مع حقن داخل القلب من الصوديوم البنتوباربيتال جرعة زائدة.

النتائج

تعتمد نتيجة بروتوكول التسجيل أحادي الألياف على جودة تشريح الألياف. الحيوان لفي تجارب الجسم الحي يجب أن يكون في حالة جيدة للحفاظ على الجذع العصب صحية لتشريح سهلة (انظر المشورة في قسم المناقشة). هناك حاجة إلى حمام تطبيق المخدرات في كثير من الحالات لتسليم المخدرات على الألياف. ويوضح الشك?...

Discussion

على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد حققت تصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية DRG في الجسم الحي¹⁶، وأداء في الجسم الحي التصحيح المشبك التسجيل من nociceptors DRG الفردية لا يزال تحديا للغاية. ولذلك، فإن نهج في الجسم الحي من الألياف الواحدة لمجال الألم هو من الأهمية المستمرة. تسجيل الأليا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia