JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Запись с одним волокном является эффективным электрофизиологическим методом, применимым к центральной и периферической нервной системе. Наряду с подготовкой нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нерва, исследуется механизм отказа проводимости. Оба протокола улучшают понимание отношений периферической нервной системы с болью.

Аннотация

Одноволоконная запись была классической и эффективной электрофизиологической техникой в течение последних нескольких десятилетий из-за его специфического применения нервных волокон в центральной и периферической нервной системе. Этот метод особенно применим к корням ганглиев (DRG), которые являются основными сенсорными нейронами, которые демонстрируют псевдо-однополярная структура нервных процессов. Шаблоны и особенности потенциалов действия, передаваемые вдоль аксонов, записываются в этих нейронах. Настоящее исследование использует in vivo одноволоконных записей для наблюдения за отказом проводимости седалищных нервов в адъювантных (CFA) в полном фрейундах. Поскольку основной механизм не может быть изучен с использованием in vivo одноволоконных записей, патч-зажим-записи нейронов DRG выполняются на препаратах нетронутыми DRG с прикрепленным седаличным нервом. Эти записи показывают положительную корреляцию между отказом проводимости и ростом склона после гиперполяризации потенциал (AHP) нейронов DRG в CFA-обработанных животных. Протокол для одноразовых волоконных записей in vivo позволяет классифицировать нервные волокна с помощью измерения скорости проводимости и мониторинга аномальных состояний в нервных волокнах при определенных заболеваниях. Intact DRG с прикрепленным периферическим нервом позволяет наблюдать за активностью нейронов DRG в большинстве физиологических условий. Окончательно, одноволоконная запись в сочетании с электрофизиологической записи нетронутых DRGs является эффективным методом для изучения роли проводки неудачи во время обезболиваного процесса.

Введение

Нормальная передача информации по нервным волокнам гарантирует нормальную функцию нервной системы. Аномальное функционирование нервной системы также отражается в передаче электрического сигнала нервных волокон. Например, степень демиелинации при поражениях центральной демиелинации можно классифицировать путем сравненияизменений в скорости нервной проводимости до и после применения 1. Трудно внутриклеточного записи нервных волокон, за исключением специальных препаратов, таких как кальмар гигантский аксон2. Таким образом, электрофизиологическая активность записывается только через внеклеточную запись одиночных волокон. Как один из классических электрофизиологических методов, одноволоконная запись имеет более длинную историю, чем другие методы. Тем не менее, меньше электрофизиологов, хватая этот метод, несмотря на его широкое применение. Поэтому для его соответствующего применения необходимо детальное введение стандартного протокола для записи с одним волокном.

Хотя различные методы патч-зажим доминируют современные электрофизиологические исследования, одноволоконная запись по-прежнему играет незаменимую роль в записи деятельности нервных волокон, особенно волокон, передающих периферические ощущения с их сенсорное тело клетки, расположенное в терзаем корнях (DRG). Преимущество использования одноволоконной записи здесь заключается в том, что запись волокна in vivo обеспечивает длительное время наблюдения с возможностью записи реакций на естественные раздражители в доклинических моделях без нарушения внутриклеточной среды3 , 4.

Все большее число исследований за последние два десятилетия изучал сложные функции вдоль нервных волокон5, и проводящий отказ, который определяется как состояние неудачной передачи нервного импульса вдоль аксона, присутствовал во многих различных периферийные нервы6,7. Наличие сбоя проводимости в нашем исследовании служило внутреннеинтрозным самоингуляторным механизмом для модуляциистойких ноцицептивных входных вдоль C-волокон 8. Этот сбой проводимости был значительно ослаблен в условияхгипералгезии 4,9. Таким образом, ориентации факторов, участвующих в отказе проводимости может представлять собой новое лечение невропатической боли. Для наблюдения за сбоем в проводимости, схема стрельбы должна быть записана и проанализирована на основе последовательно разряженных шипов на основе одноволоконной записи.

Чтобы досконально понять механизм отказа проводимости, необходимо определить свойства передачи аксона, а точнее, мембранные свойства нейронов DRG, основанные на их псевдооднополярных анатомических свойствах. Многие предыдущие исследования в этой области были проведены на диссоциированных нейронов DRG10,11, которые не могут быть осуществимы для расследования отказа проводимости из-за двух препятствий. Во-первых, различные механические и химические методы используются в процессе диссоциации, чтобы освободить DRG нейронов, которые могут привести к нездоровым клеткам или изменить фенотип / свойства нейронов и заставить заставить себя свести на нет выводы. Во-вторых, прикрепленные периферийные нервы в основном удаляются, и явления протоиерой неудачи не прослеживаются в этих препаратах. Таким образом, подготовка нетронутых нейронов DRG с прикрепленным нервом была улучшена, чтобы избежать вышеупомянутых препятствий.

протокол

Нынешний протокол был принят в соответствии с Руководством по политике Службы общественного здравоохранения Соединенных Штатов в области гуманного ухода и использования лабораторных животных, а Комитет по этике экспериментов на животных четвертого военно-медицинского университета утвердил этот протокол.

1. Звери

  1. Разделите 24 крысы Спраг-Доули (4-8 недель) на две группы. Продукция полной адъювантной модели Фрейнда (CFA) путем внутриплантарной инъекции 100 ЗЛ КФА в одной группе из 14 крыс и другой группы из 10 крыс путем лечения сольным раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были приобретены в Центре животных четвертого военно-медицинского университета. Взрослые самцы и самки крыс Спраг-Доули (150-200 г) использовались для всех процедур, а крысы случайным образом отнесались к клеткам. Две крысы были размещены на клетку в 12-/12-часовой свет/темный цикл при постоянной температуре (25 и 1 кВс) с бесплатным доступом к пище и воде.

2. В Vivo одноволоконной записи

  1. Подготовка и дезинфекция всех хирургических инструментов (скальпель, пинцет, офтальмологические ножницы, ножницы для стрижки, стеклооразделительные иглы, швовая игла, костяной ронгер) до операции. Подготовка 1 L или 2 L внеклеточного решения нормального Ringer (в ММ: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2, NaHCO3 26,2PO4 1.25, глюкоза 15; pH 7.4 и 305 mOsm). Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.
  2. Анестезия крыс. В дни от 3 до 7 после инъекции CFA, используйте интраперитонеальной инъекции смешанного раствора (1% хлоралоза и 17% уретана, 5 мл/кг массы тела), чтобы держать животных в стабильном эстетическом состоянии во время эксперимента. Применить дополнительную инъекцию анестезии, при необходимости, после проверки учеников и реакции на стимуляцию боли. Мониторинг и поддержание температуры тела около 37 градусов по Цельсию.
  3. Воздействие ствола седалищаели для записи
    1. Отрежьте кожу и мышцы на подошвальной части бедра. Выполните тупой вскрытие вдоль бедренных бицепсов. Тщательно изолируйте ствол седалищаемых нервов с помощью офтальмологических ножниц и стеклянной разъединительной иглы. Держите ткань влажной с помощью раствора Ringer.
    2. Закрепите животное на самодельном металлическом обруче (длиной 3 см, 2 мм в ширину металлического обруча с железным проводом диаметром 1 мм) через зашивание кожи в слот вокруг него. Потяните кожу немного вверх, чтобы установить жидкости ванны.
    3. Выставить 1 см ствола седалищачего нерва на проксимальной стороне. Поместите небольшую коричневую платформу под нервный ствол для повышения контраста и наблюдать штраф ствол нерва четко. Нагрейте жидкий парафин в водяной бане до 37 градусов по Цельсию и опустите его на верхнюю часть нервного ствола, чтобы предотвратить высыхание поверхности волокна. Удалите пиа-матер spinalis и dura mater вокруг седалищего нерва.
  4. Запись сессии
    1. Выберите платиновую нить (29 мкм в диаметре) в качестве записывающего электрода. Тепло более для облегчения литья, и создать небольшой крюк в самом конце. Прикрепите электрод к микроманипулятору для перемещения электрода по мере необходимости.
    2. В ванне поместите эталонный электрод в соседние подкожные ткани. Разделите спинномозговую дюру и пиа-матер. Разделите седалительный нерв на одно волокно (15-20 мкм в диаметре) в пуле записи. Затем, забрать штраф fascicle аксона и приостановить проксимальный конец аксона на крючок электрода записи под стереоскоп при 25x увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только что расчлененные нити, как правило, толще и требуют дальнейшего разделения до тех пор, пока одна единица может быть записана.
    3. Определите восприимчивое поле одного носицептивного C-волокна с помощью механического стимула (волосы Von Frey) и теплового стимула (маленький ватный шарик с водой 50-55 градусов по Цельсию). Вкратце, если обжига нервного волокна реагирует на механические раздражители и горячую воду, то рассмотрите его как полимодальный ноцицептив Ный C-волокна4. Затем вставьте два электрода стимула иглы (2 мм интервал) в кожу идентифицированного поля для доставки электрических стимулов.
    4. Отобразите волновую форму потенциала действия на осциллоскопе и нанисните компьютер A/D доску с частотой отбора проб сигнала 20 кГц для усиления и записи шипов.
    5. Сбор данных с помощью программного обеспечения для сбора данных(Таблица материалов). Сохранить данные на компьютере и анализировать позже с профессиональным программным обеспечением (Таблица материалов).

3. Измерение сбоя проводимости

  1. Доставка повторяющихся электрических стимулов (0,8 мс продолжительность, 1,5x интенсивность порога) в различных частотах (2 Гц, 5 Гц, 10 Гц) на C-волокна для 60 с4,8,9. Разрешить 10-минутный интервал для волокна, чтобы расслабиться между стимулами. Рассчитайте отношение числа сбоев к числу повторяющихся импульсов стимула и умножайте на 100%, чтобы получить степень сбоя проводимости.

4. Подготовка Iintact DRG прилагается с сиатические нервы

  1. Подготовьте хирургические инструменты и внеклеточное решение Ringer, описанное в шаге 2.1.
  2. Отделить DRG с прикрепленным седаличным нервом.
    1. Анестезия крыс, как описано в шаге 2.2 (В дни от 3 до 7 после инъекции CFA). Вырежьте волосы на спине и ноге ножницами и стерилизуйте кожу настойкой йода.
    2. Для воздействия DRG сначала откройте кожу от средней линии спины на уровне l4 до l5 сегмента. Удалить мышцы, процесс позвоночника, позвонков борту, и поперечный процесс с помощью кости rongeur подвергать спинного мозга и DRG тела. Обложка подвергаются спинного мозга и DRG с хлопками проникли внеклеточного решения нормального Ringer для поддержания нервной активности. Остановите кровотечение и вовремя очистите кровь.
    3. Разоблачить седалищем нервс из двух направлений: удалить L4 к S1 костной структуры выше позвоночных foramen с помощью офтальмологических ножниц подвергать спинного нерва, подключенного к DRG, который находится на проксимальном конце седалищения нерва. Отрежьте кожу, чтобы разоблачить седалищаючий нерв в среднем бедре. Отделить и отключить седалищающее нерв от дистального конца нерва, где он идет внутри мышцы, и ligate ствола нерва с хирургической линии в конце нерва до резки.
    4. Отделите седалирический нерв от основной соединительной ткани с помощью офтальмологических ножниц через подъем точки перевязки нерва. Удалить дюру из спинного мозга и отделить DRG от основной соединительной ткани через подъем спинного корня, пока не достигнет соседней части седалищего нерва. Таким образом, изолировать весь препарат DRG с прикрепленным седаличным нервом.
  3. Очистить поверхность DRG.
    1. Тщательно удалите спинномозговую дюру на поверхностях L4-L6 DRG с помощью пинцета под стереоскопом при 4x увеличении.
    2. Поместите DRG с прикрепленным седалищным нервом в стеклянную трубку, содержащую 1 мл смешанных ферментов (0,2% протеиназа и 0,32% коллагеназа) и переварить в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут (слегка удар пластиковым капельщиком с интервалом в 5 мин).
    3. Поднимите конец линии перевязки и переместите приготовление к блюду, наполненное внеклеточным раствором обычного Ringer, чтобы вымыть фермент. Затем перенесите переваренный DRG в контейнер(Рисунок 1А),наполненный внеклеточным раствором для записи кислородом Ringer.
  4. Запись сессии
    1. Подготовка внутриклеточного раствора (в ММ: глюконат калия 120, KCl 18, MgCl2 2, этиленгликоль-бис (З-аминоэтил эфир)-N,N,N',N', N'-тетраацетической кислоты "EGTA" 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 и 300 mOs). Храните при 0 градусах по Цельсию до использования.
    2. Стабилизировать ганглии с помощью якоря ломтик и подключить нервный конец всасывающего стимулирующего электрода(рисунок 1А). Визуализируйте и выберите нейрон DRG с целью погружения воды при 40-кратном увеличении.
    3. Потяните электрод(Таблицаматериалов) и заполните его внутриклеточным раствором. Вставьте электрод на держатель и нанесите положительное давление в пипетку с окончательным сопротивлением 4-7 МЗ.
    4. Принесите электрод близко к клетке и коснитесь его. Дайте отрицательное давление в пипетке, как только уплотнение G, установите потенциал мембраны на уровне около -60 мV, а затем установите режим записи цельноклеточных элементов.
    5. Доставка повторяющихся стимулов 5-50 Гц к седалищу нерва через всасывающий электрод на экран для отказа проводки. Измерьте амплитуда потенциала послегиперполяризации (AHP) от базового к пику, и 80% продолжительности AHP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных был использован односторонний анализ дисперсии (ANOVA; для более чем двух групп) или T-тест студента (только для двух групп). Данные представлены как средства и стандартная ошибка среднего значения (SEM). Статистически значимый уровень был установлен на уровне p qlt; 0.05.
  5. Завершение эксперимента
    1. Когда экспериментальная задача закончена, в то время как крысы все еще находятся под наркозом, крысы гуманно усыпливается с внутрисердечными инъекциями передозировки пентобарбитального натрия.

Результаты

Результат протокола записи с одним волокном зависит от качества вскрытия волокна. Для экспериментов in vivo животное должно быть в хорошей ситуации, чтобы сохранить нервный ствол здоровым для легкого вскрытия (см. совет в разделе обсуждения). Во многих случаях для доставки лекарств на вол?...

Обсуждение

Хотя последние исследования достигли кальция изображения нейронов DRG in vivo16, выполняя in vivo патч-зажим записи от отдельных ноцицепторов DRG остается чрезвычайно сложной задачей. Таким образом, in vivo одноволокнистый подход для болевого поля имеет неотразимую важность. Одноволо...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием со стороны Национального фонда естественных наук Китая (31671089 и 81470060) и Шэньси провинциального проекта по исследованию науки и технологий в области социального развития (2016SF-250).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments and software used in single fiber recording
AmplifierNihon kohdenMEZ-8201Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitorShangHai JiaLong Teaching instrument factorySZF-1Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis systemCEDSpike-2Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulatorNarishigeSM-21Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezersA.Dumont5#Separate the single fiber
IsolatorNihon kohdenSS-220J
Memory oscilloscopeNihon kohdenVC-9Display recorded discharge during
Experiment
StereomicroscopeZEISSSV-11Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
StimulatorNihon kohdenSEZ-7203Delivery of the electrical stimuli
Von Frey HairStoelting accompanyDelivery of the mechanical stimuli
Water bathScientz biotechnology Co., Ltd.SC-15Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
AmplifierAxon InstrumentsMulticlamp 700BMonitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration tableOptical Technology Co., Ltd.Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
CameraOlympusTH4-200See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
ClampexAxonClampex 9.2Software for data acquisition and delivery of stimuli
ClampfitAxonClampfit 10.0Software for data analysis
Electrode pullerSutterP-97Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipetteSutterBF 150-75-10
MicromanipulatorSutterMP225Give a precise control of the microelectrode
MicroscopeOlympusBX51WIUpright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
OriginOrigin labOrigin 8Software for drawing picture
Perfusion PumpBaoDing LanGe Co., Ltd.BT100-1JPerfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balanceSartoriusBS 124SWeighing reagent
pH ModulatorDenver InstrumentUB7Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chlorideSigma-AldrichC5670Extracellular solution
ChloraloseShanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.M07752Mixed solution for Anesthesia
CollagenaseSigma-AldrichSLBQ1885VEnzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) GlucoseSigma-AldrichG7528Extracellular solution
Liquid ParaffinTianJin HongYan Reagent Co., Ltd.Maintain fiber wetting
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506Extracellular solution
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911Extracellular solution
ProteaseSigma-Aldrich62H0351Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5671Extracellular solution
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886Extracellular solution
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS0751Extracellular solution
SucroseSigma-AldrichS0389Extracellular solution
UrethaneSigma-AldrichU2500Mixed solution for Anesthesia

Ссылки

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150CDRGAHP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены