Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Resumen

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Resumen

La grabación de una sola fibra ha sido una técnica electrofisiológica clásica y eficaz en las últimas décadas debido a su aplicación específica para las fibras nerviosas en los sistemas nerviosos central y periférico. Este método es particularmente aplicable a los ganglios de raíz dorsal (DRG), que son neuronas sensoriales primarias que exhiben una estructura pseudo-unipolar de los procesos nerviosos. Los patrones y características de los potenciales de acción pasados a lo largo de los axons son grabables en estas neuronas. El presente estudio utiliza grabaciones in vivo de una sola fibra para observar el fallo de conducción de los nervios ciáticos en ratas tratadas con adyuvantes (CFA) completas de Freund. Como el mecanismo subyacente no se puede estudiar utilizando grabaciones in vivo de una sola fibra, las grabaciones de abrazaderas de parche de las neuronas DRG se realizan en preparaciones de DRG intacto con el nervio ciático adjunto. Estas grabaciones revelan una correlación positiva entre la falla de conducción y la pendiente creciente del potencial de hiperpolarización posterior (AHP) de las neuronas DRG en animales tratados con CFA. El protocolo para las grabaciones de fibra individualin vivo permite la clasificación de las fibras nerviosas a través de la medición de la velocidad de conducción y el seguimiento de condiciones anormales en las fibras nerviosas en ciertas enfermedades. El DRG intacto con el nervio periférico conectado permite la observación de la actividad de las neuronas DRG en la mayoría de las condiciones fisiológicas. De manera concluyente, la grabación de una sola fibra combinada con el registro electrofisiológico de DRG intactos es un método eficaz para examinar el papel de la falla de conducción durante el proceso analgésico.

Introducción

La transmisión normal de información a lo largo de las fibras nerviosas garantiza el funcionamiento normal del sistema nervioso. El funcionamiento anormal del sistema nervioso también se refleja en la transmisión de la señal eléctrica de las fibras nerviosas. Por ejemplo, el grado de desmielinización en lesiones de desmielinización central se puede clasificar mediante la comparación de los cambios en la velocidad de conducción nerviosa antes y después de la aplicación de intervención¹. Es difícil registrar intracelularmente las fibras nerviosas, excepto en preparaciones especialescomo el axón gigante calamar 2. Por lo tanto, la actividad electrofisiológica sólo se puede grabar a través de la grabación extracelular de fibras individuales. Como uno de los métodos electrofisiológicos clásicos, la grabación de una sola fibra tiene una historia más larga que otras técnicas. Sin embargo, menos electrofisiólogos que entienden este método a pesar de su amplia aplicación. Por lo tanto, se necesita una introducción detallada del protocolo estándar para la grabación de una sola fibra para su aplicación adecuada.

Aunque varias técnicas de abrazaderade parche han dominado el estudio electrofisiológico moderno, la grabación de una sola fibra sigue desempeñando un papel insustituible en el registro de las actividades de las fibras nerviosas, especialmente las fibras que transmiten la sensación periférica con sus cuerpo de células sensoriales ubicado en ganglio de la raíz dorsal (DRG). La ventaja de utilizar la grabación de una sola fibra aquí es que la grabación de fibra in vivo proporciona un largo tiempo de observación con la capacidad de registrar respuestas a estímulos naturales en modelos preclínicos sin perturbación del entorno intracelular^{3 , 4}.

Un número creciente de estudios en las últimas dosdécadas ha examinado funciones complejas a lo largo de las fibras nerviosas 5, y la falla de conducción, que se define como un estado de transmisión de impulso nervioso sin éxito a lo largo del axón, estuvo presente en muchos nervios periféricos^6,7. La presencia de fallo de conducción en nuestra investigación sirvió como un mecanismo autoinhibitorio intrínseco para la modulación de la entrada nociceptiva persistente a lo largo de las fibras C⁸. Esta falla de conducción se atenuó significativamente encondiciones de hiperalgesia 4,⁹. Por lo tanto, apuntar a los factores involucrados en la insuficiencia de conducción puede representar un nuevo tratamiento para el dolor neuropático. Para observar el fallo de conducción, el patrón de disparo debe registrarse y analizarse sobre la base de picos descargados secuencialmente basados en la grabación de una sola fibra.

Para entender a fondo el mecanismo de fallo de conducción, es necesario identificar las propiedades de transmisión del axón, o más precisamente, las propiedades de la membrana de las neuronas DRG, en función de sus propiedades anatómicas pseudo-unipolares. Muchos estudios previos en este campo se han realizado en neuronas DRG disociadas^10,11, que pueden no ser factibles para la investigación de falla de conducción debido a dos obstáculos. En primer lugar, varios métodos mecánicos y químicos se utilizan en el proceso de disociación a las neuronas DRG libres, que puede resultar en células insalubres o alterar el fenotipo / propiedades de las neuronas y confundir los hallazgos. En segundo lugar, los nervios periféricos conectados se eliminan básicamente, y los fenómenos de falla de conducción no son observables en estas preparaciones. Por lo tanto, se ha mejorado una preparación de las neuronas DRG intactas con un nervio unido para evitar los obstáculos antes mencionados.

Protocolo

El protocolo actual siguió la Guía para la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio, y el Comité de la ética de los experimentos con animales de la Cuarta Universidad Médica Militar aprobó el protocolo.

1. Animales

1. Divida 24 ratas Sprague-Dawley (4-8 semanas de edad) en dos grupos. Producir el modelo completo de adyuvante de Freund (CFA) mediante inyección intraplantar de 100 ml de CFA en un grupo de 14 ratas y otro grupo de 10 ratas mediante tratamiento con salina.
   NOTA: Todos los animales fueron adquiridos del Centro Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar. Las ratas adultas macho y hembra Sprague-Dawley (150-200 g) fueron utilizadas para todos los procedimientos, y las ratas fueron asignadas aleatoriamente a jaulas. Dos ratas fueron alojados por jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas a una temperatura constante (25 o1 oC) con acceso gratuito a alimentos y agua.

2. Grabación in Vivo de una sola fibra

1. Preparar y desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos (escalpelo, pinzas, tijeras oftálmicas, tijeras cortantes, aguja de separación de vidrio, aguja de sutura, rongeur óseo) antes de la cirugía. Preparar 1 L o 2 L de la solución extracelular normal de Ringer (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1.25, glucosa 15; pH 7.4 y 305 mOsm). Conservar a 4oC hasta su uso.
2. Anestetizar ratas. Los días 3 a 7 después de la inyección de CFA, utilice la inyección intraperitoneal de una solución mixta (1% de cloralosa y 17% de uretano, 5 ml/kg de peso corporal) para mantener a los animales en una condición estética estable durante el experimento. Aplicar inyección suplementaria de anestésicos, si es necesario, después de comprobar las pupilas y la respuesta a la estimulación del dolor. Controlar y mantener una temperatura corporal cercana a los 37oC.
3. Exposición del tronco del nervio ciático para la grabación
   1. Cortar la piel y el músculo en la parte dorsal del muslo. Realizar una disección contundente a lo largo de bíceps femoral. Aísle cuidadosamente el tronco del nervio ciático con tijeras oftálmicas y una aguja de separación de vidrio. Mantenga el tejido húmedo con la solución de Ringer.
   2. Fije al animal en un aro de metal casero (3 cm de largo, aro de metal de 2 mm de ancho con un alambre de hierro de 1 mm de diámetro) a través de la costura de la piel en la ranura a su alrededor. Tire de la piel ligeramente hacia arriba para establecer un baño de líquido.
   3. Exponga 1 cm de tronco del nervio ciático en el lado proximal. Coloque una pequeña plataforma marrón debajo del tronco nervioso para mejorar el contraste y observar claramente el tronco nervioso fino. Calienta la parafina líquida en un baño de agua a 37oC y colócala en la parte superior del tronco nervioso para evitar el secado de la superficie de la fibra. Retire la pia mater spinalis y dura mater alrededor del nervio ciático.
4. Sesión de grabación
   1. Seleccione un filamento de platino (29 m de diámetro) como electrodo de grabación. Caliente para facilitar el moldeo y cree un pequeño gancho al final. Conecte el electrodo a un micromanipulador para mover el electrodo según sea necesario.
   2. En el baño, coloque un electrodo de referencia en el tejido subcutáneo adyacente. Divide la columna vertebral dura y la pia mater. Separe el nervio ciático en una sola fibra (15-20 m de diámetro) en la piscina de registro. A continuación, recoger un fascículo fino de axón y suspender el extremo proximal del axón en el gancho del electrodo de grabación bajo un estereoscopio con aumento de 25x.
      NOTA: Los filamentos diseccionados tienden a ser más gruesos y requieren una mayor separación hasta que se puede grabar una sola unidad.
   3. Identificar el campo receptivo de una sola fibra C nociceptiva usando un estímulo mecánico (pelos Von Frey) y estímulo térmico (pequeña bola de algodón con agua de 50-55 oC). Brevemente, si la cocción de la fibra nerviosa responde a los estímulos mecánicos y el agua caliente, entonces considérelo como una fibra C nociceptiva polimodal⁴. A continuación, inserte dos electrodos de estímulo de aguja (intervalo de 2 mm) en la piel del campo identificado para la administración de estímulos eléctricos.
   4. Muestre la forma de onda de un potencial de acción en el osciloscopio y emplee una placa A/D de computadora con una frecuencia de muestreo de señal de 20 kHz para amplificar y registrar los picos.
   5. Recopilar datos utilizando el software de adquisición de datos (Tabla de materiales). Guardar datos en un ordenador y analizar más tarde con software profesional (Tablade Materiales).

3. Medición del fallo de conducción

1. Entregar los estímulos eléctricos repetitivos (0,8 ms de duración, intensidad umbral 1,5x) en diferentes frecuencias (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) a una fibra C para 60 s^4,8,9. Deje un intervalo de 10 minutos para que la fibra se relaje entre los estímulos. Calcular la relación entre el número de fallos y el número de pulsos de estímulo repetitivo entregados y multiplicar por 100% para obtener el grado de fallo de conducción.

4. Preparación de Iintact DRG Unido con nervio ciático

1. Prepare las herramientas quirúrgicas y la solución extracelular de Ringer como se describe en el paso 2.1.
2. Separe el DRG con el nervio ciático conectado.
   1. Anestesiar a las ratas como se describe en el paso 2.2 (En los días 3 a 7 después de la inyección de CFA). Corta el cabello en la espalda y la pierna con tijeras cortantes, y esteriliza la piel con tintura de yodo.
   2. Para la exposición a DRG, primero corte la piel desde la línea media de la espalda a nivel de segmento L4 a L5. Retire los músculos, el proceso de la columna vertebral, la tabla de vértebras y el proceso transversal utilizando un rongeur óseo para exponer la médula espinal y el cuerpo de DRG. Cubre la médula espinal expuesta y el DRG con algodón infiltrado por la solución extracelular normal de Ringer para mantener la actividad neuronal. Detenga el sangrado y despeje la sangre a tiempo.
   3. Exponer el nervio ciático desde dos direcciones: eliminar la estructura ósea L4 a S1 por encima del foramen vertebral usando tijeras oftálmicas para exponer el nervio espinal conectado al DRG que está en el extremo proximal del nervio ciático. Abre la piel para exponer el nervio ciático en el muslo medio. Separe y desconecte el nervio ciático del extremo distal del nervio donde va dentro del músculo, y ligar el tronco nervioso con la línea quirúrgica en el extremo del nervio antes de cortar.
   4. Separe el nervio ciático del tejido conectivo subyacente usando tijeras oftálmicas a través del levantamiento del punto de ligadura nerviosa. Retire la dura de la médula espinal y separe el DRG del tejido conectivo subyacente levantando la raíz dorsal hasta que llegue a la parte adyacente del nervio ciático. Por lo tanto, aislar toda la preparación de DRG con un nervio ciático unido.
3. Despeje la superficie del DRG.
   1. Retire con cuidado la dura espinal en las superficies de L4-L6 DRG usando pinzas bajo un estereoscopio con aumento de 4x.
   2. Colocar el DRG con nervio ciático unido en un tubo de vidrio que contenga 1 ml de enzimas mixtas (0,2% de proteinasa y 0,32% de colagenasa) y digerir en un baño de agua de 37 oC durante 15 minutos (sopla ligeramente con un gotero de plástico a un intervalo de 5 min).
   3. Levante el extremo de la línea de ligadura y mueva la preparación a un plato lleno de una solución extracelular normal de Ringer para lavar la enzima. A continuación, transfiera el DRG digerido a un recipiente (Figura1A)lleno de solución extracelular de Ringer oxigenado para la grabación.
4. Sesión de grabación
   1. Preparar la solución intracelular (en mM: gluconato de potasio 120, KCl 18, MgCl₂ 2, etilenglicol-bis(éter de aminoetilo)-N,N,N',N'ácido tetraacético [EGTA] 5, HEPES 10, Na₂-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl₂ 1; pH 7.2 y 300 mOs). Mantener a 0 oC hasta su uso.
   2. Estabilice los ganglios usando un ancla de corte y conecte el extremo nervioso a un electrodo que estimula la succión (Figura1A). Visualice y seleccione una neurona DRG con un objetivo de inmersión en agua a aumento de 40x.
   3. Tire de un electrodo (Tablade Materiales)y llénelo con solución intracelular. Inserte el electrodo en el soporte y aplique presión positiva en la pipeta con una resistencia final de 4-7 M.
   4. Acerque el electrodo a la célula y tóquelo. Dar una presión negativa en la pipeta, una vez que se alcanza el sello de la g, establecer el potencial de la membrana en unos -60 mV y luego establecer el modo de grabación de células enteras.
   5. Entregar estímulos repetitivos de 5-50 Hz al nervio ciático a través del electrodo de succión para detectar fallas de conducción. Mida la amplitud del potencial de posthiperpolarización (AHP) desde el inicio hasta el pico, y la duración del 80% del AHP.
      NOTA: El análisis unidireccional de varianza (ANOVA; para más de dos grupos) o la prueba t del estudiante (para sólo dos grupos) se utilizó para analizar los datos. Los datos se presentan como medios de error estándar de la media (SEM). El nivel estadístico significativo se estableció en p < 0.05.
5. Poner fin al experimento
   1. Cuando la tarea experimental termina mientras las ratas todavía están en situación anestésica, las ratas son humanmente eutanasiadas con una inyección intracardiaca de sodio pentobarbital por sobredosis.

Resultados

El resultado del protocolo de grabación de una sola fibra depende de la calidad de la disección de fibra. El animal para experimentos in vivo debe estar en una buena situación para mantener el tronco nervioso sano para facilitar la disección (ver consejos en la sección de discusión). Un baño de aplicación de drogas es necesario en muchos casos para el suministro de drogas en fibras. La Figura 1 ilustra cómo se accionó la grabación in vivo de una sola fibra (Figura1A)

Discusión

Aunque estudios recientes han logrado imágenes de calcio de las neuronas DRG in vivo¹⁶, realizar la grabación in vivo parche-clamp de nociceptores DRG individuales sigue siendo extremadamente difícil. Por lo tanto, un enfoque in vivo de una sola fibra para el campo del dolor es de importancia continua. El registro de una sola fibra en el presente protocolo permite la observación objetiva de los fenómenos de fallo de conducción, y la combinación de esta técnica con la preparación ex vivo d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia