Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Zusammenfassung

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Zusammenfassung

Die Singlefaseraufzeichnung war in den letzten Jahrzehnten aufgrund ihrer spezifischen Anwendung für Nervenfasern im zentralen und peripheren Nervensystem eine klassische und effektive elektrophysiologische Technik. Diese Methode ist besonders auf dorsale Wurzelganglien (DRG) anwendbar, die primäre sensorische Neuronen sind, die eine pseudo-unipolare Struktur von nervenaufworastrien Prozessen aufweisen. Die Muster und Merkmale der Aktionspotentiale, die entlang von Axonen weitergegeben werden, sind in diesen Neuronen nachweisbar. Die vorliegende Studie verwendet in vivo Singlefaser-Aufnahmen, um das Leitungsversagen von Ischiasnerven bei vollständig Freunds adjuvant (CFA)-behandelten Ratten zu beobachten. Da der zugrunde liegende Mechanismus nicht mit in vivo Singlefaser-Aufnahmen untersucht werden kann, werden Patch-Clamp-Aufnahmen von DRG-Neuronen auf Präparaten intakter DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv durchgeführt. Diese Aufnahmen zeigen eine positive Korrelation zwischen Leitungsversagen und der steigenden Steigung des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von DRG-Neuronen bei CFA-behandelten Tieren. Das Protokoll für in vivo Einzelfaser-Aufnahmen ermöglicht die Klassifizierung von Nervenfasern über die Messung der Leitungsgeschwindigkeit und die Überwachung von abnormalen Erkrankungen in Nervenfasern bei bestimmten Krankheiten. Intaktes DRG mit angeschlossenem peripheren Nerv ermöglicht die Beobachtung der Aktivität von DRG-Neuronen unter den meisten physiologischen Bedingungen. Abschließend ist die Singlefaseraufzeichnung in Kombination mit der elektrophysiologischen Aufzeichnung intakter DRGs eine effektive Methode, um die Rolle des Leitungsversagens während des analgetischen Prozesses zu untersuchen.

Einleitung

Die normale Übertragung von Informationen entlang der Nervenfasern garantiert die normale Funktion des Nervensystems. Abnormale Funktion des Nervensystems spiegelt sich auch in der elektrischen Signalübertragung von Nervenfasern wider. Beispielsweise kann der Grad der Demyelination bei zentralen Demyelinationenläsionen durch Vergleich von Veränderungen der Nervenleitungsgeschwindigkeit vor und nach der Intervention anwendung¹klassifiziert werden. Es ist schwierig, Nervenfasern intrazellulär aufzuzeichnen, außer bei speziellen Präparaten wie dem Tintenfischriesen Axon². Daher ist die elektrophysiologische Aktivität nur über die extrazelluläre Aufzeichnung einzelner Fasern beschreibbar. Als eine der klassischen elektrophysiologischen Methoden hat die Singlefaseraufzeichnung eine längere Geschichte als andere Techniken. Allerdings greifen trotz ihrer umfangreichen Anwendung weniger Elektrophysiologen nach dieser Methode. Daher ist eine detaillierte Einführung des Standardprotokolls für die Singlefaseraufzeichnung für die entsprechende Anwendung erforderlich.

Obwohl verschiedene Patch-Clamp-Techniken die moderne elektrophysiologische Studie dominiert haben, spielt die Singlefaseraufzeichnung immer noch eine unersetzliche Rolle bei der Aufzeichnung der Aktivitäten von Nervenfasern, insbesondere Fasern, die periphere Empfindungen mit ihren Sinneszellkörper in Dorsalwurzelganglion (DRG). Der Vorteil der Verwendung von Singlefaser-Aufzeichnung hier ist, dass in vivo Faseraufzeichnung bietet eine lange Beobachtungszeit mit der Fähigkeit, Reaktionen auf natürliche Reize in präklinischen Modellen ohne Störung der intrazellulären Umgebung^{3 , 4}.

Eine zunehmende Anzahl von Studien in den letzten zwei Jahrzehnten hat komplexe Funktionen entlang der Nervenfasern untersucht⁵, und Leitungsversagen, das als ein Zustand der erfolglosen Nervenimpulsübertragung entlang des Axons definiert ist, war in vielen verschiedenen periphere Nerven^6,7. Das Vorhandensein von Leitungsversagen in unserer Untersuchung diente als intrinsischer Selbsthemmungsmechanismus für die Modulation persistenter nozizeptiver Eingaben entlang der C-Fasern⁸. Dieser Leitungsfehler wurde unter Bedingungen der Hyperalgesie^4,9signifikant abgeschwächt. Daher kann die Ausrichtung auf die Faktoren, die an einem Leitungsversagen beteiligt sind, eine neue Behandlung für neuropathische Schmerzen darstellen. Um Leitungsfehler zu beobachten, sollte das Brennmuster auf der Grundlage sequenziell entladener Spitzen auf der Grundlage von Singlefaseraufzeichnungen aufgezeichnet und analysiert werden.

Um den Mechanismus des Leitungsversagens gründlich zu verstehen, ist es notwendig, die Transmissionseigenschaften des Axons, genauer gesagt, die Membraneigenschaften von DRG-Neuronen zu identifizieren, basierend auf ihren pseudo-unipolaren anatomischen Eigenschaften. Viele frühere Studien in diesem Bereich wurden an dissoziierten DRG-Neuronen^10,11durchgeführt, die für die Untersuchung von Leitungsversagen aufgrund von zwei Hindernissen möglicherweise nicht durchführbar sind. Zunächst werden verschiedene mechanische und chemische Methoden im Dissoziationsprozess verwendet, um DRG-Neuronen zu befreien, was zu ungesunden Zellen führen oder den Phänotyp/die Eigenschaften der Neuronen verändern kann und die Befunde verwirrt. Zweitens werden die angeschlossenen peripheren Nerven im Grunde entfernt, und Leitungsversagen Phänomene sind in diesen Präparaten nicht beobachtbar. Daher wurde eine Vorbereitung von intakten DRG-Neuronen mit einem angeschlossenen Nerv verbessert, um die oben genannten Hindernisse zu vermeiden.

Protokoll

Das aktuelle Protokoll folgte dem Leitfaden für die Politik des United States Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren, und das Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Vierten Militärmedizin-Universität billigte das Protokoll.

1. Tiere

1. Teilen Sie 24 Sprague-Dawley-Ratten (4-8 Wochen alt) in zwei Gruppen auf. Produzieren Sie das vollständige Freund-Adjuvans-Modell (CFA) durch intraplantare Injektion von 100 l CFA in einer Gruppe von 14 Ratten und einer weiteren Gruppe von 10 Ratten durch Behandlung mit Kochsaline.
   HINWEIS: Alle Tiere wurden vom Tierzentrum der Vierten Militärmedizinischen Universität erworben. Erwachsene männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (150-200 g) wurden für alle Verfahren verwendet, und Ratten wurden zufällig Käfigen zugeordnet. Zwei Ratten wurden pro Käfig unter einem 12-/12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.

2. In Vivo Single-Faser-Aufnahme

1. Bereiten und desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Skalpell, Pinzette, Augenschere, Scherenschere, Glastrennnadel, Nahtnadel, Knochenrongeur) vor der Operation. Bereiten Sie 1 L oder 2 L der normalen Ringer-Extrazelllösung vor (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1.25, Glucose 15; pH 7.4 und 305 mOsm). Bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern.
2. Anästhesisieren Ratten. Verwenden Sie an den Tagen 3 bis 7 nach der CFA-Injektion eine intraperitoneale Injektion einer gemischten Lösung (1% Chloralose und 17% Urethan, 5 ml/kg Körpergewicht), um die Tiere während des Experiments in einem stabilen ästhetischen Zustand zu halten. Wenden Sie zusätzliche Injektion von Anästhetika, falls erforderlich, nach der Überprüfung der Schüler und die Reaktion auf Schmerzstimulation. Überwachen und halten Sie eine Körpertemperatur in der Nähe von 37 °C.
3. Exposition des Ischias-Nervenstamms zur Aufnahme
   1. Die Haut und den Muskel auf dem dorsalen Teil des Oberschenkels aufschneiden. Führen Sie eine stumpfe Sezierung entlang femoralen Bizeps. Isolieren Sie den Ischiasnervenstamm sorgfältig mit einer Augenschere und einer Glastrennnadel. Halten Sie das Gewebe mit Ringers Lösung nass.
   2. Fixieren Sie das Tier auf einem hausgemachten Metallreifen (3 cm lang, 2 mm breit Metallreifen mit einem Eisendraht 1 mm Durchmesser) über das Nähen der Haut in den Schlitz um sie herum. Ziehen Sie die Haut leicht nach oben, um ein flüssiges Bad zu etablieren.
   3. 1 cm Ischiasnervenstamm an der proximalen Seite aussetzen. Legen Sie eine kleine braune Plattform unter den Nervenstamm, um den Kontrast zu verstärken und den feinen Nervenstamm deutlich zu beobachten. Spülen Sie flüssiges Paraffin in einem Wasserbad auf 37 °C und lassen Sie es auf die Oberseite des Nervenstammes fallen, um eine Trocknung der Faseroberfläche zu verhindern. Entfernen Sie die Pia mater spinalis und dura mater um den Ischiasnerv.
4. Aufnahmesitzung
   1. Wählen Sie ein Platin-Filament (29 m Durchmesser) als Aufnahmeelektrode aus. Erhitzen Sie sich für ein einfacheres Formen, und erstellen Sie einen kleinen Haken ganz am Ende. Befestigen Sie die Elektrode an einem Mikromanipulator, um die Elektrode nach Bedarf zu bewegen.
   2. Legen Sie im Bad eine Referenzelektrode in das angrenzende Unterhautgewebe. Teilen Sie die Spinaldura und die Pia mater. Trennen Sie den Ischiasnerv im Aufnahmebecken in eine einzige Faser (15-20 m Durchmesser). Nehmen Sie dann eine feine Faszikel von Axon und hängen Sie das proximale Ende des Axons am Haken der Aufnahmeelektrode unter einem Stereoskop bei 25-facher Vergrößerung aus.
      HINWEIS: Die gerade sezierten Filamente sind tendenziell dicker und erfordern eine weitere Trennung, bis eine einzelne Einheit aufgezeichnet werden kann.
   3. Identifizieren Sie das empfängliche Feld einer einzelnen nozizeptiven C-Faser mit einem mechanischen Reiz (Von Frey-Haar) und thermischen Reizen (kleine Baumwollkugel mit 50-55 °C Wasser). Kurz, wenn das Abfeuern von Nervenfasern auf die mechanischen Reize und heißes Wasser reagieren, dann betrachten Sie es als polymodales Nozizeptiv C-Faser⁴. Als nächstes legen Sie zwei Nadelstimuluselektroden (2 mm Intervall) in die Haut des identifizierten Feldes für die Abgabe von elektrischen Reizen ein.
   4. Zeigen Sie die Wellenform eines Aktionspotentials auf Oszilloskop an und verwenden Sie eine Computer-A/D-Platine mit einer Signalabtastungsrate von 20 kHz, um die Spitzen zu verstärken und aufzuzeichnen.
   5. Sammeln von Daten mithilfe von Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien). Speichern Sie Daten auf einem Computer und analysieren Sie später mit professioneller Software (Tabelle der Materialien).

3. Messung des Leitungsversagens

1. Liefern Sie die sich wiederholenden elektrischen Reize (0,8 ms Dauer, 1,5x Schwellenintensität) in verschiedenen Frequenzen (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) an eine C-Faser für 60 s^4,8,9. Lassen Sie ein 10 min Intervall für Faser zwischen den Reizen zu entspannen. Berechnen Sie das Verhältnis der Anzahl der Ausfälle zur Anzahl der gelieferten repetitiven Impulsimpulse und multiplizieren Sie sich mit 100%, um den Grad des Leitungsversagens zu erhalten.

4. Vorbereitung der Iintact DRG mit Ischiasnerv befestigt

1. Bereiten Sie chirurgische Werkzeuge und Ringers extrazelluläre Lösung vor, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
2. Trennen Sie die DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv.
   1. Anästhetisieren Sie die Ratten wie in Schritt 2.2 beschrieben (an den Tagen 3 bis 7 nach cfA-Injektion). Schneiden Sie das Haar auf Rücken und Bein mit Schere, und sterilisieren Sie die Haut mit Tinktur von Jod.
   2. Bei DRG-Exposition die Haut zunächst von der Mittellinie des Rückens auf der Segmentebene L4 bis L5 aufschneiden. Entfernen Sie Muskeln, den Prozess der Wirbelsäule, Wirbelbrett, und Transverderprozess mit einem Knochen rongeur, um das Rückenmark und DRG Körper auszusetzen. Bedecken Sie das exponierte Rückenmark und DRG mit Baumwolle, die von der extrazellulären Lösung von Ringer infiltriert wird, um die neuronale Aktivität aufrechtzuerhalten. Stoppen Sie die Blutung und löschen Sie das Blut rechtzeitig.
   3. Setzen Sie den Ischiasnerv aus zwei Richtungen aus: Entfernen Sie die Knochenstruktur L4 bis S1 oberhalb des Wirbelforamens mit einer ophthalmologischen Schere, um den mit DRG verbundenen Spinalnerv, der sich am proximalen Ende des Ischiasnervs befindet, freizulegen. Die Haut aufschneiden, um den Ischiasnerv am mittleren Oberschenkel freizulegen. Trennen und trennen Sie den Ischiasnerv vom distalen Ende des Nervs, wo er in den Muskel geht, und ligaten Sie den Nervenstamm mit chirurgischer Linie am Ende des Nervs vor dem Schneiden.
   4. Trennen Sie den Ischiasnerv mit einer ophthalmologischen Schere durch Heben des Nervenligationspunktes vom darunter liegenden Bindegewebe. Entfernen Sie die Dura aus dem Rückenmark und trennen Sie das DRG vom darunter liegenden Bindegewebe, indem Sie die Rückenwurzel heben, bis sie den angrenzenden Teil des Ischiasnervs erreicht. So isolieren Sie die gesamte Vorbereitung von DRG mit einem angeschlossenen Ischiasnerv.
3. Löschen Sie die Oberfläche der DRG.
   1. Entfernen Sie die Spinaldura auf den Oberflächen des L4-L6 DRG vorsichtig mit einer Pinzette unter einem Stereoskop bei 4-facher Vergrößerung.
   2. Das DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv in ein Glasrohr geben, das 1 ml gemischte Enzyme (0,2% Proteinase und 0,32% Kollagennase) enthält, und 15 min in einem 37 °C-Wasserbad verdauen (mit einem Plastiktropfen im Abstand von 5 min leicht blasen).
   3. Heben Sie das Ende der Ligationslinie an und bewegen Sie die Zubereitung auf eine Schale, die mit einer normalen ringer extrazellulären Lösung gefüllt ist, um das Enzym auszuwaschen. Dann übertragen Sie das verdautdronierte DRG in einen Behälter (Abbildung1A), gefüllt mit sauerstoffhaltiger Ringer-Extrazelllösung zur Aufnahme.
4. Aufnahmesitzung
   1. Bereiten Sie intrazelluläre Lösung (in mM: Kaliumgluconat 120, KCl 18, MgCl₂ 2, Ethylenglykol-bis(-Aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure [EGTA] 5, HEPES 10, Na₂-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl₂ 1; pH 7.2 und 300 mOsm). Halten Sie bei 0 °C bis zur Anwendung.
   2. Ganglien mit einem Scheibenanker stabilisieren und Nervenende mit einer saugstimulierenden Elektrode verbinden (Abbildung 1A). Visualisieren und wählen Sie ein DRG-Neuron mit einem Wasser-Immersionsobjektiv bei 40-facher Vergrößerung aus.
   3. Ziehen Sie eine Elektrode (Materialtabelle) und füllen Sie sie mit intrazellulärer Lösung. Elektrode auf haltern und positiven Druck in die Pipette mit einem Endwiderstand von 4-7 M anführen.
   4. Elektrode in die Nähe der Zelle bringen und berühren. Geben Sie einen Unterdruck in der Pipette, sobald die G-Dichtung erreicht ist, stellen Sie das Membranpotential auf etwa -60 mV und legen Sie dann den Ganzzellaufnahmemodus fest.
   5. Liefern Sie sich wiederholende Reize von 5-50 Hz an den Ischiasnerv durch die Saugelektrode, um auf Leitungsversagen zu überprüfen. Messen Sie die Amplitude des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von der Basislinie bis zum Peak und die AHP-Dauer von 80 %.
      HINWEIS: Zur Analyse der Daten wurde eine einwegige Varianzanalyse (ANOVA; für mehr als zwei Gruppen) oder der T-Test des Schülers (für nur zwei Gruppen) verwendet. Die Daten werden als Mittel dargestellt, der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist. Der statistisch signifikante Wert wurde auf p < 0,05 festgelegt.
5. Beenden des Experiments
   1. Wenn die experimentelle Aufgabe beendet ist, während die Ratten noch unter Narkosesituation sind, werden Ratten human mit einer intrakardialen Injektion von Überdosis Pentobarbital-Natrium eingeschläfert.

Ergebnisse

Das Ergebnis des Single-Faser-Aufnahmeprotokolls hängt von der Qualität der Fasersektion ab. Das Tier für In-vivo-Experimente muss in einer guten Situation sein, um den Nervenstamm gesund zu halten, um eine einfache Zerlegung zu erhalten (siehe Rat schlagesinimt im Diskussionsteil). Ein Drogenanwendungsbad ist in vielen Fällen für die Medikamentenabgabe auf Fasern erforderlich. Abbildung 1 zeigt, wie die In-vivo-Einzelfaseraufzeichnung betrieben wurde (Abbildung 1A) und...

Diskussion

Obwohl neuere Studien Kalzium-Bildgebung von DRG-Neuronen in vivo¹⁶erreicht haben, bleibt die Durchführung von in vivo Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen DRG-Nozizeptoren äußerst anspruchsvoll. Daher ist ein in vivo Singlefaser-Ansatz für das Schmerzfeld von anhaltendem Bedeutung. Die Einzelfaseraufzeichnung im vorliegenden Protokoll ermöglicht eine objektive Beobachtung von Leitungsversagensphänomenen, und die Kombination dieser Technik mit der in der aktuellen Studie entwickelten Ex-vivo-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia