İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Özet

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

Özet

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemlerinde sinir lifleri için özel uygulama nedeniyle son birkaç on yıl içinde klasik ve etkili bir elektrofizyolojik teknik olmuştur. Bu yöntem özellikle dorsal kök gangliyonu için geçerlidir (DRG), hangi sinir süreçlerinin bir sözde-unipolar yapısı sergileyen birincil duyusal nöronlar vardır. Aksonlar boyunca geçen etki potansiyellerinin desenleri ve özellikleri bu nöronlarda kaydedilebilir. Bu çalışmada tam Freund's adjuvan (CFA) tedavi sıçanlarda siyatik sinirlerin iletim yetmezliği gözlemlemek için in vivo tek lif kayıtları kullanır. Altta yatan mekanizma in vivo tek lifli kayıtlar kullanılarak çalışılamayacağından, DRG nöronların yama-kelepçe kayıtları bağlı siyatik sinir ile sağlam DRG preparatları üzerinde gerçekleştirilir. Bu kayıtlar, CFA ile tedavi edilen hayvanlarda DRG nöronlarının hiperpolarizasyon sonrası potansiyelinin (AHP) iletim yetmezliği ile yükselen eğimi arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır. In vivo tek lif kayıtları için protokol iletim hızı ölçümü ve bazı hastalıklarda sinir liflerinde anormal koşulların izlenmesi yoluyla sinir liflerinin sınıflandırılması sağlar. Bağlı periferik sinir ile Bozulmamış DRG en fizyolojik koşullarda DRG nöronların aktivitesinin gözlem sağlar. Kesin olarak, bozulmamış DRG'lerin elektrofizyolojik kaydı ile birlikte tek fiber kayıt analjezik süreç sırasında iletim yetmezliğinin rolünü incelemek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Sinir lifleri boyunca bilginin normal iletimi sinir sisteminin normal işlevini garanti eder. Sinir sisteminin anormal işleyişi de sinir liflerinin elektrik sinyali iletiminde yansıtılır. Örneğin, santral demiyelinasyon lezyonlarında demiyelinasyon derecesi, müdahale uygulaması 1'den önce vesonra sinir iletim hızındaki değişikliklerin karşılaştırılması yoluyla sınıflandırılabilir. Bu kalamar devi akson²gibi özel preparatlar dışında, hücre içi sinir lifleri kaydetmek zordur. Bu nedenle, elektrofizyolojik aktivite sadece tek liflerin hücre dışı kayıt yoluyla kaydedilebilir. Klasik elektrofizyolojik yöntemlerden biri olan tek fiber kayıt, diğer tekniklerden daha uzun bir geçmişe sahiptir. Ancak, daha az elektrofizyologlar geniş uygulama rağmen bu yöntemi kavrayan. Bu nedenle, uygun uygulama için tek fiber kayıt için standart protokolün ayrıntılı bir giriş gereklidir.

Çeşitli yama-kelepçe teknikleri modern elektrofizyolojik çalışmaya hakim olmasına rağmen, tek-fiber kayıt hala sinir liflerinin faaliyetlerinin kayıt yeri doldurulamaz bir rol oynar, özellikle lifler ile periferik hissi ile iletim dorsal kök ganglion (DRG) bulunan duyu hücresi gövdesi. Burada tek fiber kayıt kullanmanın avantajı, in vivo fiber kaydının hücre içi ortamda bozulma dan yoksun klinik öncesi modellerde doğal uyaranlara verilen tepkileri kaydetme kapasitesiile uzun bir gözlem süresi sağlamasıdır^{3 , 4 .}

Son yirmi yılda çalışmaların giderek artan sayıda sinir lifleri boyunca karmaşık fonksiyonları inceledi⁵, ve akson boyunca başarısız sinir impuls iletimi bir devlet olarak tanımlanan iletim yetmezliği, birçok farklı mevcuttu periferik sinirler^6,7. Bizim soruşturma iletim yetmezliği varlığı C-lifleri boyunca kalıcı nosiceptive giriş modülasyonu için içsel bir kendi kendine inhibitör mekanizma olarak görev yaptı⁸. Bu iletim yetmezliği önemli ölçüde hiperaljezi koşulları altında zayıflatılmış^4,9. Bu nedenle, iletim yetmezliği dahil faktörleri hedefleme nöropatik ağrı için yeni bir tedavi temsil edebilir. İletim arızasını gözlemlemek için, ateşleme deseni tek fiber kayıt temelinde sırayla deşarj sivri temelinde kaydedilmeli ve analiz edilmelidir.

İletim yetmezliği mekanizmasını iyice anlamak için, akson iletim özelliklerini belirlemek için gereklidir, ya da daha doğrusu, DRG nöronların membran özellikleri, onların sözde unipolar anatomik özelliklerine dayalı. Bu alanda birçok önceki çalışmalar ayrıştırılmış DRG nöronlar üzerinde yapılmıştır^10,11, hangi iki engel nedeniyle iletim yetmezliği nin araştırılması için mümkün olmayabilir. İlk olarak, drg nöronlar serbest dissosyasyon sürecinde çeşitli mekanik ve kimyasal yöntemler kullanılır, hangi sağlıksız hücrelere neden olabilir veya nöronların fenotip / özellikleri değiştirmek ve bulguları şaşırtmak. İkinci olarak, bağlı periferik sinirler temelde kaldırılır, ve iletim yetmezliği olayları bu preparatlarda gözlemlenebilir değildir. Bu nedenle, bağlı bir sinir ile bozulmamış DRG nöronların bir hazırlık yukarıda belirtilen engelleri önlemek için geliştirilmiştir.

Protokol

Mevcut protokol, Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Politikası'nı takip etti ve Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi protokolü onayladı.

1. Hayvanlar

1. 24 Sprague-Dawley fareyi (4-8 haftalık) iki gruba ayırın. 14 sıçandan oluşan bir grupta 100 μL CFA intraplantar enjeksiyon uyarak freund'un adjuvan (CFA) modelini ve 10 sıçandan oluşan başka bir grubu salin ile tedavi ederek üretin.
   NOT: Tüm hayvanlar Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi'nden satın alınmıştır. Yetişkin erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları (150-200 g) tüm işlemler için kullanıldı ve sıçanlar rastgele kafeslere atandı. Kafes başına iki sıçan, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile sabit bir sıcaklıkta (25 ± 1 °C) 12/12 saatlik bir ışık/karanlık döngüsü altında barındırıldı.

2. In Vivo Tek Fiber Kayıt

1. Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletleri (neşter, cımbız, oftalmik makas, makas, cam ayıran iğne, dikiş iğnesi, kemik rongeur) hazırlayın ve dezenfekte edin. Normal Ringer'ın hücre dışı çözeltisinin 1 L veya 2 L'sini hazırlayın (mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1.25, glukoz 15; pH 7.4 ve 305 mOsm). Kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
2. Anestezi fareleri. CFA enjeksiyonundan sonraki 3-7 günlerde, deney sırasında hayvanları stabil bir estetik durumda tutmak için karışık çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonunu (%1 kloralose ve %17 üretan, 5 mL/kg vücut ağırlığı) kullanın. Göz bebeklerini kontrol ettikten ve ağrı stimülasyonuna yanıt verdikten sonra gerekirse ek anestezi enjeksiyonu uygulayın. Vücut Sıcaklığını 37 °C'ye yakın bir şekilde izleyin ve koruyun.
3. Kayıt için siyatik sinir gövdesinin pozu
   1. Uyluk sırt kısmında deri ve kas açık kesin. Femoral pazı boyunca künt bir diseksiyon gerçekleştirin. Dikkatle oftalmik makas ve cam ayırma iğnesi kullanarak siyatik sinir gövde izole. Ringer'ın solüsyonu kullanarak dokuyu ıslak tutun.
   2. Bir ev yapımı metal çember üzerinde hayvan sabit (3 cm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde metal çember bir demir tel ile 1 mm çapında) etrafında yuvaya deri dikiş yoluyla. Sıvı banyosu kurmak için deriyi hafifçe yukarı çekin.
   3. Proksimal tarafta 1 cm siyatik sinir gövdesi açığa alın. Kontrastı artırmak ve ince sinir gövdesini net bir şekilde gözlemlemek için sinir gövdesinin altına küçük kahverengi bir platform yerleştirin. Isı sıvı parafin bir su banyosunda 37 °C ve lif yüzeyinin kurumasını önlemek için sinir gövdesinin üstüne bırakın. Siyatik sinir etrafında pia mater spinalis ve dura mater çıkarın.
4. Kayıt oturumu
   1. Kayıt elektrotolarak platin filament (29 m çapında) seçin. Isı üzerinde daha kolay kalıp lama için, ve çok sonunda küçük bir kanca oluşturun. Elektrotun gerektiği gibi hareket etmesi için elektrotu bir mikromanipülatöre takın.
   2. Banyoda, bitişik deri altı dokubir referans elektrot yerleştirin. Spinal dura ve pia mater'ı ayırın. Siyatik siniri kayıt havuzundaki tek bir fibere (15-20 μm çapında) ayırın. Sonra, akson ince bir fascicle almak ve 25x büyütme bir stereoskop altında kayıt elektrot kanca üzerinde akson proksimal ucunu askıya.
      NOT: Sadece parçalanmış filamentler kalın olma eğilimindedir ve tek bir birim kaydedilene kadar daha fazla ayırma gerektirir.
   3. Mekanik bir uyarıcı (Von Frey kılları) ve termal uyarıcı (50-55 °C su ile küçük pamuk topu) kullanarak tek bir nosiseptif C-fiber alıcı alanını tanımlayın. Kısaca, sinir lifi ateş mekanik uyaranlara ve sıcak su yanıt, o zaman bir polimodal nosiceptive C-fiber⁴olarak düşünün. Daha sonra, elektriksel uyaranların teslimi için tanımlanan alanın derisine iki iğne uyarıcı elektrot (2 mm aralık) yerleştirin.
   4. Osiloskopta bir eylem potansiyelinin dalga formunu görüntüleyin ve ani artışları yükseltmek ve kaydetmek için sinyal örnekleme hızı 20 kHz olan bir bilgisayar A/D kartı nı çalıştırın.
   5. Veri toplama yazılımınıkullanarak veri toplama (Malzeme Tablosu). Verileri bilgisayara kaydedin ve dahasonra profesyonel yazılımlarla analiz edin (Malzeme Tablosu).

3. İletim Hatasının Ölçülmesi

1. Farklı frekanslarda (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) tekrarlayan elektriksel uyaranları (0,8 ms süre, 1,5x eşik yoğunluğu) 60 s^4,8,9için bir C-fiber'e teslim edin. Uyarıcılar arasında dinlenmek için lif için 10 dk aralığı na izin verin. Hata sayısının tekrarlanan uyarıcı darbelerin sayısına oranını hesaplayın ve iletim hatası derecesini elde etmek için %100 çarpın.

4. Siyatik Sinir Ile Bağlı Iintact DRG hazırlanması

1. Adım 2.1'de açıklandığı gibi cerrahi aletler ve Ringer'ın hücre dışı solüsyonu hazırlayın.
2. Bağlı siyatik sinir ile DRG ayırın.
   1. Adım 2.2'de açıklandığı gibi sıçanları anestezi edin (CFA enjeksiyonundan sonra 3 ila 7 gün içinde). Sırt ve bacak üzerinde kesme makas ile saç kesin ve iyot tentürü ile cildi sterilize.
   2. DRG maruziyeti için, ilk l4 l5 segment düzeyinde arka orta hattan açık deri kesti. Kasları çıkarın, omurga süreci, omurga kurulu, ve omurilik ve DRG vücut ortaya çıkarmak için bir kemik rongeur kullanarak enine süreç. Nöral aktiviteyi korumak için normal Ringer'ın hücre dışı çözeltisi tarafından sızmış pamuklarla maruz kalan omuriliği ve DRG'yi kapatın. Kanamayı durdurun ve kanı zamanında temizleyin.
   3. Iki yönden siyatik sinir maruz: siyatik sinirproksimal sonunda olan DRG bağlı spinal sinir ortaya çıkarmak için oftalmik makas kullanarak vertebra foramen üzerinde S1 kemik yapısı L4 kaldırın. Orta uyluk siyatik sinir ortaya çıkarmak için deri açık kesin. Ayrı ve kas içine gider sinirin distal ucundan siyatik sinir kesmek, ve kesmeden önce sinir in ucunda cerrahi hat ile sinir gövdesi ligate.
   4. Sinir ligasyon noktasının kaldırılması yoluyla oftalmik makas kullanarak altta yatan bağ dokusundan siyatik sinir ayırın. Omurilikten dura çıkarın ve siyatik sinirin bitişik kısmına ulaşana kadar dorsal kök kaldırarak altta yatan bağ dokusundan DRG ayırın. Böylece, bağlı bir siyatik sinir ile DRG tüm hazırlık izole.
3. DRG'nin yüzeyini temizleyin.
   1. 4x büyütmede stereoskop altında cımbız kullanarak L4−L6 DRG yüzeylerinde spinal durayı dikkatlice çıkarın.
   2. 1 mL karışık enzim (%0.2 proteinaz ve %0.32 kollajenaz) içeren cam bir tüpe bağlı siyatik sinir içeren DRG'yi yerleştirin ve 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca sindirin (5 dakika aralıkla plastik damlalıkla hafifçe üfleyin).
   3. Ligasyon hattının ucunu kaldırın ve enzimi temizlemek için normal bir Ringer'ın hücre dışı çözeltisi ile dolu bir tabağa preparatı taşıyın. Daha sonra sindirilmiş DRG'yi kayıt için oksijenli Ringer'ın hücre dışı çözeltisi ile dolu bir kap (Şekil1A) aktarın.
4. Kayıt oturumu
   1. Hücre içi solüsyonu hazırlayın (mM: potasyum glukonat 120, KCl 18, MgCl_2, etilen glikol-bis(β-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraasetik asit [EGTA] 5, HEPES 10, Na-GTP 0.4, Na-GTP 0.4, CaCl₂ 1; pH 7.2 ve 300 mOs). Kullanıma kadar 0 °C'de tutun.
   2. Bir dilim çapa kullanarak ganglia stabilize ve bir emme uyarıcı elektrot sinir ucu bağlamak (Şekil1A). 40x büyütmede su daldırma hedefi olan bir DRG nöronunu görselleştirin ve seçin.
   3. Bir elektrotçekin (Malzeme Tablosu) ve hücre içi çözelti ile doldurun. Tutucuya elektrot yerleştirin ve 4-7 MΩ son dirençle pipete pozitif basınç uygulayın.
   4. Elektrot hücreye yaklaştırın ve ona dokunun. Pipette negatif basınç verin, GΩ mührü ne zaman ulaşılırsa, membran potansiyelini yaklaşık -60 mV olarak ayarlayın ve tüm hücre kayıt modunu kurun.
   5. İletken yetmezliği için ekrana emme elektrot yoluyla siyatik sinir 5-50 Hz tekrarlayan uyaranları teslim. Hiperpolarizasyon potansiyelinin (AHP) genliğini taban çizgisinden tepeye ve %80 AHP süresini ölçün.
      NOT: Verileri analiz etmek için varyans (ANOVA; ikiden fazla grup için) veya Student'in t-testi (yalnızca iki grup için) tek yönlü çözümleme kullanılmıştır. Veriler ortalamanın ± standart hatası (SEM) olarak sunulur. İstatistiksel anlamlı düzey p < 0.05 olarak belirlendi.
5. Deneyi Sona Erdirme
   1. Fareler hala anestezik durumdayken deneysel görev tamamlandığında, sıçanlar aşırı doz pentobarbital sodyum intrakardiyak enjeksiyonları ile insancıl ötenazi edilirler.

Sonuçlar

Tek fiber kayıt protokolünün sonucu fiber diseksiyonun kalitesine bağlıdır. In vivo deneyler için hayvan kolay diseksiyon için sinir gövdesi sağlıklı tutmak için iyi bir durumda olmalıdır (tartışma bölümünde tavsiye bakınız). Bir ilaç uygulama banyosu liflerüzerinde ilaç teslimi için birçok durumda gereklidir. Şekil 1, in vivo tek lifli kaydın nasıl işletildiğini göstermektedir (Şekil1A) ve CFA ile tedavi edilen hayvanların siyatik sinirind...

Tartışmalar

Son çalışmalar vivo¹⁶yılında DRG nöronların kalsiyum görüntüleme elde etmiş olmasına rağmen, bireysel DRG nosiceptors in vivo patch-clamp kayıt performans son derece zor kalır. Bu nedenle ağrı alanı için in vivo tek lifli yaklaşım devam ediyor. Mevcut protokolde tek elyaf lı kayıt, iletim yetmezliği olgularının objektif olarak gözlemlemesine olanak sağlar ve bu tekniğin mevcut çalışmada geliştirilen ex vivo preparat ile birleşimi altta yatan mekanizmaların incele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia