Utilisation de l'enregistrement in vivo à fibre unique et du ganglion de racine dorsal intact avec le nerf sciatique attaché pour examiner le mécanisme de l'échec de conduction

Résumé

L'enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s'applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l'échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.

Résumé

L'enregistrement à fibre unique a été une technique électrophysiologique classique et efficace au cours des dernières décennies en raison de son application spécifique pour les fibres nerveuses dans les systèmes nerveux central et périphérique. Cette méthode est particulièrement applicable aux ganglions de racines dorsales (DRG), qui sont des neurones sensoriels primaires qui présentent une structure pseudo-unipolaire des processus nerveux. Les modèles et les caractéristiques des potentiels d'action transmis le long des axones sont enregistrés dans ces neurones. La présente étude utilise des enregistrements in vivo à fibre unique pour observer l'échec de conduction des nerfs sciatiques chez les rats traités par Freund (CFA) traités par Freund's adjuvant complet (CFA). Comme le mécanisme sous-jacent ne peut pas être étudié à l'aide d'enregistrements in vivo à fibre unique, les enregistrements patch-clamp des neurones DRG sont effectués sur les préparations de DRG intact avec le nerf sciatique attaché. Ces enregistrements révèlent une corrélation positive entre l'échec de conduction et la pente montante du potentiel d'après-hyperpolarisation (AHP) des neurones dRG chez les animaux TRAITÉS par CFA. Le protocole pour les enregistrements in vivo de fibres uniques permet la classification des fibres nerveuses par la mesure de la vitesse de conduction et la surveillance des conditions anormales dans les fibres nerveuses dans certaines maladies. DRG intact avec le nerf périphérique attaché permet l'observation de l'activité des neurones de DRG dans la plupart des conditions physiologiques. De façon concluante, l'enregistrement à fibre unique combiné à l'enregistrement électrophysiologique de DrGs intacts est une méthode efficace pour examiner le rôle de l'échec de conduction pendant le processus analgésique.

Introduction

La transmission normale de l'information le long des fibres nerveuses garantit la fonction normale du système nerveux. Le fonctionnement anormal du système nerveux se reflète également dans la transmission du signal électrique des fibres nerveuses. Par exemple, le degré de démyélinisation dans les lésions centrales de démyélinisation peutêtre classifié par comparaison des changements dans la vitesse de conduction de nerf avant et après application d'intervention 1. Il est difficile d'enregistrer intracellulairement les fibres nerveuses, sauf dans les préparations spéciales telles que l'axone géant de calmar². Par conséquent, l'activité électrophysiologique n'est enregistrable que par l'enregistrement extracellulaire de fibres uniques. Comme l'une des méthodes électrophysiologiques classiques, l'enregistrement à fibre unique a une histoire plus longue que d'autres techniques. Cependant, moins d'électrophysiologistes saisissent cette méthode en dépit de son application étendue. Par conséquent, une introduction détaillée du protocole standard pour l'enregistrement à fibre unique est nécessaire pour son application appropriée.

Bien que diverses techniques de patch-clamp aient dominé l'étude électrophysiologique moderne, l'enregistrement d'une seule fibre joue toujours un rôle irremplaçable en enregistrant les activités des fibres nerveuses, en particulier les fibres transmettant la sensation périphérique avec leur corps cellulaire sensoriel situé dans le ganglion de racine dorsal (DRG). L'avantage d'utiliser l'enregistrement à fibre unique ici est que l'enregistrement in vivo de fibre fournit un long temps d'observation avec la capacité d'enregistrer des réponses aux stimulus normaux dans les modèles précliniques sans perturbation de l'environnement intracellulaire^{3 , 4}.

Un nombre croissant d'études au cours des deux dernières décennies a examiné des fonctions complexes le long des fibres nerveuses⁵, et l'échec de conduction, qui est défini comme un état de transmission infructueuse d'impulsion nerveuse le long de l'axone, était présent dans beaucoup de différents différents nerfs périphériques^6,7. La présence de l'échec de conduction dans notre enquête a servi de mécanisme intrinsèque d'auto-inhibiteur pour la modulation de l'entrée nociceptive persistante le long des c-fibres⁸. Cette défaillance de conduction a été significativement atténuée dans des conditions d'hyperalgésie^4,9. Par conséquent, le ciblage des facteurs impliqués dans l'échec de conduction peut représenter un nouveau traitement pour la douleur neuropathique. Pour observer la défaillance de conduction, le modèle de tir doit être enregistré et analysé sur la base des pointes séquentiellement déchargées basées sur l'enregistrement d'une seule fibre.

Pour bien comprendre le mécanisme de l'échec de conduction, il est nécessaire d'identifier les propriétés de transmission de l'axone, ou plus précisément, les propriétés membranaires des neurones DRG, en fonction de leurs propriétés anatomiques pseudo-unipolaires. Beaucoup d'études précédentes dans ce domaine ont été exécutées sur les neurones dissociés de DRG^10,11, qui peuvent ne pas être faisables pour l'étude de l'échec de conduction dû à deux obstacles. Tout d'abord, diverses méthodes mécaniques et chimiques sont utilisées dans le processus de dissociation pour libérer les neurones DRG, ce qui peut entraîner des cellules malsaines ou modifier le phénotype / propriétés des neurones et confondre les résultats. Deuxièmement, les nerfs périphériques attachés sont fondamentalement enlevés, et les phénomènes de défaillance de conduction ne sont pas observables dans ces préparations. Par conséquent, une préparation des neurones dRG intacts avec un nerf attaché a été améliorée pour éviter les obstacles mentionnés ci-dessus.

Protocole

Le protocole actuel faisait suite à la Politique du Guide for United States Public Health Service sur les soins sans cruauté et l'utilisation des animaux de laboratoire, et le Comité sur l'éthique des expériences animales de la quatrième université médicale militaire a approuvé le protocole.

1. Animaux

1. Diviser 24 rats Sprague-Dawley (4-8 semaines) en deux groupes. Produire le modèle complet d'adjuvant de Freund (CFA) par injection intraplantaire de 100 OL de CFA dans un groupe de 14 rats et un autre groupe de 10 rats par traitement à la saline.
   REMARQUE : Tous les animaux ont été acquis du Centre animalier de la Quatrième Université Médicale Militaire. Des rats mâles et femelles adultes de Sprague-Dawley (150-200 g) ont été employés pour toutes les procédures, et les rats ont été aléatoirement assignés aux cages. Deux rats ont été logés par cage sous un cycle de lumière/obscurité de 12/12 heures à une température constante (25 o1 oC) avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau.

2. In Vivo Single-fiber Recording

1. Préparer et désinfecter tous les instruments chirurgicaux (scalpel, pince à épiler, ciseaux ophtalmiques, ciseaux de cisaillement, aiguille de séparation de verre, aiguille de suture, rongeur d'os) avant la chirurgie. Préparer 1 L ou 2 L de la solution extracellulaire normale de Ringer (en mM : NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1,25, glucose 15; pH 7.4 et 305 mOsm). Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
2. Anesthésiez les rats. Les jours 3 à 7 après l'injection de CFA, utilisez l'injection intrapéritonéale d'une solution mixte (1 % de chloralose et 17 % d'uréthane, 5 mL/kg de poids corporel) pour maintenir les animaux dans un état esthétique stable pendant l'expérience. Appliquer l'injection supplémentaire d'anesthésiques, si nécessaire, après avoir vérifié les pupilles et la réponse à la stimulation de la douleur. Surveiller et maintenir une température corporelle proche de 37 oC.
3. Exposition du tronc sciatique de nerf pour l'enregistrement
   1. Couper la peau et les muscles sur la partie dorsale de la cuisse. Effectuer une dissection émoussée le long des biceps fémoraux. Isoler soigneusement le tronc du nerf sciatique à l'aide de ciseaux ophtalmiques et d'une aiguille de séparation en verre. Gardez le tissu humide à l'aide de la solution de Ringer.
   2. Fixez l'animal sur un cerceau métallique fait maison (3 cm de long, 2 mm de large cerceau métallique avec un fil de fer de 1 mm de diamètre) en cousant la peau dans la fente autour d'elle. Tirez légèrement la peau vers le haut afin d'établir un bain fluide.
   3. Exposer 1 cm de tronc nerveux sciatique du côté proximal. Placez une petite plate-forme brune sous le tronc nerveux pour améliorer le contraste et observez clairement le tronc nerveux fin. Chauffer la paraffine liquide dans un bain d'eau à 37 oC et la déposer sur le dessus du tronc nerveux pour empêcher le séchage de la surface de la fibre. Enlever la pia mater spinalis et dura mater autour du nerf sciatique.
4. séance
   1. Sélectionnez un filament de platine (29 m de diamètre) comme électrode d'enregistrement. Chauffer pour faciliter le moulage, et créer un petit crochet à la toute fin. Fixez l'électrode à un micromanipulateur pour déplacer l'électrode au besoin.
   2. Dans le bain, placez une électrode de référence dans le tissu sous-cutané adjacent. Diviser la dura spinale et la pia mater. Séparer le nerf sciatique en une seule fibre (15-20 m de diamètre) dans la piscine d'enregistrement. Ensuite, prenez un fascicle fin d'axone et suspendez l'extrémité proximale de l'axone sur le crochet de l'électrode d'enregistrement sous un stéréoscope au grossissement 25x.
      REMARQUE: Les filaments juste disséqués ont tendance à être plus épais et nécessitent une séparation plus poussée jusqu'à ce qu'une seule unité puisse être enregistrée.
   3. Identifier le champ réceptif d'une seule fibre C nociceptive à l'aide d'un stimulus mécanique (poils de Von Frey) et d'un stimulus thermique (petite boule de coton avec de l'eau de 50 à 55 oC). En bref, si le tir de la fibre nerveuse répondre aux stimuli mécaniques et à l'eau chaude, puis le considérer comme une polymodal nociceptive C-fibre⁴. Ensuite, insérez deux électrodes de stimulus d'aiguille (intervalle de 2 mm) dans la peau du champ identifié pour la livraison de stimuli électriques.
   4. Affichez la forme d'onde d'un potentiel d'action sur oscilloscope et utilisez une carte A/D d'ordinateur avec un taux d'échantillonnage de signal de 20 kHz pour amplifier et enregistrer les pointes.
   5. Recueillir des données à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données (Tableau des matériaux). Enregistrer des données sur un ordinateur et analyser plus tard avec un logiciel professionnel (Tableau des matériaux).

3. Mesure de l'échec de conduction

1. Fournir les stimuli électriques répétitifs (durée de 0,8 ms, intensité seuil de 1,5x) dans différentes fréquences (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) à une fibre C pour 60 s^4,8,9. Prévoyez un intervalle de 10 min pour que les fibres se détendent entre les stimuli. Calculez le rapport entre le nombre de défaillances et le nombre d'impulsions de stimulation répétitives livrées et multipliez par 100 % pour obtenir le degré de défaillance conduction.

4. Préparation de DRG Iintact attaché avec le nerf sciatique

1. Préparer les outils chirurgicaux et la solution extracellulaire de Ringer tel que décrit à l'étape 2.1.
2. Séparer le DRG avec le nerf sciatique attaché.
   1. Anesthésiez les rats tels que décrits à l'étape 2.2 (les jours 3 à 7 après l'injection de CFA). Couper les cheveux sur le dos et la jambe avec des ciseaux de cisaillement, et stériliser la peau avec une teinture d'iode.
   2. Pour l'exposition DRG, coupez d'abord la peau de la ligne médiane du dos au niveau du segment L4 à L5. Enlever les muscles, le processus de la colonne vertébrale, le tableau des vertèbres, et le processus transversal à l'aide d'un rongeur d'os pour exposer la moelle épinière et le corps DRG. Couvrez la moelle épinière exposée et le DRG avec des cotons infiltrés par la solution extracellulaire normale de Ringer pour maintenir l'activité neuronale. Arrêtez le saignement et effacez le sang à temps.
   3. Exposer le nerf sciatique de deux directions: enlever la structure osseuse L4 à S1 au-dessus du foramen vertébral à l'aide de ciseaux ophtalmiques pour exposer le nerf spinal connecté à DRG qui est à l'extrémité proximale du nerf sciatique. Coupez la peau pour exposer le nerf sciatique à la cuisse centrale. Séparez et déconnectez le nerf sciatique de l'extrémité distale du nerf où il va à l'intérieur du muscle, et ligate le tronc de nerf avec la ligne chirurgicale à l'extrémité du nerf avant la coupe.
   4. Séparez le nerf sciatique du tissu conjonctif sous-jacent à l'aide de ciseaux ophtalmiques par le levage du point de ligature nerveuse. Retirez la dura de la moelle épinière et séparez le DRG du tissu conjonctif sous-jacent en soulevant la racine dorsale jusqu'à ce qu'elle atteigne la partie adjacente du nerf sciatique. Ainsi, isoler toute la préparation de DRG avec un nerf sciatique attaché.
3. Dégagez la surface du DRG.
   1. Retirez soigneusement la dura spinale sur les surfaces de L4-L6 DRG à l'aide d'une pince à épiler sous un stéréoscope au grossissement 4x.
   2. Placer le DRG avec le nerf sciatique attaché dans un tube de verre contenant 1 ml d'enzymes mélangées (0,2% de protéase et 0,32% de collagène) et digérer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min (souffler légèrement avec un goutte-à-goutte en plastique à un intervalle de 5 min).
   3. Soulevez l'extrémité de la ligne de ligature et déplacez la préparation vers un plat rempli de la solution extracellulaire d'une ringer normale pour laver l'enzyme. Ensuite, transférez le DRG digéré dans un récipient (Figure 1A) rempli de solution extracellulaire oxygénée de Ringer pour l'enregistrement.
4. séance
   1. Préparer une solution intracellulaire (en mM : gluconate de potassium 120, KCl 18, MgCl₂ 2, éthylène glycol-bis(ether aminoéthyle)-N,N',N',N',N'-tetraacetic acid [EGTA] 5, HEPES 10, Na₂-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl₂ 1; pH 7.2 et 300 mOsm). Conserver à 0 oC jusqu'à utilisation.
   2. Stabiliser les ganglions à l'aide d'une ancre de tranche et connecter l'extrémité nerveuse à une électrode stimulant l'aspiration (Figure 1A). Visualisez et sélectionnez un neurone DRG avec un objectif d'immersion dans l'eau à 40x grossissement.
   3. Tirez une électrode (Table of Materials) et remplissez-la d'une solution intracellulaire. Insérez l'électrode sur le support et appliquez une pression positive dans la pipette avec une résistance finale de 4-7 M.
   4. Apportez l'électrode près de la cellule et touchez-la. Donner une pression négative dans la pipette, une fois que le joint de G est atteint, définir le potentiel de membrane à environ -60 mV et ensuite établir le mode d'enregistrement à cellule entière.
   5. Fournir des stimuli répétitifs de 5-50 Hz au nerf sciatique à travers l'électrode d'aspiration à l'écran pour l'échec de conduction. Mesurer l'amplitude du potentiel d'après-hyperpolarisation (AHP) de la ligne de base au pic, et la durée de 80 % du PPH.
      REMARQUE: L'analyse à sens unique de la variance (ANOVA; pour plus de deux groupes) ou du test t de l'étudiant (pour seulement deux groupes) a été utilisée pour analyser les données. Les données sont présentées comme des moyens et une erreur standard de la moyenne (SEM). Le niveau statistique significatif a été fixé à p 'lt; 0,05.
5. Mettre fin à l'expérience
   1. Lorsque la tâche expérimentale est terminée alors que les rats sont encore en situation anesthésique, les rats sont euthanasiés sans humains avec une injection intracardiaque de surdosage pentobarbital sodium.

Résultats

Le résultat du protocole d'enregistrement à fibre unique dépend de la qualité de la dissection de fibre. L'animal pour les expériences in vivo doit être dans une bonne situation pour garder le tronc nerveux en bonne santé pour une dissection facile (voir les conseils dans la section de discussion). Un bain d'application de drogue est nécessaire dans beaucoup de cas pour la livraison de drogue sur des fibres. La figure 1 illustre comment l'enregistrement in vivo à fibre unique a été exploité (...

Discussion

Bien que des études récentes aient atteint l'imagerie calcique des neurones de DRG in vivo^16,l'exécution in vivo de l'enregistrement de patch-clamp des nocicepteurs individuels de DRG demeure extrêmement provocante. Par conséquent, une approche in vivo à fibre unique pour le champ de la douleur est d'une importance continue. L'enregistrement à fibre unique dans le protocole actuel permet l'observation objective des phénomènes d'échec de conduction, et la combinaison de cette technique av...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia