השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

Summary

הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.

Abstract

הקלטה חד-סיבי הייתה טכניקת אלקטרופיזיולוגיה קלאסית ואפקטיבית בעשורים האחרונים בגלל היישום הספציפי שלה לסיבי עצב במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. שיטה זו ישימה במיוחד על השורש הבסיסי (DRG), אשר הם נוירונים החושי העיקריים המוצגים מבנה מדומה חד קוטבי של תהליכים העצבים. הדפוסים והתכונות של הפוטנציאל הפעולה המועברים לאורך אקסונים לצריבה אלה נוירונים. המחקר הנוכחי משתמש הקלטות vivo סיב יחיד כדי לבחון את כישלון ההולכה של עצבי מסיבי בתוך השלם של פרוינד מטופלים (פרנק) התייחסו חולדות. כמו המנגנון הבסיסי לא ניתן לחקור באמצעות vivo יחיד סיבים הקלטות, תיקון-קלאמפ-הקלטות של הנוירונים DRG מבוצעים על ההכנות של DRG שלם עם העצב האחורי המצורפת. הקלטות אלה מגלות קורלציה חיובית בין כישלון ההולכה לבין השיפוע העולה של הפוטנציאל לאחר היפרפולריזציה (AHP) של הנוירונים בעלי חיים מטופלים. הפרוטוקול עבור vivo הקלטות סיבים יחיד מאפשר סיווג של סיבי עצב באמצעות מדידת מהירות ההולכה וניטור של מצבים חריגים סיבי העצב במחלות מסוימות. DRG שלמים עם העצב ההיקפי המצורפת מאפשר התבוננות של הפעילות של הנוירונים בסוכרת DRG ברוב התנאים הפיזיולוגיים. באופן סופי, הקלטה של סיב יחיד בשילוב עם הקלטה אלקטרולוגית של DRGs שלמים היא שיטה יעילה לבחון את התפקיד של כשל הולכה במהלך תהליך ההרגעה.

Introduction

התמסורת הנורמלית של המידע לאורך סיבי העצב מבטיחה את התפקוד התקין של מערכת העצבים. תפקוד לא תקין של מערכת העצבים משתקף גם בשידור האות החשמלי של סיבי עצב. לדוגמה, מידת הדמימידינציה בנגעים המיאלואידית המרכזית יכולה להיות מסווגת באמצעות השוואה בין שינויים במהירות הולכה עצבית לפני ואחרי יישום התערבות¹. קשה לintracellularly להקליט סיבי עצב, למעט בהכנות מיוחדות כגון אקב הענק הדיונון². לכן, פעילות אלקטרופיזיולוגית ניתנת להקלטה רק באמצעות הקלטה של סיבים בודדים. בתור אחת השיטות האלקטפיזיולוגיות הקלאסיות, הקלטה של סיבים בודדים יש היסטוריה ארוכה יותר מאשר טכניקות אחרות. עם זאת, פחות פיזיקולוגים האוחזים בשיטה זו למרות היישום הנרחב שלה. לפיכך, נדרשת הקדמה מפורטת של הפרוטוקול הסטנדרטי עבור הקלטה של סיבים בודדים עבור היישום המתאים לו.

למרות טכניקות שונות מלחציים טלאי שלטו מחקר אלקטרולוגי מודרני, הקלטה בודדת סיבים עדיין משחק תפקיד חסר תחליף בהקלטת הפעילויות של סיבי עצב, בעיקר סיבים המשדר תחושה היקפית עם תא חושי הגוף ממוקם גנגליון שורש השורש (DRG). היתרון של שימוש בהקלטה סיב יחיד כאן הוא כי בהקלטה vivo סיבים מספק זמן התבוננות ארוכה עם היכולת להקליט תגובות גירויים טבעיים במודלים פרה-קליניים ללא הפרעה של הסביבה תאיים^{3 , ד}.

מספר גדל והולך של מחקרים בשני העשורים האחרונים בדק פונקציות מורכבות לאורך סיבי עצב⁵, וכישלון הולכה, אשר מוגדר כמצב של שידור הדחף עצבים שנכשלו לאורך האקסון, היה קיים ברבים שונים עצבי היקפי^6,7. הנוכחות של כישלון ההולכה בחקירה שלנו שימש מנגנון מעכבות עצמי מהותי עבור אפנון של קלט nociceptive מתמשך לאורך C-סיבים⁸. כישלון ההולכה הזה נחלש באופן משמעותי בתנאים של היפראלגברית^4,9. לכן, מיקוד הגורמים המעורבים בכישלון ההולכה עשוי לייצג טיפול חדש כאבים נוירופתיים. כדי להתבונן בכישלון ההולכה, דפוס הירי צריך להיות מוקלט ומנותח על בסיס קוצים משוחררים רציפים המבוססים על הקלטה של סיבים בודדים.

כדי להבין ביסודיות את המנגנון של כשל הולכה, יש צורך לזהות את מאפייני השידור של axon, או יותר בדיוק, את תכונות הממברנה של הנוירונים מבוססי DRG, מבוסס על מאפיינים אנטומיים מדומים שלהם-קוטבי. מחקרים קודמים רבים בתחום זה בוצעו על מכשול הנוירונים^10,11, אשר עשוי לא להיות ריאלי לחקירת כשל הולכה בשל שני מכשולים. ראשית, שיטות מכני וכימי שונים משמשים בתהליך הדיסוציאציה כדי לשחרר נוירונים DRG, אשר עשוי לגרום לתאים בריאים או לשנות את פנוטיפ/תכונות של הנוירונים ולבלבל את הממצאים. שנית, העצבים ההיקפיים המצורפים יוסרו בעיקרון, ותופעות כישלון ההולכה אינן מסוימות בהכנות אלה. לכן, הכנת נוירונים DRG שלמים עם עצב מוצמד שופרה כדי למנוע את המכשולים הנ ל.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי עקב אחר המדריך למדיניות הבריאות הציבורית של ארצות הברית בנוגע לטיפול הומאני ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, והוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הצבאית הרביעית אישרה את הפרוטוקול.

1. בעלי חיים

1. חלק 24 חולדות ספראג-דאולי (4-8 שבועות) לשתי קבוצות. לייצר את המודל המלא של פרוינד (מודל) על ידי הזרקת הזרקה של 100 μL של פרנק בקבוצה אחת של 14 חולדות וקבוצה אחרת של 10 חולדות על ידי טיפול עם תמיסת מלח.
   הערה: כל בעלי החיים נרכשו ממרכז בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הצבאית הרביעית. מבוגרים גברים ועכברים ספראג-דאולי (150-200 g) שימשו עבור כל ההליכים, וחולדות הוקצו באופן אקראי לכלובים. שני חולדות היו שוכנו לכלוב תחת 12/12-שעה מחזור אור/כהה בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° c) עם גישה חופשית למזון ולמים.

2. In Vivo הקלטה בודדת סיבים

1. להכין ולחטא את כל כלי הניתוח (אזמל, פינצטה, מספריים אופטלמולוגי, הטיית מספריים, זכוכית הפרדת מחט, תפר המחט, עצם rongeur) לפני הניתוח. להכין 1 L או 2 L של הפתרון הרגיל של המצלצל הצלצול (mM: היום 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, cacl₂ 2,_{נחקו 3} 26, נה₂פו₄ 1.25, גלוקוז 15; pH 7.4 ו-305 mosm). החנות ב-4 ° צ' עד השימוש.
2. . עכברים מורדם בימים 3 עד 7 לאחר ההזרקה, השתמש בהזרקה בתוך הצפק של פתרון מעורב (1% כלורראלז ו -17% אורטאן, 5 מ ל/ק"ג משקל גוף) כדי לשמור על בעלי החיים במצב אסתטי יציב במהלך הניסוי. החלת הזרקה משלימה של הרדמה, במידת הצורך, לאחר בדיקת אישונים ותגובה לגירוי בכאב. ניטור ושמירה על טמפרטורת גוף ליד 37 ° c.
3. חשיפת גזע העצב הגיד להקלטה
   1. לחתוך לפתוח את העור ואת השריר על החלק הרך של הירך. לבצע ניתוח קהה לאורך שרירי הירך. לבודד בזהירות את העורק העצבי הגיד באמצעות מספריים אופטלמולוגי ומחט הפרדת זכוכית. שמור על הרקמה רטובה. בעזרת התמיסה של רינגר
   2. לתקן את החיה על חישוק מתכת תוצרת בית (3 ס מ אורך, 2 מ"מ חישוק מתכת רחב עם חוט ברזל 1 מ"מ בקוטר) באמצעות תפירה את העור לתוך החריץ סביבו. משוך את העור מעט כדי ליצור אמבט נוזלי.
   3. לחשוף 1 ס מ של גזע העצב הגיד בצד האבובית. מניחים פלטפורמה חום קטן תחת המטען העצבי כדי לשפר את הניגודיות ולהתבונן בעורק העצבי העדין בבירור. חום פרפין נוזלי באמבט מים 37 ° c ושחרר אותו על החלק העליון של הגזע העצבי כדי למנוע ייבוש של המשטח של סיבים. הסירו את הספיליס מאטר ודורא מסביב לעצב הירך.
4. הקלטת מושב
   1. בחר פילמנט פלטינה (בקוטר 29 יקרומטר) כאלקטרודות ההקלטה. התחמם על היציקה קלה יותר, וצור וו קטן בסופו של דבר. הצמד את האלקטרודה למיקרומניפולציה כדי להעביר את האלקטרודה כנדרש.
   2. באמבטיה, מניחים אלקטרודה התייחסות ברקמה תת עורית סמוכה. פצל את שדרתי השדרה ואת הפיה. הפרד את העצב החצוף לתוך סיב אחד (15-20 יקרומטר בקוטר) במאגר ההקלטות. לאחר מכן, להרים fascicle קנס של אקסון ולהשעות את הקצה הטוב ביותר של האקסון על הוו של אלקטרודה ההקלטה תחת סטריאוסקופ ב 25x ההגדלה.
      הערה: החוטים הניתנים לגזור נוטים להיות עבים יותר ודורשים הפרדה נוספת עד שיחידה אחת עשויה להיות מוקלטת.
   3. לזהות את השדה הפתוח של אחד nociceptive C-סיבים באמצעות גירוי מכני (פון פריי שערות) וגירוי תרמי (כדור כותנה קטן עם 50-55 ° c מים). בקצרה, אם הירי של סיבי עצב להגיב גירוי מכני ומים חמים, אז לשקול את זה כמו nociceptive C-סיבים מכאניים⁴. בשלב הבא, הכנס שני אלקטרודות גירוי המחט (2 מ"מ מרווח) לתוך העור של השדה המזוהה להעברת גירויים חשמליים.
   4. הצגת צורת גל של פוטנציאל פעולה באמצעות האולוסקופ ולהעסיק מחשב A/D לוח עם קצב דגימה של 20 kHz כדי להגביר ולהקליט את קוצים.
   5. איסוף נתונים באמצעות תוכנת רכישת נתונים (טבלת חומרים). שמור נתונים במחשב ונתח מאוחר יותר עם תוכנות מקצועיות (טבלת חומרים).

3. מדידת כשל הולכה

1. להעביר את הגירויים החשמליים החוזרים (0.8 ms משך, 1.5 x עוצמת הסף) בתדרים שונים (2 hz, 5 הרץ, 10 hz) כדי C-סיבים עבור 60 s^4,8,9. אפשר מרווח של 10 דקות עבור סיבים להירגע בין גירויים. חשב את היחס בין מספר הכשלים למספר הפולסים החוזרים של הגירוי החוזר והכפל ב-100% כדי לקבל את מידת כשל ההולכה.

4. הכנת DRG ללא שינוי מחוברת לעצב הגיד

1. הכינו כלים כירורגיים ופתרון מסחטות של הצלצול כמתואר בשלב 2.1.
2. הפרד את ה-DRG עם. העצב הנוסף המחובר
   1. הללו את העכברושים כמתואר בשלב 2.2 (בימים 3 עד 7 לאחר הזרקת הפרנק). חותכים את השיער האחורי והרגל עם מספריים הטיית, ומעקר את העור בתמיסת יוד.
   2. לחשיפה DRG, לחתוך הראשון לפתוח את העור מהקו האמצע של הגב ברמת L4 to L5 מקטע. להסיר את השרירים, את התהליך של עמוד השדרה, מועצת החוליה, ותהליך רוחבי באמצעות rongeur עצם לחשוף את חוט השדרה ואת הגוף DRG. כסו את חוט השדרה החשוף ו-DRG עם כפות שחדרו לפתרון החילוץ הרגיל של מתחזה לשמירה על פעילות עצבית. עצור את הדימום. ונקה את הדם בזמן
   3. לחשוף את העצב המגיד משני כיוונים: להסיר את L4 כדי מבנה העצם S1 מעל החוליה השדרה באמצעות מספריים אופטלמולוגי כדי לחשוף את העצב השדרה מחובר DRG אשר נמצא בקצה הגבוה ביותר של עצב. לחתוך את העור כדי לחשוף את העצב הגיד בירך האמצעית. להפריד ולנתק את העצב הקווי מן הקצה המרוחק של העצב שבו הוא הולך בתוך השריר, ולשים את גזע העצב עם קו כירורגי בסוף העצב לפני חיתוך.
   4. הפרידו את העצב האחורי מרקמת החיבור הבסיסית באמצעות מספריים אופטלמולוגי באמצעות הרמת השימוש בנקודה העצבית. הסר את הדורה מחוט השדרה והפרד את ה-DRG מרקמת החיבור הבסיסית באמצעות הרמת השורש האחורי עד שהוא מגיע לחלק הסמוך של העצב. כך, לבודד את כל ההכנה של DRG עם עצב מוצמד.
3. לנקות את פני השטח של DRG.
   1. הסר בזהירות את שדור השדרה על המשטחים של L4-L6 DRG באמצעות מלקחיים תחת סטריאוסקופ בהגדלה 4x.
   2. מניחים את DRG עם עצב מוצמד בצינור זכוכית המכיל 1 מ ל של אנזימים מעורבים (0.2% פרוטטינוז ו 0.32% הקולגן) ו לעכל ב 37 באמבט מים ° c עבור 15 דקות (לנשוף מעט עם טפטפת פלסטיק במרווח של 5 דקות).
   3. הרם את הקצה של קו הקשר והעבר את ההכנה למנה המלאה בתמיסת מסחטות רגילה של המצלצל כדי לשטוף את האנזים. ואז להעביר את DRG מתעכל כדי מיכל (איור 1א) מלא של הצלצול של המצלצל חמצון הפתרון להקלטה.
4. הקלטת מושב
   1. להכין פתרון תאיים (ב mM: אשלגן אדל 120, kcl 18, mgcl₂ 2, אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-n, n, n '-חומצה טטראצטט [egta] 5, hepes 10, Na₂-ATP 5, Na-gtp 0.4, cacl₂ 1; pH 7.2 ו 300 mosm). שמור על 0 ° צ' עד לשימוש.
   2. ייצוב גרעינים באמצעות עוגן פרוסה ולחבר את סוף העצב לאלקטרודה ממריצה יניקה (איור 1א). המחש ובחר תא עצב DRG עם מטרה טבילה מים בהגדלה 40x.
   3. משוך אלקטרודה (הטבלה של חומרים) ולמלא אותו עם פתרון תאיים. הוסף אלקטרודה על המחזיק ולהחיל לחץ חיובי בפיפטה עם עמידות הסופי של 4-7 MΩ.
   4. הביאי את האלקטרודה קרוב לתא ותגעי בו. תן לחץ שלילי על הפיפטה, לאחר GΩ גושפנקה הגיע, להגדיר את הפוטנציאל הממברנה ב-60 mV ולאחר מכן להקים מצב הקלטה של כל תא.
   5. לספק גירויים חוזרים של 5-50 הרץ לעצב הגיד דרך אלקטרודות היניקה למסך עבור כשל הולכה. למדוד את משרעת של פוטנציאל היפרפולריזציה (AHP) מ בסיס לשיא, ואת 80% AHP המשך.
      הערה: ניתוח בכיוון אחד של סטיה (ANOVA; עבור יותר משתי קבוצות) או מבחן t של סטודנט (עבור שתי קבוצות בלבד) שימש לניתוח הנתונים. נתונים מוצגים כאמצעים ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM). רמת החשיבות הסטטיסטית הוגדרה ב-p < 0.05.
5. סיום הניסוי
   1. כאשר המשימה הניסיונית היא סיימה בזמן החולדות עדיין תחת מצב הרדמה, חולדות הם מורדמים באמצעות הזרקות תאיים של מנת יתר פנטוברביטל נתרן.

תוצאות

תוצאת פרוטוקול ההקלטה של סיבים בודדים תלויה באיכות של ניתוח הסיבים. החיה עבור ניסויים vivo חייב להיות במצב טוב כדי לשמור על גזע העצב בריא לניתוח קל (ראה עצה בסעיף הדיון). במקרים רבים יש צורך באמבטיית תרופות לאספקת סמים על סיבים. איור 1 ממחיש כיצד vivo ההקלטה בודדת סיבים הופעל (

Discussion

למרות המחקרים האחרונים השיגו סידן הדמיה של הנוירונים DRG ב vivo¹⁶, ביצוע vivo patch-קלאמפ הקלטה מ-drg בודדים הקלטת נשאר מאתגרת מאוד. לכן, גישה vivo סיב יחיד לשדה הכאב היא בעלת חשיבות מתמשכת. הקלטה של סיבים בודדים בפרוטוקול הנוכחי מאפשרת התבוננות אובייקטיבית של תופעת כישלון ההולכה, ואת השיל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia