التصور "ناصف العين العليا" خلال Embryogenesis ريريو دانيو

Kevin  H. Yoon; Sonya  A. Widen; Melissa  M. Wilson; Jennifer  C. Hocking; Andrew  J. Waskiewicz

doi:10.3791/59259

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

وهنا، فإننا نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة ناصف العين متفوقة، بنية حددت مؤخرا، وحفظت تقحم في عين الفقاريات. استخدام اليرقات الزرد، علينا أن نظهر التقنيات اللازمة لتحديد العوامل التي تسهم في تشكيل وإغلاق ناصف العين متفوقة.

Abstract

الثلامه العين الخلقية هو اضطراب وراثي هو عادة ما يحتفل فيه المشقوق في الجانب السفلي العين الناجمة عن الإغلاق الشق شرويد غير مكتملة. مؤخرا، تحديد هوية الأفراد مع الثلامه في الجانب متفوقة القزحية والشبكية، والعدسة التي أدت إلى اكتشاف بنية الرواية، يشار إلى الشق متفوقة أو متفوقة ناصف العين (SOS)، موجود عابر على الظهرية جانب كأس البصرية أثناء تطوير عين الفقاريات. على الرغم من أن هذا الهيكل هو حفظت عبر نيوت والأسماك، الفئران والفرخ، يقتصر فهمنا الحالي للاستغاثة. من أجل توضيح العوامل التي تسهم في تشكيل والإغلاق، يتحتم أن تكون قادرة على الاحتفال به وتحديد شذوذ، مثل التأخير في إقفال SOS. هنا، نحن المبينة لإنشاء مجموعة موحدة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها بكفاءة عن طريق الجمع بين تقنيات الفحص المجهري متاحة على نطاق واسع مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية المشتركة مثل تلطيخ إيمونوفلوريسسينت ومرناً تصور SOS أوفيريكسبريشن. بينما يركز هذا المجموعة من البروتوكولات على القدرة على مراقبة تأخير إغلاق SOS، هو يتكيف مع احتياجات المجرب ويمكن تعديلها بسهولة. وعموما، نأمل أن إنشاء أسلوب ودود من خلالها يمكن المتقدم فهمنا للاستغاثة توسيع المعارف الراهنة للتنمية عين الفقاريات.

Introduction

تشكيل العين الفقاريات هي عملية عالية مصانة التي تحدد أنواع الأنسجة مدبرة بعناية من مسارات الإشارات بين الخلايا وتحديد الهوية الإقليمية¹. الاضطرابات إلى أوائل العين morphogenesis ينتج عيوب عميقة على بنية العين، وهي التي كثيرا ما تسبب العمى². واحد مثل هذا المرض نتيجة لعدم إغلاق الشق العين تشورويد في الجانب البطني من كأس البصرية³. ويقدر هذا الاضطراب، المعروفة باسم الثلامه العين، تحدث في 1 من أصل 4-5000 مولود والسبب 3-11% من العمى طب الأطفال، يظهر عادة كبنية مثل ثقب المفتاح الذي يبرز إينفيريورلي من التلميذ في مركز العين⁴^، ⁵^،⁶. وظيفة الشق شرويد توفير نقطة انطلاق للمفرج المبكر المتزايد في كأس البصرية، بعد ذلك سوف الصمامات على جانبي الشق أن أرفق سفن⁷.

بينما كان معروفا الثلامه العين منذ العصور القديمة، لقد حددنا مجموعة فرعية جديدة من المرضى الثلامه مؤخرا مع فقدان الأنسجة التي تؤثر على الجانب الأعلى/الظهرية للعين. عمل مؤخرا في مختبر لدينا أدت إلى اكتشاف بنية العين بالعين الظهرية الزرد، والتي نشير إلى أنها متفوقة ناصف العين (SOS) أو شرخ متفوقة⁸. من المهم أن نلاحظ أن البنية خصائص ناصف والشق. شبيه ناصف، أنها طبقة نسيج مستمر الذي يمتد من الآنف أن الشبكية الزمانية. وباﻹضافة إلى ذلك، إغلاق الهيكل هو عدم توسط مزيجاً من اثنين يعارضان الغشاء، ويبدو أنها تتطلب عملية مورفوجينيتيك التي يسكنها الهيكل الخلايا. ومع ذلك، شبيه الشق، وأنها تشكل هيكل الذي يفصل بين جانبي الآنف والزمانية العين الظهرية مع الغشاء الطابق السفلي. للاتساق، سنشير إليها كاستغاثة في هذا النص.

SOS هو يحافظ تقحم عبر الفقاريات، يجري مرئية أثناء morphogenesis العين في الأسماك، والفرخ، نيوت، والماوس⁸. خلافا للشق شرويد، الذي موجود من 20-60 ساعة بعد الإخصاب (hpf) في الزرد، الغاية عابرة، يجري مرئية بسهولة من 20-23 هبف SOS وغائبة من 26 هبف⁸. قد وجدت البحوث التي أجريت مؤخرا في مختبر لدينا، مماثلة للشق choroid, SOS يلعب دوراً في توجيه الأوعية الدموية خلال العين morphogenesis⁸. على الرغم من أن العوامل التي تتحكم في تشكيل وإغلاق SOS لا يفهم تماما بعد من، سلطت الضوء على البيانات المتوفرة لدينا أدوار للعين الظهرية البطني الزخرفة الجينات⁸.

الزرد كائن حي نموذجا ممتازا لدراسة SOS. كنظام نموذجي، ويوفر عددا من المزايا في دراسة التنمية العين: نموذج فقاريات؛ كل جيل يسلك خصوبة عالية (~ 200 الأجنة)؛ أن الجينوم قد تم تماما متتابعة، مما يسهل التلاعب بالجينات؛ وحوالي 70% جينات البشرية أورثولوجوي الزرد واحد على الأقل، مما يجعل من نموذج مثالي المستندة إلى علم الوراثة من الأمراض البشرية⁹^،¹⁰. الأهم من ذلك، تنميته تأخذ مكان خارجياً للأم، ولها يرقات تتسم بالشفافية، مما يسمح لتصور العين النامية بسهولة نسبية¹¹.

في هذه المجموعة من البروتوكولات، يصف لنا التقنيات التي من خلالها يمكن تصور SOS في الزرد اليرقات. تسمح مجموعة متنوعة تقنيات التصوير المستخدمة في هذا التقرير الملاحظة واضحة للاستغاثة أثناء تطوير العين العادية، وكذلك القدرة على اكتشاف العيوب الإغلاق SOS. لدينا بروتوكولات المثال سوف تتميز بتحقيقات Gdf6، بمب المترجمة إلى الظهرية العين ومنظم المعروفة للإغلاق SOS. علاوة على ذلك، يمكن الجمع بين هذه التقنيات مع المعالجات التجريبية لتحديد العوامل الوراثية أو وكلاء الدوائية التي تؤثر على تشكيل SOS السليم والإغلاق. وباﻹضافة إلى ذلك، أدرجنا بروتوكول الممكن من خلالها التصوير الفلورسنت جميع أغشية الخلايا، السماح المجرب لمراقبة التغيرات المورفولوجية للخلايا المحيطة الاستغاثة. أن هدفنا هو إنشاء مجموعة من بروتوكولات موحدة يمكن استخدامها في جميع أنحاء المجتمع العلمي لتقديم رؤى جديدة في هذا الهيكل رواية العين النامية.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

1-البروتوكول 1: التصور للاستغاثة باستخدام ستيريوميكروسكوبي وتصوير التباين (DIC) التدخل التفاضلية

جمع الجنين
1. في خزان مياه الكلور، إعداد الصلبان من gdf6a^+/- الزرد في المساء بالاقتران من الزرد ذكور مع الزرد الإناث. يجب التأكد من فصل الذكور عن الإناث باستخدام مقسم إلى ضمان أن الأجنة يولدون داخل مجموعة صغيرة من الوقت.
2. في صباح اليوم التالي، سحب الفاصل وتسمح الزرد إلى تولد للم يعد من 30 دقيقة جمع الأجنة في أطباق بتري مع وسائل الإعلام E3، الموصوفة في¹²من كتاب الزرد، ووضعها في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
3. قم بإزالة أي البيض المخصبة أو أجنة ميتة، التي سوف تظهر بيضاء وغير شفاف.
إعداد وتصوير يعيش الأجنة الزرد
1. في 20 هبف، استبدال E3 وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام E3 تتضمن 0.004% 1-فينيل-2 ال (PTU) لمنع إنتاج الصباغ.
  ملاحظة: إضافة PTU في تيميبوينت لاحق قليلاً، مثل هبف 22-24، من غير المحتمل أن تتداخل مع هذه التجربة بسبب السن المبكرة للأجنة في وقت التصوير. ومع ذلك، من المستحسن لعلاج الأجنة المبكر لمنع تصبغ تماما كما أن هناك عصابة من التصبغ الذي يظهر في العين الظهرية، والتي يمكن أن تتداخل مع تصوير SOS.
2. ضمان أن جميع الأجنة في المراحل التنموية الصحيحة في مختلف النقاط المؤدية إلى الوقت للمراقبة. من المستحسن أن يتم ذلك على المراحل في سوميتي الذي رقم مرئية بوضوح كما حددها كيميل et al.¹³. قم بإزالة تلك التي غير ناضجة تنمويا.
3. وضع الأجنة تحت مجهر تشريح، وديتشوريوناتي الأجنة عن طريق سحب بلطف إلى جانب المشيمة استخدام الملقط غرامة. تصور SOS في العين الظهرية. قد تظهر SOS المسافة بادئة في الحافة الظهرية للعين، وينبغي أن يكون خط مرئي عبر العين الظهرية. لإغلاق SOS، العادية ومراقبة الأجنة في جميع أنحاء هبف 20-23. لفحص SOS تأخر الإغلاق تعمل، مراقبة الأجنة في 28 هبف أو في وقت لاحق.
4. فرز الأجنة تظهر تأخير إغلاق استغاثة من تلك التي لم تفعل ذلك.
5. لتصوير هذه الأجنة باستخدام مجهر تشريح، تحضير طبق بتري يحتوي على 1% [اغروس] في E3. وخز وسط [اغروس] لخلق ثقب ضحلة التي يمكن الجلوس صفار البيض للجنين عندما يتم وضع الجنين على [اغروس] إصابات طفيفة. وهذا سيضمن أن الجنين ليس بزاوية مائلة عندما يجري تصويرها.
6. تخدير الأجنة مع تريكايني 0.003% في E3 وأفقيا على [اغروس].
7. الصورة في الأجنة استخدام مجهر مركب أو [كنفوكل]، نقل الجنين إلى 35 ملم طبق بتري يحتوي على بولس صغيرة لعدم تبلور 1% ذوبان منخفضة نقطة [اغروس] في E3 (w/v). بسرعة وضع الجنين أفقياً باستخدام خط صيد غرامة أو جفن وانتظر [اغروس] لتبرد. مرة واحدة [اغروس] الراسخ، صب ما يكفي E3 في الطبق لتغطية [اغروس]. للحصول على مزيد من التفاصيل، انظر ديستيل و Köster¹⁴.
  ملاحظة: إذا كان استخدام مجهر مقلوب، الجنين يمكن وضعها ضد الزجاج صحن زجاج-ساترة-أسفل وتصويرها مع 20 قياسية X عدسة موضوعية.
8. استخدام عدسة هدف 20 x غمر مياه لتصور SOS مع مجهر المركب. بعد التصور، سحب [اغروس] من الأجنة بلطف وإصلاح في بارافورمالدهيد 4% (PFA) أو السماح بمواصلة تنميتها.

2-البروتوكول 2: الجامع-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين

الجامعة-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين: 1 يوم
1. ديتشوريوناتي الأجنة كما هو موضح في الخطوة 1.2.3، إذا لم تكن قد فعلت. إصلاح الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي في تيميبوينت المرجوة في تقدم طازجة 4% منهاج عمل بيجين ح 2 على شاكر درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية). أغسل في 1 x PBST لمدة 5 دقائق، أربع مرات.
  ملاحظة: بعد جاستروليشن، الأجنة قد حل أفضل بعد ديتشوريونيشن.
2. بيرميبيليزي الأجنة في بروتيناز 10 ملغ/مل ك في درجة حرارة الغرفة لوقت الحضانة 5 دقيقة سيتوقف على مرحلة النمو التي يتم إصلاحها في الأجنة (انظر ثيسي وثيسي¹⁵).
3. أغسل في 1 x PBST لمدة 5 دقائق، أربع مرات.
4. كتلة الأجنة في حل من 5% الماعز 2 مغ/مل والمصل البقري ألبومين المصل (BSA) في 1xPBST ح 1-2 على شاكر درجة حرارة الغرفة.
5. إعداد حل جسم الأولية بإذابة جسم الأرنب laminin المضادة في كتلة الحل في إضعاف 1: 200.
6. تبني الأجنة في جسم laminin مكافحة الأولية بين عشية وضحاها في شاكر 4 درجات مئوية.
الجامعة-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين: 2 يوم
1. أغسل في 1 x PBST لمدة 15 دقيقة، خمس مرات.
2. إعداد حل جسم الثانوية بتمييع الماعز الأرنب المضادة الأجسام المضادة أليكسا فلور 488 في 1 x PBST إلى إضعاف 1: 1000.
  ملاحظة: من الممكن للتكيف مع هذه الخطوة التي تتناسب مع الموارد المتاحة المجرب باستخدام جسم ثانوية مختلفة.
3. تبني الأجنة في جسم الثانوي بين عشية وضحاها في شاكر 4 درجات مئوية. درع من الضوء قدر الإمكان من هذه الخطوة فصاعدا.
4. أغسل في 1 x PBST لمدة 15 دقيقة، أربع مرات. ويمكن تخزين الأجنة عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، إذا لزم الأمر.
تشريح وتركيب عيون الجنينية
1. إذا رغبت في ذلك، بوضع الأجنة في طبق بتري صغيرة وديلك الأجنة في 1 x PBST. القيام بذلك بتعطيل الصفار مع الملقط غرامة بلطف وإزالة الخلايا صفار البيض من خلال إلغاء معتدل من كيس ألمح.
2. تحضير التركيزات التالية من برنامج تلفزيوني والغليسيرول سلسلة الحلول في أنابيب ميكروسينتريفوجي: والغليسيرول 30%، 50% و 70% في برنامج تلفزيوني. نقل الأجنة إلى 30% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني، مع التأكد من وضع الأجنة على رأس الحل ونقل القليل من الحل السابق قدر الإمكان. الانتظار للأجنة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
3. عند الأجنة قد غرقت إلى الأسفل، نقلها إلى 50% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني. تكرار ونقل إلى 70% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني.
4. وبمجرد الأجنة قد غرقت في 70% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني، نقلها إلى طبق بلاستيكية صغيرة لتشريح.
5. قطع الجنين الخلفي إلى هيندبرين، واستخدام الأنسجة الخلفي للتنميط، إذا لزم الأمر.
6. نقل الرأس إلى شريحة زجاجية، نقل والغليسيرول قليلة قدر الإمكان. استخدام الملقط أو غيرها من أدوات تشريح غرامة للتمسك بالنهاية الخلفية لإبقاء رأسه ثابتة. استخدام pin مينوتين غرامة أو أدوات تشريح غرامة أخرى لإدراج في البطين فوريبراين من الأمامية برفق ودفع إلى الأسفل لفصل النصفين الأيمن والأيسر من الرأس من بعضها البعض. كرر هذا الإجراء أثناء نقل جيدة من خلال midbrain وفي البطين هيندبرين، أساسا فيليتينج الرأس إلى أسفل خط الوسط. وهذا يقلل من التلاعب اليدوي للعين والأنسجة المحيطة بها، مما يترك SOS غير التالفة.
7. يتصاعد كل من جانبي خط الوسط الرأس إلى أسفل العين. موقف أربعة وظائف للشحوم فراغ في الزوايا (مناسبة مسافة وبصرف النظر عن ساترة المستخدمة) وتغطية مع ساترة زجاجية، دفع أسفل التسلسل في كل وظيفة حتى ساترة يجعل الاتصال مع العينات. "الماصة؛" والغليسيرول 70% على حافة ساترة حيث أن يتم سحبها في والغليسيرول تحتها، ملء الفضاء بين ساترة والشريحة.
8. الصور عينات خلال يوم واحد، أو ختم حول ساترة مع طلاء الأظافر وعينات صورة إلا بعد طلاء الأظافر قد جفت. تخزين في الظلام في 4 درجات مئوية.

3-بروتوكول 3: التصور استخدام SOS اجفب كا مرناً

توليف مرناً اجفب-كاكس
1. لينيريزي 1 ملغ من pCS2-اجفب-كا بلازميد¹⁶ مع نوتي في حجم رد فعل من 40 مل لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية.
2. للتوقف عن رد فعل خلاصة القيد، إضافة 10 مل رناسي خالية من الماء، 2.5 مل 10% الحزب الديمقراطي الصربي ومل 2.0 10 ملغ/مل بروتيناز ك.
3. احتضان 1 ساعة في 50 درجة مئوية.
4. يضاف ما يلي إلى رد فعل (إجمالي حجم 200 مل) والمضي قدما إلى الخطوة التالية: 50 مل رناسي خالية من الماء، 20 مل م 3 الصوديوم خلات pH 5.2 و 75.5 مل رناسي خالية من الماء
  ملاحظة: يتم إضافة المياه خالية من رناسي في مناسبتين منفصلتين للحيلولة دون إضعاف المفرط من خلات الصوديوم.
تنقية الحمض النووي من خلال هطول الأمطار، واستخراج الإيثانول الفينول/كلوروفورم
1. إضافة 200 مل الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول ودوامه لفصل س. 20 في مراحل مائي والعضوية عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 5 دقائق.
2. نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، مع التأكد من تجنب نقل الطبقة السفلي العضوية. إضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم للأنبوب الجديد.
  ملاحظة: إضافة كلوروفورم اختياري، ولكن من المستحسن لضمان الإزالة الكاملة للفينول من العينة.
3. دوامة لفصل س. 20 في مراحل مائي والعضوية عن طريق استخدام الطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 5 دقائق.
4. كما كان من قبل، نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، مع التأكد من تجنب نقل الطبقة السفلي العضوية.
5. إضافة حجم 1/10 م 3 خلات الصوديوم pH 5.2.
6. يعجل بالحمض النووي بإضافة 3 مجلدات من الإيثانول رناسي خالية 100 ٪ والبرد في-20 درجة مئوية ل 15 دقيقة للطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه يجب أن تكون مرئية. صب المادة طافية.
7. أغسل بيليه مع 100 مل ماء البارد خالية من الإيثانول/رناسي 70%. وبعد الاختلاط برفق كسر بيليه فضفاضة، الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه يجب أن تكون مرئية. صب المادة طافية.
8. أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في الحمض النووي في 7 مل من الماء.
  ملاحظة: قد يلزم بيليه أن تجفف لمدة أطول من 5 دقائق اعتماداً على تدفق الهواء المتوفرة.
النسخ وتنقية مرناً اجفب كا
1. بطريقة خالية من رناسي، إعداد فعل نسخ في المختبر مع مجموعة بوليميراز الرنا Sp6 متاحة تجارياً، استخدام حوالي 1 ملغ بلازميد خطية تنقية الحمض النووي التي تم الحصول عليها في "الخطوة 3-2". احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
  ملاحظة: يجب استخدام Sp6 بوليميريز الحمض النووي الريبي لإنتاج توج مرناً.
2. أضف 1 مل الدناز (يو 2/مل؛ رناسي الحرة) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. تنقية مرناً مع أي مواد تنقية الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياً. قاسمة مرناً لتجنب تجميد أذاب المتكررة، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
حقن والتصور
1. الحصول على الأجنة كما ورد في "البروتوكول 1-1".
2. استخدام جهاز microinjection، حقن 300 خريج من اجفب كا مرناً في المرحلة 1-الخلية.
3. الشاشة للأجنة مع تعبير مشرق من اجفب في أعين استخدام ستيريوسكوبي الأسفار.
4. صورة الأجنة كما هو موضح في 1.2 بروتوكول.
5. وبدلاً من ذلك، ديتشوريوناتي وإصلاح الأجنة في تيميبوينت المرجوة في 4% منهاج العمل لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل الأجنة في 1 × ببست لمدة 5 دقائق، أربع مرات، وديتشوريوناتي، إذا لم تكن قد فعلت. تشريح العيون وجبل لهم على الشرائح كما هو موضح في 2.3 البروتوكول.

النتائج

يظهر الزرد SOS في 20 هبف في الشبكية الظهرية الظني⁸. طريق التحولات هبف SOS 23 من بنيتها الضيقة الأولى إلى المسافة بادئة واسعة و 26 هبف أنها لم تعد مرئية⁸. ولذلك، يجب دراسة SOS أثناء تطوير العين الزرد العادية، التقيد بالأجنة بين 20-23 هبف. وخلال هذه الفترة، هو ...

Discussion

وهنا، نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة SOS في الجنين النامي الزرد. لتحديد تعمل تأخير الإغلاق، ولدينا بروتوكولات ركزت على القدرة على التمييز بين فصل الفصوص منفصلة اثنين من الجانبين الظهرية الآنف والظهريه الزمانية العين، مماثلة للتقنيات المستخدمة لتصور تأخير إغلاق الشق شرويد تعم?...

Disclosures

الكتاب قد لا المصالح المتضاربة تعلن.

Acknowledgements

كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) والبرتا يبتكر التكنولوجيا المستقبلية، والمرأة ومعهد أبحاث صحة (وتشري الطفل).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017

References

Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 BMP

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: