Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Riepilogo

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.

Abstract

Coloboma oculare congenita è una malattia genetica che si osserva tipicamente come una fenditura nella funzione inferiore dell'occhio derivanti dalla chiusura della fenditura coroidico incompleta. Recentemente, l'identificazione degli individui con il coloboma in funzione superiore dell'iride, retina e lente ha portato alla scoperta di una nuova struttura, indicato come la fenditura superiore o superiore del solco oculare (SOS), che è transitoriamente presente sulla dorsale aspetto della Coppa ottica durante lo sviluppo dell'occhio dei vertebrati. Anche se questa struttura è conservata in topi, pulcino, pesce e newt, nostra attuale comprensione di SOS è limitato. Per chiarire i fattori che contribuiscono alla sua formazione e chiusura, è indispensabile essere in grado di osservare e identificare le anomalie, quali ritardo nella chiusura di SOS. Qui, abbiamo deciso di creare una serie standardizzata dei protocolli che può essere utilizzato per visualizzare in modo efficiente il SOS combinando tecniche di microscopia ampiamente disponibili con comuni tecniche di biologia molecolare come macchiatura immunofluorescente e mRNA sovraespressione. Mentre questo set di protocolli si concentra sulla capacità di osservare ritardo chiusura SOS, è adattabile alle esigenze dello sperimentatore e possono essere facilmente modificato. Nel complesso, ci auguriamo di creare un metodo accessibile attraverso il quale la nostra comprensione di SOS può essere avanzato per espandere le conoscenze attuali di sviluppo dell'occhio dei vertebrati.

Introduzione

La formazione dell'occhio dei vertebrati è un processo altamente conservato in cui vie di segnalazione intercellulare attentamente orchestrate stabilire i tipi di tessuto e specifica identità regionale¹. Perturbazioni alla morfogenesi occhio presto causare difetti profondi all'architettura dell'occhio e sono frequentemente accecante². Una tale malattia deriva dall'impossibilità di chiudere la fessura oculare coroidico nella parte ventrale della Coppa ottica³. Questo disturbo, noto come coloboma oculare, è stimato in 1 su 4-5000 nati vivi e causa 3-11% di cecità pediatrica, che si manifesta comunemente come una buco della serratura-come la struttura che sporge inferiorly dalla pupilla al centro dell'occhio^{4, 5,6}. La funzione della fenditura coroidico è di fornire un punto di ingresso per primi sistema vascolare in crescita nella tazza ottica, dopo di che i lati della fenditura fonderanno per racchiudere le navi⁷.

Mentre coloboma oculare è stata conosciuta fin dai tempi antichi, recentemente abbiamo identificato un sottogruppo romanzo di coloboma pazienti con perdita di tessuto che interessano la funzione superior/dorsale dell'occhio. Lavoro recente nel nostro laboratorio ha portato alla scoperta di una struttura oculare nell'occhio dorsale di zebrafish, che noi definiamo il solco superiore oculare (SOS) o fenditura superiore⁸. È importante notare che la struttura ha le caratteristiche di un solco e di una fessura. Simile a un solco, è uno strato di tessuto continuo che si estende dal nasale alla retina temporale. Inoltre, la chiusura della struttura non è mediata da una fusione tra i due opposti della membrana dello scantinato, e sembra che richiedono un processo morfogenetico da cui la struttura è popolata dalle cellule. Tuttavia, simile a una fenditura, forma una struttura che separa il lato nasale e temporale dell'occhio dorsale con la membrana dello scantinato. Per coerenza, si farà riferimento ad esso come SOS in questo testo.

Il SOS è evolutivamente conservato in vertebrati, essendo visibile durante la morfogenesi di occhio di pesce, pulcino, newt e mouse⁸. In contrasto con la fenditura coroidico, che è presente da 20-60 ore post-fertilizzazione (hpf) in zebrafish, il SOS è altamente temporaneo, essendo facilmente visibile da 20-23 hpf e assente da 26 hpf⁸. Recenti ricerche nel nostro laboratorio ha trovato che, simile alla fenditura coroidico, il SOS svolge un ruolo nell'orientamento vascolare durante occhio morfogenesi⁸. Anche se i fattori che controllano la formazione e la chiusura di SOS ancora completamente non sono capiti, i nostri dati ha fatto evidenziare ruoli per dorso-ventrale occhio patterning geni⁸.

Zebrafish è un organismo modello eccellente per studiare il SOS. Come sistema modello, fornisce una serie di vantaggi a studiare lo sviluppo dell'occhio: si tratta di un modello di vertebrati; ogni generazione esibisce alta fecondità (~ 200 embrioni); il suo genoma è stato completamente sequenziato, che facilita la manipolazione genetica; e circa il 70% dei geni umani hanno almeno un ortologo di zebrafish, rendendolo un ideale modello basato su genetica di malattia umana^9,10. La cosa più importante, lo sviluppo avviene esternamente alla madre, e le sue larve sono trasparenti, che consente la visualizzazione dell'occhio in via di sviluppo con relativa facilit๹.

In questa serie di protocolli, descriviamo le tecniche attraverso le quali il SOS possono essere visualizzati nelle larve di zebrafish. La varietà di tecniche di visualizzazione utilizzati in questo report vi permetterà chiara osservazione di SOS durante lo sviluppo normale dell'occhio, così come la capacità di rilevare difetti di chiusura SOS. I nostri protocolli di esempio saranno caratterizzato da indagini di Gdf6, un BMP localizzate alla dorsale occhio e noto regolatore di chiusura SOS. Ulteriormente, queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la chiusura e la corretta formazione di SOS. Inoltre, abbiamo incluso un protocollo attraverso il quale è possibile, l'imaging fluorescente di tutte le membrane cellulari permettendo lo sperimentatore ad osservare i cambiamenti morfologici per le celle circostanti il SOS. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un insieme di protocolli standardizzati che può essere utilizzato in tutta la comunità scientifica per offrire nuove prospettive in questo romanzo struttura dell'occhio in via di sviluppo.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Alberta Animal Care e Comitato di uso.

1. protocollo 1: Visualizzazione di SOS utilizzando stereomicroscopia e imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza

1. Raccolta degli embrioni
   1. In un serbatoio di acqua declorurata, preparare croci di zebrafish gdf6a^{+ /-} nella sera, abbinando un zebrafish maschio con una femmina zebrafish. Assicurarsi di separare il maschio dalla femmina con un divisore per garantire che gli embrioni sono nato in un piccolo intervallo di tempo.
   2. La mattina seguente, tirare il divisore e consentire il danio zebrato ad allevare per non più di 30 min. raccogliere gli embrioni in capsule di Petri con E3 media, descritto in The Zebrafish libro¹²e metterli in un'incubatrice di 28,5 ° C.
   3. Rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti, che appariranno bianco e opaco.
2. Preparazione e live-imaging di embrioni di zebrafish
   1. Alle 20 hpf, Sostituisci l'E3 media con E3 media contenente 0,004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la produzione di pigmento.
      Nota: Aggiunta di PTU ad un determinato timepoint leggermente più tardi, ad esempio hpf 22-24, è improbabile che interferiscono con l'esperimento a causa dell'età precoce degli embrioni al momento di formazione immagine. Tuttavia, si consiglia di trattare gli embrioni presto per prevenire completamente la pigmentazione come c'è una banda di pigmentazione che appare nell'occhio dorsale, che può interferire con l'imaging di SOS.
   2. Assicurarsi che tutti gli embrioni siano corrette fasi di sviluppo in vari punti che conducono al momento dell'osservazione. È consigliabile che ciò avvenga nelle fasi alle quali somite numero è chiaramente visibile come delineato da Kimmel et al.¹³. Rimuovere quelli che sono evolutivamente immaturo.
   3. Posizionare gli embrioni sotto un microscopio per dissezione e dechorionate gli embrioni tirando delicatamente il corion utilizzando una pinzetta. Visualizzare il SOS nell'occhio dorsale. Il SOS può apparire come un rientro al margine dorsale dell'occhio, e una linea deve essere visibile attraverso l'occhio dorsale. Per la normale chiusura di SOS, osservare gli embrioni a intorno a 20-23 hpf. Per l'esame dei fenotipi di chiusura ritardati SOS, osservare gli embrioni a 28 hpf o versione successiva.
   4. Ordinare gli embrioni che mostrano ritardo chiusura SOS da quelli che non lo fanno.
   5. Per fotografare questi embrioni utilizzando un microscopio per dissezione, preparare una piastra Petri contenente 1% di agarosio in E3. Pungere leggermente il centro di agarosio per creare un buco poco profondo in cui il tuorlo dell'embrione può sedersi quando l'embrione viene collocato su agarosio. Questo assicurerà che l'embrione non è in un angolo obliquo, quando essere fotografati.
   6. Anestetizzare gli embrioni con tricaina 0,003% in E3 e posto lateralmente su agarosio.
   7. Per realizzare l'immagine gli embrioni utilizzando un microscopio confocale o composto, trasferire l'embrione in 35mm di Petri contenente un piccolo bolo di non gelificato basso punto di fusione punto agarosio all'1% in E3 (w/v). Posizionare l'embrione lateralmente usando una linea di pesca bene o un ciglio e attendere l'agarosio raffreddare rapidamente. Una volta che l'agarosio è ferma, versare abbastanza E3 il piatto per coprire l'agarosio. Per ulteriori dettagli, vedere Distel e Köster¹⁴.
      Nota: Se si usa un microscopio invertito, l'embrione possa essere collocata contro il vetro di un piatto fondo-vetrino coprioggetto in vetro e imaged con un standard 20x lente obiettiva.
   8. Utilizzare un obiettivo di acqua immersione 20 x per visualizzare il SOS con un microscopio composto. Dopo la visualizzazione, delicatamente tirare l'agarosio da embrioni e difficoltà in paraformaldeide al 4% (PFA) o consentono di continuare il loro sviluppo.

2. il protocollo 2: Intero-monta macchiatura immunofluorescente della laminina

1. Intero-monta macchiatura immunofluorescente di laminina: giorno 1
   1. Dechorionate embrioni come descritto al punto 1.2.3, se non già fatto. Difficoltà embrioni in un tubo del microcentrifuge a timepoint desiderata in appena fatte 4% PFA per 2 h su un agitatore di temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavare in 1 x PBST per 5 min, quattro volte.
      Nota: A seguito di gastrulazione, gli embrioni possono fissare meglio dopo dechorionation.
   2. Permeabilize embrioni in proteinasi di 10mg/mL K a temperatura ambiente per 5 minuti tempo di incubazione dipenderà molto lo stadio di sviluppo in cui gli embrioni sono fissi (vedere Immobilier e Immobilier¹⁵).
   3. Lavare in 1 x PBST per 5 min, quattro volte.
   4. Bloccare gli embrioni in una soluzione di 5% capra 2 mg/mL e del siero albumina di siero bovino (BSA) in 1xPBST per 1-2 h su un agitatore di temperatura ambiente.
   5. Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo anticorpo di coniglio anti-laminina nella soluzione di blocco ad una diluizione di 1: 200.
   6. Incubare gli embrioni in anticorpo primario anti-laminina durante la notte su un agitatore di 4 ° C.
2. Intero-monta macchiatura immunofluorescente di laminina: giorno 2
   1. Lavare in 1 x PBST per 15 min, cinque volte.
   2. Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo anticorpo di capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 in 1 x PBST a una diluizione di 1: 1000.
      Nota: È possibile adattare questo passaggio per soddisfare le risorse disponibili allo sperimentatore utilizzando un anticorpo secondario diverso.
   3. Incubare gli embrioni in anticorpo secondario durante la notte su un agitatore di 4 ° C. Proteggere dalla luce quanto più possibile da questo punto in poi.
   4. Lavare in 1 x PBST per 15 minuti, quattro volte. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C per fino ad una settimana, se necessario.
3. Dissezione e montaggio degli occhi embrionali
   1. Se lo si desidera, posizionare gli embrioni in un piccolo piatto di Petri e deyolk gli embrioni in 1 x PBST. Eseguire questa operazione delicatamente interrompere il tuorlo con una pinzetta e rimuovendo le cellule di tuorlo attraverso raschiatura mite del sacco vitellino.
   2. Preparare le seguenti concentrazioni di soluzioni di serie di PBS-glicerolo in microcentrifuga: glicerolo 30%, 50% e 70% in PBS. Trasferire gli embrioni in 30% glicerolo/PBS, assicurandosi di posizionare gli embrioni in cima la soluzione e il trasferimento come poco delle precedenti soluzioni possibili. Attendere che gli embrioni ad affondare verso il basso del tubo.
   3. Quando gli embrioni hanno affondato alla parte inferiore, è possibile trasferirli al 50% glicerolo/PBS. Ripetere e trasferire al 70% glicerolo/PBS.
   4. Una volta che gli embrioni hanno affondato nel 70% glicerolo/PBS, spostarli in un piccolo piatto di plastica per le dissezioni.
   5. Recidere l'embrione posteriore del hindbrain e utilizzare il tessuto posteriore di genotipizzazione, se necessario.
   6. Spostare la testina di un vetrino, trasferimento come glicerolo piccolo come possibile. Utilizzare pinze o altri strumenti di dissezione bene a trattenere l'estremità posteriore per mantenere ferma la testa. Utilizzare un pin di minutien bene o altri strumenti di dissezione bene delicatamente inserire nel ventricolo del forebrain da anteriore e spingere verso il basso per separare le due metà destra e sinistra della testa da altro. Ripetere questa operazione mentre si muove posteriormente attraverso il mesencefalo e nel ventricolo hindbrain, essenzialmente fileting la testa in giù la linea mediana. Questo riduce al minimo la manipolazione manuale dell'occhio e del tessuto circostante, lasciando intatto il SOS.
   7. Montare ogni lato della linea mediana testa giù, occhio fino. Posizione di quattro post di grasso per vuoto agli angoli (una distanza appropriata parte per il coprioggetto utilizzato) e coprire con un vetrino coprioggetti, spingendo verso il basso in modo sequenziale su ogni post fino a quando il vetrino coprioggetto entra in contatto con i campioni. Pipettare 70% glicerolo al bordo del coprivetrino affinché il glicerolo è tirato sotto, riempiendo lo spazio tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo.
   8. Esempi di immagine all'interno di un giorno, o guarnizione intorno il coprioggetto con smalto e campioni di immagine solo dopo che lo smalto si è asciugato. Conservare al buio a 4 ° C.

3. protocollo n. 3: Visualizzazione di SOS utilizzando eGFP-CAAX mRNA

1. Sintesi del mRNA di eGFP-CAAX
   1. Linearizzare 1 mg di plasmidi pCS2-eGFP-CAAX¹⁶ con NotI in un volume di reazione di 40 mL per 4 ore a 37 ° C.
   2. Per interrompere la reazione di digest di restrizione, aggiungere 10 mL RNAsi-libera di acqua, 2,5 mL 10% SDS e 2,0 mL 10 mg/mL proteinasi K.
   3. Incubare per 1 ora a 50 ° C.
   4. Aggiungere quanto segue alla reazione (volume totale 200 mL) e procedere al passo successivo: 50 mL RNAsi-libera di acqua, acqua di 20ml 3M sodio acetato pH 5.2 e 75,5 mL RNAsi-libera
      Nota: Viene aggiunta acqua RNAsi-libera in due diverse occasioni per prevenire eccessiva diluizione dell'acetato di sodio.
2. Purificazione di DNA attraverso la precipitazione di estrazione ed etanolo fenolo/cloroformio
   1. Aggiungere 200 mL fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e vortexare per 20 s. separato le fasi acquose e organiche attraverso centrifugazione a 18.000 x g per 5 min.
   2. Trasferire lo strato acquoso superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge, avendo cura di evitare il trasferimento dello strato organico inferiore. Aggiungere un volume equivalente di cloroformio al nuovo tubo.
      Nota: Aggiunta di cloroformio è facoltativa, ma è consigliabile per garantire la completa rimozione del fenolo dal campione.
   3. Vortice per 20 s. separato le fasi acquose e organiche attraverso centrifugazione a 18.000 x g per 5 min.
   4. Come prima, è possibile trasferire lo strato acquoso superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge, avendo cura di evitare il trasferimento dello strato organico inferiore.
   5. Aggiungere 1/10 di volume di 3 M sodio acetato a pH 5.2.
   6. Precipitare del DNA con l'aggiunta di 3 volumi di etanolo al 100% privo di RNAsi e freddo a-20 ° C per 15 min. centrifuga a 18.000 x g per 20 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe essere visibile. Decantare il supernatante.
   7. Lavare la pallina con 100 mL di acqua fredda di etanolo/RNAsi-libera di 70%. Dopo aver mescolato delicatamente per rompere il pellet sciolto, centrifugare a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe essere visibile. Decantare il supernatante.
   8. Asciugare il pellet per 5 min e risospendere il DNA in 7 mL di acqua.
      Nota: Il pellet potrebbe essere necessario essere essiccato per più di 5 min a seconda del flusso d'aria disponibile.
3. Trascrizione e purificazione di eGFP-CAAX mRNA
   1. In un modo privo di RNasi, preparare una reazione di trascrizione in vitro con un kit disponibile in commercio di polimerasi Sp6 RNA, utilizzando circa 1 mg di plasmide linearizzato purificato il DNA ottenuto nel passo 3.2. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
      Nota: Sp6 RNA polimerasi deve essere utilizzata per la produzione di mRNA innevate.
   2. Aggiungere 1 mL di dnasi (2 U/mL; RNAsi libera) e incubare per 30 min a 37 ° C.
   3. Purificare il mRNA con qualsiasi kit di purificazione RNA disponibile in commercio. Aliquota del mRNA per evitare ripetuti di congelamento-scongelamento e conservare a-80 ° C.
4. Iniezione e visualizzazione
   1. Ottenere gli embrioni come delineato nel protocollo 1.1.
   2. Utilizzando un apparato di microiniezione, iniettare 300 pg di eGFP-CAAX mRNA nella fase 1-cell.
   3. Schermo per gli embrioni con la brillante espressione di eGFP negli occhi utilizzando uno stereoscopio di fluorescenza.
   4. Immagine, gli embrioni come descritto nel protocollo 1.2.
   5. In alternativa, dechorionate e fissare gli embrioni al timepoint desiderata nel 4% PFA per 4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4° C. Lavare gli embrioni in 1x PBST per 5 min, quattro volte e dechorionate, se non precedentemente fatto. Sezionare gli occhi e montarli sulle diapositive come descritto nel protocollo 2.3.

Risultati

Zebrafish SOS appare alle 20 hpf nella retina dorsale presuntiva⁸. Da 23 hpf SOS transizioni dalla sua architettura stretta iniziale a una vasta rientranza e da 26 hpf non è più visibile⁸. Pertanto, per esaminare il SOS durante lo sviluppo dell'occhio di zebrafish normale, gli embrioni devono essere osservati fra hpf 20-23. Durante questo periodo, il SOS è osservabile attraverso il microscopio per dissezione e tramite immagini DIC come un...

Discussione

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il SOS nell'embrione di zebrafish sviluppo. Per determinare fenotipi di ritardo di chiusura, i nostri protocolli sono concentrati sulla capacità di distinguere la separazione dei due lobi discreti del lato dorsale-nasale e dorsale-temporale dell'occhio, simile a tecniche utilizzate per visualizzare ritardo chiusura coroidico fenditura fenotipi nell'occhio ventrale.

Queste tecniche di visualizzazione possono essere utilizza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017