Визуализация глазной борозды Superior во время эмбриогенеза данио рерио

Резюме

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов для наблюдения за Улучшенный глазной борозды, недавно выявленных, эволюционно сохраняется структура в позвоночных глаз. С помощью данио рерио личинки, мы демонстрируем методов, необходимых для выявления факторов, влияющих на формирование и закрытие Улучшенный глазной борозды.

Аннотация

Врожденная колобома глазной это генетическое нарушение, которое обычно наблюдается как расщелина в нижней аспект глаза результате неполной сосудистое трещина закрытия. Недавно выявление лиц с колобома в Улучшенный аспекте Ирис, сетчатке и объектив, привели к открытию новой структуры, называется Улучшенный трещина или Улучшенный глазной борозды (SOS), который временно присутствует на дорсальной аспект глазного бокала во время развития позвоночных глаз. Хотя эта структура сохраняется через мышей, цыпленок, рыбы и Тритон, нашего нынешнего понимания особенностей SOS ограничен. Для того, чтобы разъяснить факторы влияющие на его формирование и закрытия, крайне важно, чтобы иметь возможность наблюдать это и выявления аномалий, таких, как задержки в закрытии SOS. Здесь мы намереваемся создать серию стандартизированных протоколов, которые могут быть использованы эффективно визуализировать SOS путем объединения методов широко доступны микроскопии с общие методы молекулярной биологии как immunofluorescent окрашивание и мРНК Гиперэкспрессия. Хотя этот набор протоколов фокусируется на способность наблюдать за задержку закрытия SOS, он адаптируется к потребностям экспериментатора и могут быть легко изменены. В целом мы надеемся создать доступный метод, через который наше понимание SOS можно дополнительно расширить текущий набор знаний развития позвоночных глаз.

Введение

Формирование позвоночных глаз является весьма сохранены процесс в котором тщательно спланированных межклеточной сигнализации пути установить типы тканей и указать региональной идентичности¹. Возмущений в начале глаз морфогенеза приводят к глубокие дефекты в архитектуре глаза и часто слепоте². Один из таких заболеваний результаты от неспособности закрыть сосудистое глазной щели в брюшной части глазного бокала³. Это расстройство, известный как глазные колобома, оценивается в 1 из 4-5000 живорожденных и причиной детской слепоты, часто проявляется как замочной скважины как структура, которая выступала книзу от ученика в центре глаза^{4, 3-11% 5,6}. Функцию сосудистого трещина является предоставляют точку входа для раннего сосудистую, врастают в глазного бокала, после чего стороны трещины будет предохранитель подложить судов⁷.

В то время как глазные колобома был известен с древних времен, мы определили недавно подмножество Роман колобома пациентов с потерей ткани, затрагивающих Улучшенный/спинной части глаза. Последние работы в нашей лаборатории привела к открытию глазной структуры в спинной глаза данио рерио, который мы называем Улучшенный глазной борозды (SOS) или Улучшенный трещина⁸. Важно отметить, что структура имеет характеристики борозды и фиссур. Подобно борозды, это постоянное ткани слой, который охватывает от носа до височной сетчатки. Кроме того закрытие структуры не опосредовано слияние двух противоположных базальной мембраны, и она, как представляется, требуют морфогенетических процесс, в котором структура заполняется клетками. Однако подобно трещина, он образует структуру, которая отделяет носовой и височной стороны спинной глаз с базальной мембраны. Для обеспечения согласованности мы будет ссылаться на него как SOS в этом тексте.

SOS эволюционно сохраняется через позвоночных, будучи видимыми в ходе морфогенеза глаз рыбы, куриных, Тритон и мыши⁸. В отличие от сосудистое трещина, которая присутствует от 20-60 часов после оплодотворения (hpf) в данио рерио, SOS весьма преходящими, будучи легко видны с 20-23 hpf и отсутствует 26 hpf⁸. Недавние исследования в нашей лаборатории обнаружил, что, подобно сосудистое трещина, SOS играет роль в сосудистой руководство во время глаз морфогенеза⁸. Хотя факторы, определяющие формирование и закрытие SOS еще полностью не поняты, наши данные выделить ролей для глаз спинной вентральный кучность генов⁸.

Данио рерио — организм отличную модель для изучения SOS. Как модель системы, он обеспечивает ряд преимуществ при изучении глаз развития: это позвоночных модель; Каждое поколение проявляет высокую плодовитость (~ 200 эмбрионов); полностью виртуализированных его генома, который облегчает генетические манипуляции; и примерно 70% генов человека имеют по крайней мере один orthologue данио рерио, что делает его идеальным модель на основе генетики человека болезни^9,10. Самое главное ее развитие происходит извне для матери, и его личинки являются прозрачными, что позволяет для визуализации развивающихся глаза с относительной легкостью¹¹.

В этом наборе протоколов мы описываем методы, через которые SOS могут быть визуализированы в zebrafish личинки. Разнообразие методов визуализации, используемые в настоящем докладе позволит четкое наблюдение SOS во время разработки нормальный глаз, а также способность обнаруживать SOS закрытия дефектов. Наш пример протоколы будут представлены исследования Gdf6, BMP локализованные в спинной глаз и известных регулятор SOS закрытия. Кроме того эти методы могут быть объединены с экспериментальных манипуляций для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на формирование надлежащего SOS и закрытия. Кроме того мы включили протокол, посредством которого возможна флуоресцентных изображений всех клеточных мембран, позволяя экспериментатор соблюдать морфологические изменения клеток, окружающих SOS. Наша цель – создать набор стандартизованных протоколов, которые могут использоваться на протяжении всего научного сообщества предложить новые идеи в этот роман структуры развивающихся глаза.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены в университете Альберта животное уход и использование Комитета.

1. Протокол 1: Визуализация SOS, используя стереомикроскопия и дифференциальной помехи изображения контрастность (DIC)

1. Эмбрион коллекция
   1. В баке дехлорируемым воды Подготовьте кресты gdf6a^{+ /} данио рерио вечером, задавая мужчины данио рерио с женской данио рерио. Убедитесь в том отделить мужчин от женского, используя разделитель для обеспечения что эмбрионы рождаются в пределах небольшой диапазон времени.
   2. Следующим утром, потяните делителя и позволяют данио рерио породы для больше чем 30 мин собирать эмбрионов в чашках Петри с E3 медиа, описанные в данио рерио книга¹²и поместите их в инкубаторе 28,5 ° C.
   3. Удалите все неоплодотворенных яиц или мертвых эмбрионов, которые появятся белые и непрозрачным.
2. Подготовка и жить изображений zebrafish эмбриона
   1. 20 hpf, заменить E3 медиа с E3 медиа, содержащие 0,004% 1-фенил 2-тиомочевины (PTU) для предотвращения производства пигмента.
      Примечание: Добавление ПТУ на чуть позже timepoint, таких как hpf 22-24, вряд ли мешать эксперимент из-за раннего возраста эмбрионов во время визуализации. Однако рекомендуется для лечения эмбрионы рано полностью предотвратить пигментации, как есть полоса пигментация, которая появляется в спинной глаза, что может помешать с изображениями SOS.
   2. Убедитесь, что все эмбрионы находятся в правильных этапы развития в различных точках, вплоть до времени наблюдения. Рекомендуется, чтобы это было сделано на этапах, на котором Сомит номер хорошо видна как говорится Kimmel et al.¹³. Удалите эти, которые развивающих незрелые.
   3. Место эмбрионов под микроскопом рассечения, и dechorionate эмбрионы, осторожно потянув друг от друга с помощью Хорион изысканные щипцами. Визуализируйте SOS в спинной глаз. SOS может появиться как отступ на спинной маржа глаза, и линия должна быть видна через спинной глаз. Для нормальной SOS закрытия, наблюдать эмбрионов в окрестностях hpf 20-23. Для проверки задержки SOS закрытие фенотипов, наблюдать эмбрионов в 28 hpf или более поздней версии.
   4. Сортировка эмбрионов, которые показывают задержка закрытия SOS от тех, которые этого не делают.
   5. Сфотографировать эти эмбрионы с использованием рассечения микроскопа, подготовьте чашку Петри, содержащие агарозы 1% в E3. Слегка укол центр агарозы для создания неглубоких отверстия, в котором желток эмбриона может посидеть когда эмбрион помещается на агарозе. Это будет гарантировать, что эмбрион не под углом косой когда фотографироваться.
   6. Анестезировать эмбрионов с 0,003% tricaine в E3 и место боково на агарозе.
   7. Для изображения эмбрионов, с помощью составного или конфокального микроскопа, передачи эмбриона в 35 мм Петри, содержащий небольшой болюс-загущенное 1% легкоплавких точки агарозы в E3 (w/v). Быстро положение эмбриона, сбоку с использованием тонкой лески или ресниц и ждать агарозы для охлаждения. Как только агарозы фирмы, наливайте достаточно E3 в блюдо для покрытия агарозы. Для более подробной информации смотрите Distel и Köster¹⁴.
      Примечание: Если с помощью инвертированного микроскопа, эмбрион может быть помещены против стекло стекло coverslip дно тарелки и образы с стандартной 20 X объективные линзы.
   8. Используйте воду погружения 20 x объектив для визуализации SOS с составной микроскоп. После визуализации осторожно потяните агарозы из эмбрионов и исправить в параформальдегида 4% (PFA) или позволит продолжить их развитие.

2. Протокол 2: В целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин

1. Целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин: день 1
   1. Dechorionate эмбрионы, как описано в шаге 1.2.3, если это еще не сделано. Исправить эмбрионов в microcentrifuge трубку на нужную timepoint в свежеприготовленные 4% PFA для 2 h на шейкере комнатной температуры (22-25 ° C). Вымойте его в 1 x PBST 5 минут, четыре раза.
      Примечание: После гаструляция, эмбрионы могут исправить лучше после dechorionation.
   2. Разрушения эмбрионов в протеиназы K 10 мг/мл при комнатной температуре за 5 минут инкубации время будет зависеть от стадии развития, на котором фиксируются эмбрионов (см. Thisse и Thisse¹⁵).
   3. Вымойте его в 1 x PBST 5 минут, четыре раза.
   4. Блокировать эмбрионов в раствор 5% козьего сыворотки и 2 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 1xPBST для 1-2 h на комнатной температуре шейкер.
   5. Готовят раствор основного антитела путем разбавления антитела анти Ламинин кролика в решении блока при разбавлении 1: 200.
   6. Инкубируйте эмбрионов в первичных антител анти Ламинин ночь на 4 ° C шейкер.
2. Целом гора immunofluorescent окрашивание Ламинин: день 2
   1. Вымойте его в 1 x PBST за 15 мин, пять раз.
   2. Приготовляют раствор вторичные антитела путем разбавления коза анти кролик Alexa Fluor 488 антитела в 1 x PBST в разведении 1: 1000.
      Примечание: Это возможно адаптировать этот шаг с учетом имеющихся ресурсов экспериментатора, используя различные вторичные антитела.
   3. Инкубируйте эмбрионов в вторичное антитело в ночь на 4 ° C шейкер. Защищают от света максимально от этого шага начиная.
   4. Вымойте его в 1 x PBST за 15 минут, четыре раза. Эмбрионы могут храниться на 4 ° C на срок до недели, в случае необходимости.
3. Рассечение и монтаж эмбриональных глаз
   1. При желании, эмбрионы в небольшой Петри и deyolk эмбрионов в 1 x PBST. Сделать это аккуратно нарушая желток с тонкой щипцами и удаляя желток клетки через мягкий соскоб желточного мешка.
   2. Подготовить следующие концентрации решения серии PBS-глицерина в microcentrifuge трубы: 30%, 50% и 70% глицерина в PBS. Перенос эмбрионов в 30% глицерина/PBS, убедившись, что место эмбрионов на вершине решение и передачи как мало предыдущего решения как можно скорее. Ждать для эмбрионов опускаться до нижней части трубки.
   3. Когда эмбрионы потоплены на дно, перевести их на 50% глицерина/PBS. Повторить и передача на 70% глицерина/PBS.
   4. После того, как эмбрионы потоплены в 70% глицерина/PBS, переместите их в небольшой пластиковый блюдо для вскрытия.
   5. Разорвать эмбриона кзади задний мозг и при необходимости использовать задней ткани для генотипирования.
   6. Перемещение голову к слайду стекла, передачи как мало глицерин как можно скорее. Использовать пинцет или другие инструменты тонкой рассечение провести на задний конец держать голову стационарные. Используйте тонкой minutien PIN-код или другие средства тонкой рассечение осторожно вставить в желудочек мозга от передней и сместите вниз, чтобы отделить правой и левой половины головы друг от друга. Повторите это, пока двигающ кзади через мозга и в задний мозг желудочек, по существу fileting головой вниз по средней линии. Это минимизирует ручной манипуляции глаз и окружающие ткани, тем самым оставляя неповрежденный SOS.
   7. Смонтируйте каждой стороне головы средней линии вниз, глаза вверх. Положение четырех должностей вакуумной смазки на углах (соответствующие расстояние врозь для coverslip используется) и крышка с coverslip стекла, толкая вниз последовательно на каждый пост до coverslip делает контакт с образцами. Пипетка 70% глицерина на краю coverslip, так что глицерин вытягиван под, заполняющей пространство между coverslip и слайд.
   8. Примеры изображений в день, или печать вокруг coverslip с ногтей и примеры изображений только после высыхания лака. Хранить в темноте при 4 ° C.

3. Протокол 3: Визуализация из SOS с помощью eGFP-CAAX мРНК

1. Синтез мРНК eGFP-CAAX
   1. Линеаризации 1 мг¹⁶ pCS2-eGFP-CAAX плазмиду с Ноти в реакции объемом 40 мл за 4 часа при 37 ° C.
   2. Чтобы остановить ограничение дайджест реакции, добавить 10 мл, RNase свободной воды, 2,5 мл 10% SDS и 2.0 мл 10 мг/мл протеиназы K.
   3. Инкубировать 1 час при температуре 50 ° C.
   4. Добавьте следующее в отношении реакции (общий объем 200 мл) и переходите к следующему шагу: вода 50 мл, RNase бесплатно, 20 мл 3 M натрия ацетата рН 5.2 и 75,5 мл, RNase свободной воды
      Примечание: РНКазы бесплатная вода добавляется в двух отдельных случаях, чтобы избежать чрезмерного разбавления ацетат натрия.
2. Очистка ДНК через фенол/хлороформ добычи и этанола осадков
   1. Добавьте 200 мл фенола: хлороформ: изоамилового спирта и вихревые для 20 s. Отдельные водные и органические фазы путем центрифугирования в 18000 x g за 5 мин.
   2. Передать верхний водный слой новой microcentrifuge трубки, убедившись в том избежать передачи в органическом слое снизу. Добавьте равное количество метилхлороформа на новую трубу.
      Примечание: Добавление метилхлороформа не является обязательным, но рекомендуется, чтобы обеспечить полное удаление фенола из образца.
   3. Вортекс для 20 s. Отдельные водные и органические фазы путем центрифугирования в 18000 x g за 5 мин.
   4. Как и прежде передавать верхний водный слой новой microcentrifuge трубки, убедившись в том избежать передачи в органическом слое снизу.
   5. Добавьте 1/10 объема 3 M натрия ацетата рН 5.2.
   6. Осадок ДНК, добавив 3 тома 100% бесплатно РНКазы этанола и холод в-20 ° C в течение 15 мин центрифуги на 18,000 g x 20 мин при 4 ° C. Гранулы должны быть видны. Декант супернатант.
   7. Помойте лепешка с 100 мл холодной воды 70%, этанол/РНКазы бесплатно. После аккуратно перемешивания вырваться гранулы, центрифуги на 18,000 x g 15 мин при 4 ° C. Гранулы должны быть видны. Декант супернатант.
   8. Просушите Пелле за 5 мин и Ресуспензируйте ДНК в 7 мл воды.
      Примечание: Гранулы может потребоваться сушить дольше, чем 5 мин в зависимости от доступных воздуха.
3. Для очистки eGFP-CAAX мРНК и транскрипция
   1. Образом, RNase бесплатно Подготовьте в vitro транскрипция реакции с коммерчески доступных комплект полимеразы Sp6 РНК, используя около 1 мг очищенного линеаризованного плазмидной ДНК, полученных в шаге 3.2. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
      Примечание: РНК-полимеразы Sp6 должен использоваться для производства ограничен мРНК.
   2. Добавьте 1 mL DNase (2 ед/мл; РНКазы бесплатно) и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
   3. Очищайте мРНК с любого коммерчески доступных kit Очистка РНК. Алиготе мРНК избегать повторного замораживания оттаивания, и хранить при температуре-80 ° C.
4. Инъекции и визуализация
   1. Получения эмбрионов, изложенные в протоколе 1.1.
   2. С помощью аппарата микроинъекции, залить 300 pg eGFP-CAAX мРНК на этапе 1-клетка.
   3. Экран для эмбрионов с ярким выражением eGFP в глазах, с помощью флуоресценции стереоскоп.
   4. Изображения эмбрионов, как описано в протоколе 1.2.
   5. Кроме того, dechorionate и исправить эмбрионы на нужную timepoint в 4% PFA для 4 часа при комнатной температуре или на ночь при 4° C. Вымойте эмбрионы в 1 x PBST 5 минут, четыре раза и dechorionate, если сделано не ранее. Вскрыть глаза и смонтировать их на слайдах, как описано в разделе 2.3 протокол.

Результаты

Данио рерио SOS появляется в 20 hpf предполагаемого спинной сетчатки⁸. 23 hpf SOS переходы от его первоначального узкого архитектуры для широкого отступы и 26 hpf, это больше не видны⁸. Таким образом для изучения SOS во время разработки глаз обычных данио р...

Обсуждение

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов соблюдать SOS в развивающихся zebrafish эмбриона. Чтобы определить закрытие задержки фенотипов, наши протоколы были сосредоточены на способность различать разделение двух дискретных долей спинной носовой и спинной височной стор?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017