Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Resumo

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Resumo

Coloboma ocular congênita é uma desordem genética que normalmente é observada como uma fissura no aspecto inferior do olho resultantes de fechamento da fissura coroide incompleta. Recentemente, a identificação de indivíduos com coloboma no aspecto superior da íris, retina e lente levado à descoberta de uma estrutura nova, conhecido como a fissura superior ou superior sulco ocular (SOS), que está presente transitoriamente na dorsal aspecto da Taça óptica durante o desenvolvimento do olho de vertebrados. Embora esta estrutura é conservada em ratos, garota, peixe e Tritão, nossa compreensão atual do SOS é limitado. A fim de elucidar os fatores que contribuem para sua formação e o encerramento, é imperativo para poder observá-lo e identificar anormalidades, tais como atraso no fechamento do SOS. Aqui, nos propusemos a criar uma série padronizada de protocolos que podem ser usados para visualizar eficientemente o SOS combinando técnicas de microscopia amplamente disponível com técnicas de biologia molecular comuns como coloração imunofluorescente e mRNA superexpressão. Enquanto este conjunto de protocolos enfoca a capacidade de observar o atraso de fechamento de SOS, é adaptável às necessidades do experimentador e pode ser facilmente modificado. Em geral, esperamos criar um método acessível através do qual a nossa compreensão do SOS pode ser avançado para expandir o conhecimento atual do desenvolvimento do olho de vertebrados.

Introdução

A formação do olho de vertebrados é um processo altamente conservado em que vias de sinalização intercelulares cuidadosamente orquestradas estabelecer tipos de tecido em especificam a identidade regional¹. Perturbações de início morfogênese olho resultam em defeitos profundos para a arquitetura do olho e são frequentemente cegueira². Uma tal doença resulta do não-fechamento da fissura coroide ocular no lado ventral da Taça óptica³. Esta doença, conhecida como coloboma ocular, estima-se que ocorrem em 1 a 4-5000 nascidos vivos e % de 3-11 causa de cegueira pediátrica, manifestando-se geralmente como uma estrutura de fechadura que se projeta inferiormente do aluno no centro do olho^{4, 5,6}. A função da fissura coroide é fornecer um ponto de entrada para início vasculatura crescendo no copo de óptica, depois que os lados da fissura irão fundir para delimitar os navios⁷.

Enquanto coloboma ocular é conhecida desde os tempos antigos, nós identificamos recentemente um romance subconjunto de pacientes coloboma com perda de tecido, afetando a face superior/dorsal do olho. Trabalho recente em nosso laboratório levou à descoberta de uma estrutura ocular no olho dorsal zebrafish, que nos referimos como o sulco ocular superior (SOS) ou fissura superior⁸. É importante observar que a estrutura tem características de um sulco e uma fissura. É semelhante a um sulco, uma camada de tecido contínua que se estende desde o nasal da retina temporal. Além disso, o fechamento da estrutura não é mediado por uma fusão dos dois opostos da membrana basal, e parece exigir um processo morfogenético, pelo qual a estrutura é preenchida por células. No entanto, semelhante a uma fissura, forma uma estrutura que separa os lados nasais e temporais do olho dorsal com a membrana basal. Para obter consistência, nos referiremos a ela como SOS neste texto.

O SOS é evolutivamente conservado em vertebrados, sendo visível durante a morfogênese de olho no peixe, pintinho, Tritão e rato⁸. Em contraste com a fissura coroide, que está presente desde a pós-fertilização 20-60 horas (hpf) no zebrafish, o SOS é altamente transitório, sendo facilmente visível a partir de 20-23 hpf e ausente por 26 hpf⁸. Pesquisas recentes em nosso laboratório encontrou que, semelhante da fissura coroide, o SOS desempenha um papel na orientação vascular durante o olho morfogênese⁸. Embora os fatores que controlam a formação e o encerramento do SOS ainda não são totalmente compreendidos, nossos dados destacar papéis para dorso-ventral olho padronização genes⁸.

Zebrafish é um organismo modelo excelente para estudar o SOS. Como um sistema de modelo, ele fornece uma série de vantagens em estudar o desenvolvimento do olho: é um modelo de vertebrados; cada geração apresenta alta fecundidade (~ 200 embriões); seu genoma foi totalmente sequenciada, que facilita a manipulação genética; e cerca de 70% dos genes humanos têm pelo menos um orthologue zebrafish, tornando-se um modelo ideal baseado em genética de doenças humanas^9,10. Mais importante ainda, seu desenvolvimento ocorre externamente à mãe, e suas larvas são transparentes, o que permite a visualização do olho em desenvolvimento com relativa facilidade¹¹.

Este conjunto de protocolos, descrevemos as técnicas através das quais o SOS podem ser visualizado em larvas de peixe-zebra. A variedade de técnicas de visualização utilizado neste relatório permitirá clara observação do SOS durante o desenvolvimento do olho normal, bem como a capacidade de detectar defeitos de fechamento do SOS. Nossos protocolos de exemplo contará com investigações de Gdf6, um BMP localizada para o dorsal olho e conhecido regulador de encerramento de SOS. Além disso, essas técnicas podem ser combinadas com manipulações experimentais para identificar fatores genéticos ou agentes farmacológicos que afetam o fechamento e a adequada formação de SOS. Além disso, nós incluímos um protocolo através do qual a imagem fluorescente de todas as membranas celulares é possível, permitindo que o experimentador observar alterações morfológicas que as células circundantes o SOS. Nosso objetivo é estabelecer um conjunto de protocolos padronizados que podem ser usados em toda a comunidade científica para oferecer novos insights sobre esta estrutura nova do olho em desenvolvimento.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Alberta cuidado do Animal e Comissão de utilização.

1. Protocolo 1: Visualização de SOS usando estereomicroscópio e imagem latente de interferência diferencial (DIC) de contraste

1. Colheita de embriões
   1. Em um tanque de água sem cloro, prepare cruzes de gdf6a^{+ /-} zebrafish à noite emparelhando um zebrafish macho com um fêmea zebrafish. Certifique-se de separar o macho da fêmea usando um divisor para garantir que os embriões nascem dentro de um pequeno intervalo de tempo.
   2. Na manhã seguinte, puxe o divisor e permitir o zebrafish procriar para não mais do que 30 min. recolher os embriões em placas de Petri com meios E3, descritos no livro de Zebrafish o¹²e colocá-los numa incubadora de 28,5 ° C.
   3. Remova quaisquer ovos não fertilizados ou embriões mortos, que aparecerão branco e opaco.
2. Preparação e imagens ao vivo de embriões de peixe-zebra
   1. Aos 20 hpf, substituir o E3 media com E3 mídia contendo 0,004% 1-fenil-2-tioureia (PTU) para evitar a produção do pigmento.
      Nota: Adição de PTU em um Commit ligeiramente posterior, tais como hpf 22-24, é improvável que interferem com o experimento devido ao início da idade dos embriões no momento da imagem latente. No entanto, recomenda-se tratar os embriões cedo para evitar completamente a pigmentação como lá é uma banda de pigmentação que aparece nos olhos dorsal, que podem interferir com a imagem do SOS.
   2. Certifique-se de que todos os embriões estão em fase de desenvolvimento correto em vários pontos, levando até o tempo de observação. Recomenda-se que isto é feito em estágios no qual somite número é claramente visível, conforme descrito por Kimmel et al.¹³. Remova os que são mentalmente imaturos.
   3. Coloque os embriões sob um microscópio de dissecação e dechorionate os embriões puxando levemente separados o córion usando pinça fina. Visualize o SOS no olho dorsal. O SOS pode aparecer como um recuo na margem dorsal do olho, e uma linha deve ser visível em todo o olho dorsal. Para encerramento normal de SOS, observar os embriões ao redor 20-23 hpf. Para análise dos fenótipos de fechamento retardados SOS, observar os embriões em 28 hpf ou mais tarde.
   4. Classificar os embriões que mostram atraso de fechamento SOS de aqueles que não.
   5. Para fotografar esses embriões utilizando um microscópio de dissecação, prepare um prato de Petri contendo 1% de agarose em E3. Levemente picar o centro do agarose para criar um buraco raso, no qual a gema do embrião pode sentar-se quando o embrião é colocado sobre o agarose. Isto irá garantir que o embrião não é num ângulo oblíquo ao ser fotografado.
   6. ANESTHETIZE embriões com metanosulfonato de 0,003% em E3 e coloque lateralmente sobre o agarose.
   7. Para os embriões utilizando um microscópio confocal ou composto de imagem, transferir o embrião para 35 mm placa de Petri contendo pequenas em bolus não gelificada baixo ponto de fusão ponto de agarose a 1% na E3 (p/v). Rapidamente, posicione o embrião lateralmente, usando uma linha de pesca bem ou um cílio e espere o agarose esfriar. Uma vez que a agarose é firme, despeje o prato para cobrir o agarose suficiente E3. Para mais detalhes, consulte Distel e Köster¹⁴.
      Nota: Se usando um microscópio invertido, o embrião pode ser colocado contra o vidro de um prato de vidro-lamela-inferior e fotografado com um padrão 20 X lente objetiva.
   8. Use uma imersão água 20x objectiva para visualizar o SOS com um microscópio composto. Após a visualização, gentilmente puxe o agarose de embriões e corrigir em paraformaldeído 4% (PFA) ou permitir para continuar seu desenvolvimento.

2. protocolo 2: Toda a montagem coloração imunofluorescente da laminina

1. Toda a montagem coloração imunofluorescente da laminina: dia 1
   1. Dechorionate embriões conforme descrito na etapa 1.2.3, se não já feito. Fixar os embriões em um tubo de microcentrifugadora no Commit desejado em recém-feitos 4% PFA para 2h num agitador de temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavar em 1 x PBST por 5 min, quatro vezes.
      Nota: Após a gastrulação, os embriões podem fixar melhor após dechorionation.
   2. Permeabilize embriões em proteinase 10mg/mL K à temperatura ambiente por 5 min. tempo de incubação dependerá o grau de desenvolvimento em que os embriões são fixos (ver Thisse e Thisse¹⁵).
   3. Lavar em 1 x PBST por 5 min, quatro vezes.
   4. Bloquear os embriões em uma solução de 5% cabra 2 mg/mL de soro e de albumina de soro bovino (BSA) em 1xPBST para 1-2 h num agitador de temperatura.
   5. Prepare a solução de anticorpo primário por diluir a anticorpos de coelho antilaminina em solução de bloco em uma diluição de 1: 200.
   6. Incube os embriões no anticorpo primário antilaminina durante a noite em um shaker de 4 ° C.
2. Toda a montagem coloração imunofluorescente da laminina: dia 2
   1. Lavar em 1 x PBST por 15 min, cinco vezes.
   2. Preparar a solução de anticorpo secundário diluindo o anticorpo de cabra anticoelho Alexa Fluor 488 em 1 x PBST a uma diluição de 1: 1000.
      Nota: É possível adaptar esta etapa para adequar os recursos disponíveis para o experimentador, usando um anticorpo secundário diferente.
   3. Incube os embriões no anticorpo secundário durante a noite em um shaker de 4 ° C. Escudo de luz, tanto quanto possível, a partir deste passo em diante.
   4. Lavar em 1 x PBST por 15 min, quatro vezes. Os embriões podem ser armazenados a 4 ° C por até uma semana, se necessário.
3. Dissecção e montagem dos olhos embrionários
   1. Se desejar, coloque os embriões em um pequeno prato de Petri e deyolk os embriões em 1 x PBST. Fazer isto suavemente rompendo a gema com pinça fina e removendo as células gema através de raspagem suave do saco vitelino.
   2. Preparar as seguintes concentrações de soluções da série PBS-glicerol em tubos microcentrifuga: 30%, 50% e 70% de glicerol em PBS. Transferência de embriões em 30% glicerol/PBS, certificando-se de colocar os embriões em cima da solução e transferir tão pouco da solução anterior quanto possível. Espere que os embriões afundar até o fundo do tubo.
   3. Quando embriões tem afundado no fundo, transferi-los para 50% glicerol/PBS. Repita e transferir para 70% glicerol/PBS.
   4. Uma vez que os embriões tem afundado em 70% glicerol/PBS, movê-los para um prato de plástico pequeno para dissecações.
   5. Romper o embrião posterior para o rombencéfalo e usar o tecido posterior para a genotipagem, se necessário.
   6. Mova a cabeça para uma lâmina de vidro, transferir como glicerol pouco quanto possível. Usar fórceps ou outras ferramentas de dissecação bem para segurar a extremidade posterior para manter a cabeça imóvel. Use um alfinete bem minutien ou outras ferramentas de dissecação bem suavemente introduza no prosencéfalo ventrículo de câmara anterior e empurre para baixo para separar as metades direita e esquerdas da cabeça do outro. Repita isto enquanto se move posteriormente através do mesencéfalo e no ventrículo rombencéfalo, essencialmente filés de cabeça para baixo da linha média. Isso minimiza a manipulação manual dos olhos e tecidos circundantes, deixando o SOS não danificado.
   7. Monte cada lado da linha média de cabeça para baixo, olho. Posição de quatro postos de vácuo graxa nos cantos (uma distância adequada separado para a lamela sendo usada) e cobrir com uma lamela de vidro, empurrando para baixo sequencialmente em cada posto até a lamela faz contato com as amostras. Pipete 70% glicerol na borda da lamela para que o glicerol é puxado por baixo, preenchendo o espaço entre a lamínula e o slide.
   8. Amostras de imagem dentro de um dia, ou selo em torno da lamínula com esmalte e amostras de imagem somente depois que o esmalte secou. Armazenar no escuro a 4 ° C.

3. protocolo 3: Visualização de SOS usando EGFP-Lipidação mRNA

1. Síntese de mRNA eGFP-Lipidação
   1. Linearizar 1 mg de plasmídeo pCS2-eGFP-Lipidação¹⁶ com NotI num volume de reação de 40 mL por 4 horas a 37 ° C.
   2. Para parar a reação de síntese de restrição, adicionar 10 mL RNase-livre de água, 2,5 mL 10% SDS e 2,0 mL 10 mg/mL de Proteinase K.
   3. Incubar a 1 hora a 50 ° C.
   4. Adicione o seguinte para a reação (total de volume de 200 mL) e prossiga para a próxima etapa: 50 mL RNase-livre de água, 20 mL 3M de sódio acetato pH 5.2 e 75,5 mL RNase-livre de água
      Nota: Adiciona-se água livre de RNase em duas ocasiões separadas para evitar diluição excessiva do acetato de sódio.
2. Purificação de DNA através da precipitação de extração e etanol de fenol/clorofórmio
   1. Adicione 200 mL fenol: clorofórmio: isoamílico álcool e vórtice para 20 s. separado as fases aquosas e orgânicas, através de centrifugação a 18.000 x g por 5 min.
   2. Transferi a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrifuga, certificando-se de evitar a transferência de camada orgânica inferior. Adicione um volume igual de clorofórmio para o tubo de novo.
      Nota: A adição de clorofórmio é opcional, mas é recomendável para assegurar a completa remoção de fenol da amostra.
   3. Vórtice para 20 s. separado as fases aquosas e orgânicas, através de centrifugação a 18.000 x g por 5 min.
   4. Como antes, transferi a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrifuga, certificando-se de evitar a transferência de camada orgânica inferior.
   5. Adicione o volume de 1/10 do pH de acetato de sódio 3M 5.2.
   6. Precipitar o DNA adicionando 3 volumes de 100% livre de RNase etanol e resfriado a-20 ° C durante 15 min. centrifugar a 18.000 x g por 20 min a 4 ° C. Uma pelota deve ser visível. Decante o sobrenadante.
   7. Lave o pellet com 100 mL de água fria de etanol/RNase-livre de 70%. Depois de gentilmente misturar para soltar o sedimento, centrifugar a 18.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Uma pelota deve ser visível. Decante o sobrenadante.
   8. Secar ao ar livre a pelota por 5 min e ressuspender o DNA em 7 mL de água.
      Nota: A pelota pode precisar de ser secas por mais de 5 min, dependendo do fluxo de ar disponível.
3. Transcrição e purificação de mRNA eGFP-Lipidação
   1. De uma forma livre de RNase, prepare uma reação de transcrição em vitro com um kit de polimerase RNA Sp6 comercialmente disponível, usando cerca de 1 mg de plasmídeo linear purificado ADN obtido no passo 3.2. Incubar durante 2 h a 37 ° C.
      Nota: Sp6 RNA polimerase deve ser usado para a produção de mRNA tampado.
   2. Adicionar 1 mL de DNase (2 U/mL; RNase livre) e incube por 30 min a 37 ° C.
   3. Purifica o mRNA com qualquer kit de purificação de RNA comercialmente disponível. Alíquota do mRNA para evitar o congelamento-descongelamento repetidos e armazenar a-80 ° C.
4. Injeção e visualização
   1. Obter embriões conforme descrito no protocolo 1.1.
   2. Usando um aparelho de microinjeção, injete 300 pg de eGFP-Lipidação mRNA na fase 1-célula.
   3. Tela para embriões com a expressão brilhante de eGFP nos olhos usando um estereoscópio de fluorescência.
   4. Os embriões da imagem conforme descrito no ponto 1.2 do protocolo.
   5. Alternativamente, dechorionate e fixar os embriões a Commit desejado em 4% PFA por 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4° C. Lave os embriões em 1x PBST por 5 min, quatro vezes e dechorionate, se não previamente feito. Dissecar os olhos e montá-los em lâminas, conforme descrito no ponto 2.3 do protocolo.

Resultados

O zebrafish SOS aparece aos 20 hpf no retina dorsal presuntivo⁸. Por 23 hpf o SOS transições de sua arquitetura inicial estreita para um recuo de largura e 26 hpf não é mais visível⁸. Portanto, para examinar o SOS durante o desenvolvimento do olho normal zebrafish, os embriões devem ser observados entre 20-23 hpf. Durante este período, o SOS é observável através do microscópio de dissecação e através de imagem de DIC como uma l...

Discussão

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o SOS no desenvolvimento do embrião do zebrafish. Para determinar os fenótipos de atraso de fechamento, nossos protocolos centraram-se sobre a capacidade de distinguir a separação dos dois lobos discretas dos lados nasal dorsal e dorsal-temporal do olho, semelhante às técnicas usadas para visualizar o atraso de fechamento da fissura coroide fenótipos nos olhos ventral.

Estas técnicas de visualização podem ser usada...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017