Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

Resumen

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.

Resumen

Coloboma ocular congénito es un trastorno genético que típicamente se observa como una hendidura en el aspecto inferior del ojo resultante cierre de fisura coroide incompleta. Recientemente, la identificación de individuos con coloboma en el aspecto superior del iris, retina y lente conducido al descubrimiento de una nueva estructura, denominada la fisura superior o surco ocular superior (SOS), que es transitorio presente en el dorsal aspecto de la Copa óptica durante el desarrollo del ojo vertebrado. Aunque esta estructura se conserva en ratones, pollos, pescados y newt, nuestra comprensión actual de los SOS es limitada. Con el fin de dilucidar los factores que contribuyen a su formación y cierre, es imprescindible para poder observar e identificar anormalidades, tales como retraso en el cierre de la SOS. Aquí, nos propusimos para crear una serie estandarizada de protocolos que puede utilizarse para visualizar eficientemente el SOS combinando técnicas de microscopía disponible con técnicas de biología molecular comunes tales como coloración inmunofluorescente y mRNA sobreexpresión. Mientras que este conjunto de protocolos se centra en la capacidad de observar el retardo de cierre de SOS, es adaptable a las necesidades del experimentador y pueden modificarse fácilmente. En general, esperamos crear un método accesible a través del cual se puede avanzar nuestra comprensión de la SOS para ampliar el conocimiento actual del desarrollo del ojo vertebrado.

Introducción

La formación del ojo vertebrado es un proceso altamente conservado en que vías de señalización intercelulares cuidadosamente orquestadas establecen tipos de tejidos y especifican identidad regional¹. Perturbaciones a la morfogénesis temprana de ojo provocar defectos profundos en la arquitectura del ojo y con frecuencia son ciego². Una de esas enfermedades resultado de la falta para cerrar la fisura ocular coroide en la parte ventral de la taza óptica³. Este trastorno, conocido como coloboma ocular, se estima para ocurrir en 1 fuera de 4-5000 nacidos vivos y causa el 3-11% de ceguera pediátrica, que se manifiesta comúnmente como una ojo de la cerradura-como la estructura que sobresale en parte inferior de la pupila en el centro del ojo^{4, 5,6}. La función de la fisura coroide es proporcionar un punto de entrada de vasculatura temprana creciendo en la Copa óptica, después de que los lados de la fisura fusible para incluir los vasos⁷.

Mientras que el coloboma ocular ha sido conocido desde la antigüedad, recientemente hemos identificado un nuevo subconjunto de pacientes con coloboma con pérdida de tejido que afectan el aspecto dorsal superior del ojo. Trabajos recientes en nuestro laboratorio ha conducido al descubrimiento de una estructura ocular en el ojo dorsal del pez cebra, que llamamos el surco ocular superior (SOS) o fisura superior⁸. Es importante tener en cuenta que la estructura tiene características de un surco y una fisura. Similar a un surco, es una capa de tejido continuo que abarca desde la nasal de la retina temporal. Además, el cierre de la estructura no está mediado por una fusión de los dos opuestos de la membrana del sótano, y que parece requerir un proceso morfogenético por que la estructura está poblada por las células. Sin embargo, similar a una fisura, forma una estructura que separa las partes nasal y temporales del ojo dorsal con la membrana basal. Coherencia, nos referiremos a él como SOS en este texto.

El SOS es evolutivamente conservado en vertebrados, siendo visible durante la morfogénesis de ojo de pescado, pollo, newt y mouse⁸. En contraste con la fisura coroide, que está presente desde la fecundación después de 20-60 horas (hpf) en el pez cebra, el SOS es muy transitorio, visible de 20-23 hpf y ausente por hpf 26⁸. Investigaciones recientes en nuestro laboratorio ha encontrado que, similar a la fisura de la coroide, el SOS desempeña un papel en dirección vascular durante la morfogénesis de ojo⁸. Aunque los factores que controlan la formación y el cierre del SOS no se entienden todavía completamente, nuestros datos destacan papeles ojo dorsal ventral patrones genes⁸.

Pez cebra es un organismo modelo excelente para estudiar el SOS. Como sistema modelo, ofrece una serie de ventajas en el estudio de desarrollo del ojo: es un modelo vertebrado; cada generación presenta alta fecundidad (~ 200 embriones); su genoma se ha secuenciado completamente lo que facilita la manipulación genética; y aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un pez cebra orthologue, convirtiéndolo en un modelo ideal basado en la genética de la enfermedad humana^9,10. Lo más importante, su desarrollo lleva a cabo externamente a la madre, y sus larvas son transparentes, que permite la visualización del ojo en desarrollo con relativa facilidad¹¹.

En este conjunto de protocolos, se describen las técnicas a través del cual se puede visualizar el SOS en larvas de pez cebra. La variedad de técnicas de visualización utilizado en este informe permitirá observación clara de los SOS durante el desarrollo normal del ojo, así como la capacidad para detectar defectos de cierre de SOS. Nuestros protocolos de ejemplo contará con investigaciones de Gdf6, un BMP localizada en la dorsal ojos y conocido regulador de cierre de SOS. Además, estas técnicas pueden combinarse con manipulaciones experimentales para identificar factores genéticos o agentes farmacológicos que afectan el cierre y la correcta formación de SOS. Además, hemos incluido un protocolo mediante el cual la imagen fluorescente de todas las membranas celulares es posible, lo que permite al experimentador observar cambios morfológicos en las células que rodean el SOS. Nuestro objetivo es establecer una serie de protocolos estandarizados que pueden utilizarse en toda la comunidad científica para ofrecer nuevas penetraciones en la estructura de novela del ojo en desarrollo.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad del Comité de uso y cuidado de animales de Alberta.

1. Protocolo n ° 1: Visualización de SOS con Estereomicroscopio y proyección de imagen de interferencia diferencial (DIC) de contraste

1. Colección de embriones
   1. En un tanque de agua declorada, preparar cruces de gdf6a^+- pez cebra en la noche por la vinculación de un pez cebra macho con una hembra pez cebra. Asegúrese de separar el macho de la hembra mediante un divisor para asegurar que los embriones nacen dentro de un intervalo pequeño de tiempo.
   2. A la mañana siguiente, tire el divisor y permiten el pez cebra criar para no más de 30 minutos recogen los embriones en placas de Petri con los medios E3, se describe en el libro de los peces cebra¹²y colocarlos en una incubadora de 28,5 ° C.
   3. Eliminar huevos no fertilizados o embriones muertos, que aparecen blanco y opaco.
2. Preparación y vivir-la proyección de imagen de embriones de pez cebra
   1. 20 hpf, reemplace el E3 media medios E3 que contienen 0.004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) para evitar la producción de pigmento.
      Nota: Además de PTU en un punto un poco más tarde, como 22-24 hpf, es improbable que interfieran con el experimento de debido a la temprana edad de los embriones en el momento de la proyección de imagen. Sin embargo, se recomienda para el tratamiento de los embriones temprano para prevenir totalmente la pigmentación ya que hay una banda de pigmentación que aparece en la vista dorsal, que puede interferir con la imagen de la SOS.
   2. Garantizar que todos los embriones en las etapas de desarrollo correcto en varios puntos a la hora de observación. Se recomienda que se realice en las etapas en que somite número es claramente visible como se indica por Kimmel et al.¹³. Eliminar aquellos que son inmaduros al desarrollo.
   3. Coloque los embriones bajo un microscopio de disección y dechorionate los embriones tirando suavemente aparte el corion con unas pinzas finas. Visualizar el SOS en la vista dorsal. El SOS puede aparecer como una muesca en el margen dorsal del ojo, y una línea debe ser visible a través de la vista dorsal. Para el cierre de SOS normal, observar los embriones en torno a 20-23 hpf. Para la examinación de los fenotipos de cierre de SOS retrasadas, observar los embriones 28 hpf o más tarde.
   4. Clasificar los embriones que muestran retardo del cierre de SOS de los que no.
   5. Para fotografiar estos embriones utilizando un microscopio de disección, preparar un plato de Petri que contenga 1% agarosa en E3. Pinchar ligeramente el centro de la agarosa para crear un agujero poco profundo en el que la yema del embrión puede sentarse cuando el embrión se coloca en la agarosa. Esto asegurará que el embrión no está en un ángulo oblicuo al ser fotografiados.
   6. Anestesiar los embriones con Metanosulfonato de 0.003% en E3 y lateralmente en la agarosa.
   7. Para los embriones usando un microscopio compuesto o confocal de imágenes, transferir el embrión en 35 mm placa de Petri que contiene un pequeño bolo de no cuajó bajo punto de fusión punto de agarosa al 1% en E3 (w/v). Coloque el embrión lateralmente usando un sedal fino o una pestaña y esperar a que la agarosa se enfríe rápidamente. Una vez firme la agarosa, vierta suficiente E3 en el plato para cubrir la agarosa. Para más detalles, ver Distel y Köster¹⁴.
      Nota: Si está usando un microscopio invertido, el embrión puede ser colocado contra el vidrio de un plato de vidrio-cubreobjetos-bottom y fotografiado con un estándar de 20 X lente objetiva.
   8. Utilice un objetivo de inmersión x 20 agua para visualizar el SOS con un microscopio compuesto. Después de visualización, suavemente tire la agarosa de los embriones y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) o permitir que continúen su desarrollo.

2. Protocolo 2: Whole-mount de coloración inmunofluorescente del laminin

1. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 1
   1. Dechorionate embriones como se describe en el paso 1.2.3, si no lo ha hecho. Fijar los embriones en un tubo de microcentrífuga en el punto deseado en el recién hecho 4% PFA por 2 h en un agitador de temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
      Nota: Después de la gastrulación, embriones pueden fijar mejor después de dechorionation.
   2. Permeabilizar embriones en proteinasa de 10 mg/mL K a temperatura ambiente por 5 minutos tiempo de incubación dependerá de la etapa de desarrollo en el cual los embriones son fijos (ver Thisse y Thisse¹⁵).
   3. Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
   4. Bloque de embriones en una solución de 5% cabra suero y 2 mg/mL albúmina de suero bovino (BSA) en 1xPBST para 1-2 h en un agitador de la temperatura ambiente.
   5. Preparar solución de anticuerpo primario por diluir el anticuerpo de conejo anti-laminina en la solución de bloque en una dilución 1: 200.
   6. Incubar los embriones en el anticuerpo primario anti-laminina durante la noche en un agitador de 4 ° C.
2. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 2
   1. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cinco veces.
   2. Preparar la solución de anticuerpo secundario por diluir el anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 en 1 x PBST a una dilución de 1: 1000.
      Nota: Es posible adaptar este paso para adaptarse a los recursos disponibles al experimentador, mediante el uso de un anticuerpo secundario diferente.
   3. Incubar los embriones en el anticuerpo secundario durante la noche en un agitador de 4 ° C. Proteger de la luz tanto como sea posible de este paso adelante.
   4. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cuatro veces. Los embriones pueden almacenarse a 4 ° C por hasta una semana, si es necesario.
3. Disección y montaje de ojos embrionarios
   1. Si lo desea, coloque los embriones en una placa Petri pequeña y deyolk los embriones en 1 x PBST. Para ello, interrumpir la yema de huevo con unas pinzas finas y eliminar las células de la yema mediante raspado suave de la vesícula vitelina.
   2. Preparar las siguientes concentraciones de glicerol PBS serie soluciones en tubos de microcentrífuga: glicerol 30%, 50% y 70% en PBS. Transferencia de embriones en 30% glicerol/PBS, asegurándose de colocar los embriones en la parte superior la solución y la transferencia de tan poco de la solución anterior como sea posible. Espere a que los embriones a hundirse hasta el fondo del tubo.
   3. Cuando los embriones han hundido en el fondo, transferir al 50% glicerol/PBS. Repetición y transferencia a 70% glicerol/PBS.
   4. Una vez que los embriones han hundido en 70% glicerol/PBS, moverlos a un pequeño plato de plástico para disecciones.
   5. Cortar el embrión posterior al cerebelo y utilice el tejido posterior para genotipificación, si es necesario.
   6. Mover la cabeza de un portaobjetos de vidrio, transferencia como glicerol poco como sea posible. Utilice pinzas u otras herramientas de disección fina para sujetar en el extremo posterior para mantener la cabeza inmóvil. Use un alfiler fino minutien u otras herramientas de disección fina suavemente introducir en el ventrículo del cerebro anterior de la anterior y empuje hacia abajo para separar las mitades derecha e izquierdas de la cabeza de uno al otro. Repita este movimiento posteriormente a través del mesencéfalo y en el ventrículo del hindbrain, esencialmente fileting la cabeza hacia abajo de la línea media. Esto reduce al mínimo la manipulación manual del ojo y el tejido circundante, dejando intacto el SOS.
   7. Montar cada lado de la línea media cabeza hacia abajo, ojo para arriba. Cuatro entradas de grasa para vacío en las esquinas (una distancia apropiada para el cubreobjetos se utiliza) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio, presionar secuencialmente en cada post hasta el cubreobjetos en contacto con las muestras. Pipeta con glicerol al 70% en el borde del cubreobjetos para que el glicerol se tira abajo, llenando el espacio entre el cubreobjetos y la diapositiva.
   8. Muestras de la imagen dentro de un día, o un sello en el cubreobjetos con la muestra de imagen sólo después de que se haya secado el esmalte de uñas y esmalte de uñas. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C.

3. Protocolo 3: Visualización de SOS usando eGFP CAAX mRNA

1. Síntesis de mRNA de eGFP CAAX
   1. Alinear 1 mg de plásmido pCS2-eGFP-CAAX¹⁶ con NotI en un volumen de reacción de 40 mL durante 4 horas a 37 ° C.
   2. Para detener la reacción de digestión de restricción, añadir 10 mL libre de Rnasa de agua, 2,5 mL 10% SDS y 2,0 mL 10 mg/mL de proteinasa K.
   3. Incubar 1 hora a 50 ° C.
   4. Agregue lo siguiente para la reacción (volumen total 200 mL) y proceder al siguiente paso: 50 mL libre de Rnasa de agua, 20 mL 3 M sodio acetato pH 5.2 y 75,5 mL libre de Rnasa de agua
      Nota: El agua libre de ARNasa se agrega en dos ocasiones para evitar la excesiva dilución del acetato de sodio.
2. Purificación del ADN mediante fenol/cloroformo extracción y etanol de precipitación
   1. Añadir 200 mL de alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico y vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
   2. Transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo. Añadir un volumen igual de cloroformo al tubo de nuevo.
      Nota: La adición de cloroformo es opcional, pero se recomienda para asegurar la completa remoción del fenol de la muestra.
   3. Vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
   4. Como antes, transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo.
   5. Añadir el 1/10 volumen de 3 M sodio acetato pH 5.2.
   6. Precipitar el ADN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% libre de ARNasas y frío a-20 ° C durante 15 minutos la centrifugadora a 18.000 x g por 20 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
   7. Lavar el precipitado con 100 mL de agua fría de la Rnasa-libre etanol del 70%. Después de mezclar suavemente para romper los pellets sueltos, centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
   8. Secar el pellet por 5 min y resuspender el ADN en 7 mL de agua.
      Nota: La pastilla deba ser secada durante más de 5 min dependiendo el flujo de aire disponible.
3. Transcripción y purificación de eGFP CAAX mRNA
   1. De una manera libre de Rnasa, preparar una reacción de transcripción en vitro con un kit de polimerasa Sp6 RNA comercialmente disponible, utilizando aproximadamente 1 mg de plásmido linearizado purificado ADN obtenido en el paso 3.2. Incubar por 2 h a 37 ° C.
      Nota: Sp6 RNA polimerasa debe usarse para la producción de mRNA tapado.
   2. Añadir 1 mL de DNasa (2 U/mL; Libre de ARNasas) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
   3. Purificar el ARNm con cualquier kit de purificación de RNA comercialmente disponible. Alícuota del mRNA para evitar la congelación y descongelación repetida y almacenar a-80 ° C.
4. Inyección y visualización
   1. Obtener embriones en protocolo 1.1.
   2. Usar un aparato de microinyección, inyectar 300 pg de eGFP CAAX mRNA en la etapa de 1 célula.
   3. Pantalla de embriones con la brillante expresión de eGFP en los ojos utilizando un estereoscopio de fluorescencia.
   4. Imagen de los embriones como se describe en el protocolo de 1.2.
   5. Alternativamente, dechorionate y fijar los embriones en el punto deseado en el 4% PFA durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4° C. Lave los embriones en el 1 x SAFT durante 5 minutos, cuatro veces y dechorionate, si no ha hecho. Diseccionar los ojos y móntelas en las diapositivas como se describe en el protocolo 2.3.

Resultados

El pez cebra SOS aparece en 20 hpf en la presunta retina dorsal⁸. 23 hpf el SOS las transiciones de su arquitectura inicial estrecha a una muesca amplia y 26 hpf ya no es visible⁸. Por lo tanto, para examinar el SOS durante el desarrollo de ojo de pez cebra normal, deben observarse los embriones entre 20-23 hpf. Durante este período, el SOS es observable mediante el microscopio de disección y a través de la proyección de imagen de DIC co...

Discusión

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el SOS en el embrión de pez cebra en desarrollo. Para determinar fenotipos de retardo de cierre, los protocolos se han centrado en la capacidad de distinguir la separación de dos lóbulos discretos de los lados del ojo, similar a las técnicas utilizadas para visualizar retardo de cierre de fisura coroide nasal dorsal y dorsal-temporal fenotipos en la vista ventral.

Estas técnicas de visualización pueden utilizarse junt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017