Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Özet

Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.

Özet

Konjenital oküler coloboma genellikle eksik choroid yarığın kapanması sonucu göz aşağı yönüyle bir yarık olarak gözlenen genetik bir hastalıktır. Son zamanlarda, olan bireylerin coloboma Iris, retina ve objektif bir roman yapısı, keşif için liderliğindeki üstün yönüyle üstün çatlak veya dorsal üzerinde geçici mevcut üstün oküler sulkus (SOS), olarak başvurulan kimliği omurgalı gözü geliştirme sırasında optik cup yönünü. Her ne kadar bu yapı fareler, piliç, Balık ve su keleri arasında korunmuş, imdat geçerli anlayışımızı sınırlıdır. Onun oluşumu ve kapatılması için katkıda bulunan faktörler aydınlatmak için gözlemlemek ve anormallikler, imdat kapatma gecikmesi gibi tanımlamak edebilmek için zorunludur. Burada, verimli bir şekilde SOS immünfloresan boyama ve mRNA gibi ortak moleküler biyoloji teknikleri yaygın olarak kullanılan mikroskobu tekniklerle birleştirerek görselleştirmek için kullanılan iletişim kuralları standart bir dizi oluşturmak için yola çıktı overexpression. Bu iletişim kuralları kümesi SOS kapatma gecikme gözlemlemek yeteneği üzerinde duruluyor iken deneyci'nın ihtiyaçlarına adapte edilebilir ve kolayca değiştirilebilir. Genel olarak, biz hangi aracılığıyla SOS anlayışımızı omurgalı gözü geliştirme geçerli bilgisini artırmak için gelişmiş olabilir ulaşılabilir bir yöntem oluşturmak umut.

Giriş

Omurgalı göz oluşumu dikkatle düzenledi hücreler arası sinyal yolları doku türleri oluşturabilir ve bölgesel kimlik¹belirtebilirsiniz son derece korunmuş bir süreçtir. Tedirginlikler erken göz morfogenez için derin hataları göz mimarisi için neden ve sık sık²kör. Böyle bir hastalık choroid oküler fissür optik cup³ventral tarafta kapatmak için hata oluşur. Oküler coloboma bilinen bu bozukluk 1 4-5000 canlı doğum ve yaygın olarak kasılır öğrenci göz^{4ortasına gelen çıkıntı bir anahtar deliği benzeri yapı olarak tezahür Pediatrik körlüğü % neden 3-11 dışında gerçekleşmesi için tahmin edilmektedir, 5,6}. Choroid yarığın geçmesi yarığın kenarlarında gemilerin⁷alın için sigorta optik bardağa büyüyen erken damarlara için bir giriş noktası sağlarlar işlevidir.

Oküler coloboma eski zamanlardan beri bilinen iken, biz son zamanlarda göz çift/dorsal yönünü etkileyen doku kaybı ile yeni bir alt coloboma hastaların belirledik. Son bizim laboratuvar çalışmalarında biz üstün oküler sulkus (SOS) veya üstün fissür⁸bakın Zebra balığı dorsal göz oküler yapısında keşif açmıştır. Yapı özellikleri bir sulkus ve bir çatlak olduğunu unutmamak gerekir. Benzer şekilde bir sulkus, o zamansal retina nazal yayılan bir sürekli doku katmanıdır. Buna ek olarak, yapısının kapatılması membran karşıt iki bir füzyon tarafından aracılı değil ve görünüşe göre hangi hücreleri tarafından Yapı doldurulur morfogenetik bir süreç gerektirir. Ancak, benzer bir çatlak, bu membran ile dorsal göz burun ve zamansal tarafında ayıran bir yapı oluşturur. Tutarlılık sağlamak için biz ona SOS Bu metinde sevk edecektir.

İmdat örümceklerle omurgalılar, balık, tavuk, newt ve fare⁸göz morfogenez sırasında görünür olmak arasında korunmuş. Zebra balığı içinde 20-60 saat sonrası döllenme (hpf) üzerinden mevcuttur, choroid yarığın aksine SOS 20-23 hpf kolayca görünür olmak son derece geçici ve yok 26 hpf⁸tarafından. Son araştırma laboratuarımızın içinde benzer şekilde choroid fissür, SOS bir rol göz morfogenez⁸sırasında damar rehberlikte oynar, buldu. Olsa da oluşumu ve SOS kapatılması kontrol faktörler henüz tam olarak anlaşılır değil, bizim veri genler⁸biçimlenme ventral dorsal göz için rolleri vurgulamak.

Zebra balığı SOS çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Bir modeli sistem olarak bir çok göz geliştirme eğitim avantaj sağlar: omurgalı bir model; her nesil sergileyen yüksek verimlilik (~ 200 embriyo); genomunu tam olarak, hangi genetik manipülasyon kolaylaştırır sıralı; ve insan genlerinin yaklaşık % 70'i en az bir Zebra balığı orthologue, yapım o bir ideal genetik tabanlı modeli insan hastalık^9,10. En önemlisi, onun gelişme dışarıdan anneye gerçekleşir ve onun larva göreceli kolaylığı¹¹ile gelişmekte olan göz görselleştirme için sağlayan şeffaf,.

Bu iletişim kuralları kümesi içinde hangi aracılığıyla SOS Zebra balığı larva görselleştirildiği teknikleri açıklar. Bu raporda kullanılan görselleştirme teknikleri çeşitli sos sırasında normal göz kalkınma açık gözlem yanı sıra SOS kapatma hataları algılama yeteneğini sağlayacak. Bizim örnek protokolleri Gdf6 araştırmalar yer alacak, bir BMP dorsal için yerelleştirilmiş göz ve SOS kapatma bilinen regülatörü. Ayrıca, bu teknikleri genetik faktörler veya uygun SOS oluşumu ve kapatma etkiler farmakolojik ajanlar tanımlamak için deneysel manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Ayrıca, biz deneyci SOS çevreleyen hücreleri morfolojik değişiklikler gözlemlemek izin veren bir protokol üzerinden mümkündür, tüm hücre zarlarında floresan görüntüleme dahil ettik. Amacımız bilimsel topluluk gelişmekte olan göz bu roman yapısı yeni görüşler sunmak için kullanılan standart iletişim kuralları kümesi oluşturmaktır.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada University of Alberta hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. Protokolü 1: Görsel olarak kullanarak stereomicroscopy ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme SOS

1. Embriyo koleksiyonu
   1. Dechlorinated su tankında bir erkek Zebra balığı dişi bir Zebra balığı ile eşleyerek akşam gdf6a^{+ /-} Zebra balığı haçlar hazırlayın. Erkek dişi--dan embriyo küçük bir zaman aralığı içinde doğarlar emin olmak için bir ayırıcı kullanarak ayırın emin olun.
   2. Ertesi sabah, bölücü çekin ve 30 dk. toplamak daha Petri yemeklerinde E3 medya, Zebra balığı kitap¹²açıklanan ile embriyo için artık üremeye Zebra balığı izin ve 28.5 ° C kuluçka makinesine koyun.
   3. Tüm döllenmemiş yumurta ve beyaz ve donuk görünür ölü embriyo kaldırın.
2. Hazırlık ve Zebra balığı embriyo canlı görüntüleme
   1. 20 hpf, Değiştir E3 medya %0,004 1-fenil 2-Tioüre (PTU pigment üretimi önlemek için) içeren E3 medya ile.
      Not: PTU adlı bir biraz daha timepoint, 22-24 hpf gibi ek görüntüleme saat erken yaşta embriyoların nedeniyle deneme müdahale mümkün değildir. Ancak, bu gibi bir grup SOS görüntüleme ile engelleyebilir dorsal göz altı çizilerek pigmentasyon pigmentasyon tamamen önlemek için erken embriyo tedavi etmek için önerilir.
   2. Tüm embriyoların gözlem zamanının önde gelen çeşitli noktalarda doğru gelişim dönemleri itibariyle olduğundan emin olun. Bu hangi somite numarası Kimmel vd.¹³tarafından belirtildiği gibi açıkça görülmeye başlıyor aşamalarında yapılır önerilir. Gelişimsel olarak olgunlaşmamış kaldırın.
   3. Embriyo bir diseksiyon mikroskop ve dechorionate altında embriyo yavaşça ince forseps kullanarak koryon ayrı çekerek yerleştirin. Dorsal gözünde SOS görselleştirin. İmdat göz dorsal kenar boşluğuna bir girinti görünebilir ve bir çizgi dorsal göz görünür olmalıdır. Normal SOS kapatılması için embriyo çevresinde gözlemlemek 20-23 hpf. Gecikmeli SOS kapatma fenotipleri sınav için embriyo 28 gözlemlemek hpf veya daha sonra.
   4. SOS kapatma gecikme yok o göstermek embriyo sıralayın.
   5. Bu embriyoların diseksiyon mikroskop kullanarak fotoğraf için E3% 1'özel içeren bir petri hazırlayın. Hafifçe embriyo üzerinde özel yerleştirildiğinde, embriyo sarısı oturabilir miyim sığ bir delik oluşturmak için özel ortasına pislik. Bu embriyo bir eğik açıyla fotoğraflandı edilmektedir kaldığında olmadığını garanti eder.
   6. Embriyo %0,003 tricaine E3 ve özel yerinde yanal ile anestezi.
   7. Bir bileşik veya confocal mikroskop kullanarak embriyo resim için 35 mm Petri kabına genellikle sigara % 1 düşük erime noktası özel E3 küçük bir bolus içeren içine embriyo transfer (w/v). Hızlı bir şekilde yan yana ince Misina veya bir kirpik kullanarak embriyo getirin ve özel soğumasını bekleyin. Özel firma olduğunda, yeterli E3 özel kapsayacak şekilde çanağı içine dökün. Daha fazla bilgi için bkz:¹⁴Distel ve Köster.
      Not: ters bir mikroskop kullanarak Eğer embriyo bir cam-coverslip-alt tabak bardak karşı yerleştirilen olabilir ve o bir standart 20 X objektif lens görüntüsü.
   8. Bir su daldırma 20 x objektif lens bileşik mikroskop ile SOS görselleştirmek için kullanın. Görselleştirme, ardından hafifçe özel embriyo üzerinden çekin ve % 4 paraformaldehyde (PFA) düzeltmek veya geliştirmeye devam etmek için izin.

2. Protokolü 2: Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama

1. Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama: gün 1
   1. Eğer zaten bitmiş 1.2.3, adımda anlatıldığı gibi Dechorionate embriyo. Taze yapılmış %4 istenen timepoint, microcentrifuge tüpü embriyo fix PFA bir oda sıcaklığında (22-25 ° C) shaker 2 h için. Yıkama 1 x PBST 5 dk, dört kez.
      Not: gastrulasyon embriyo daha iyi dechorionation sonra çözebilir.
   2. 5 dk. kuluçka süresi embriyoların sabit gelişimsel sahnede bağlıdır için oda sıcaklığında 10 mg/mL İndinavir K embriyo permeabilize (bkz: Thisse ve Thisse¹⁵).
   3. Yıkama 1 x PBST 5 dk, dört kez.
   4. Embriyo % 5 keçi serum ve 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) 1xPBST için 1-2 h bir oda sıcaklığında shaker içinde bir çözümde engelleyin.
   5. Birincil antikor çözüm tavşan anti-laminin antikor, 1: 200 seyreltme blok çözümde sulandrarak hazırlayın.
   6. Gecede 4 ° C shaker üzerinde anti-laminin birincil antikor embriyo kuluçkaya.
2. Bütün Dağı immünfloresan laminin boyama: 2 gün
   1. 1 yıkama x PBST 15 dakika, beş kez.
   2. Keçi Anti-tavşan Alexa Fluor 488 antikor 1 sulandrarak ikincil antikor çözüm hazırlamak x PBST 1: 1000 seyreltme için.
      Not: Farklı bir ikincil antikor kullanarak deneyci için kullanılabilir kaynakları uygun için bu adımı uyum sağlamak mümkündür.
   3. Gecede 4 ° C shaker üzerinde ikincil antikor embriyo kuluçkaya. Bu adımdaki itibaren mümkün olduğu kadar gelen ışık kalkan.
   4. 1 yıkama x PBST 15 dakika, dört kez. Embriyo gerekirse 4 ° C'de için bir haftaya kadar saklanabilir.
3. Diseksiyon ve embriyonik gözleri montajı
   1. İsterseniz, küçük bir kabında embriyo yerleştirin ve embriyo 1 deyolk x PBST. Nazikçe sarısının iyi Forseps ile kesintiye ve hafif sarısı sac kazıma ile sarısı hücreleri kaldırarak bunu.
   2. PBS-gliserol serisi çözümleri microcentrifuge tüpler içinde aşağıdaki konsantrasyonları hazırlamak: PBS % 30, % 50 ve % 70 gliserol. % 30 gliserol/PBS, üstünde tepe-in belgili tanımlık eriyik ve az önceki çözüm mümkün olduğunca transfer embriyoların yerleştirdiğinizden emin yapım içine embriyo transfer. Tüp altına batmaya embriyo bekleyin.
   3. Embriyo dibe battı, onları % 50 gliserol/PBS aktarın. Tekrarlayın ve % 70 gliserol/PBS için transfer.
   4. Bir kez embriyoların % 70 gliserol/PBS içinde battı, küçük bir plastik tabak gruptakiler için taşımak.
   5. Arka beyin için posterior embriyo sever ve posterior doku Genotipleme için kullanın.
   6. Baş mümkün olduğunca küçük gliserol olarak aktarılması bir cam slayt için hareket ettirin. Forseps veya diğer ince diseksiyon araçları kafa sabit tutmak için posterior sonuna tutmak için kullanın. Yavaşça ön ventrikül anterior üzerinden yerleştirin ve sağ ve sol yarım baş birbirinden ayırmak için aşağı doğru itin için iyi minutien PIN veya diğer ince diseksiyon araçları kullanın. Bu özafagusu orta ve arka beyin ventrikül içine aslında baş aşağı orta hat fileting hareket ederken işlemi yineleyin. Bu göz ve böylece İmdat hasarsız bırakarak çevreleyen doku manuel manipülasyon en aza indirir.
   7. Her iki tarafında aşağı, göz baş orta hat binin. Pozisyon dört köşe (bir uygun mesafe kullanılan coverslip için) vakum yağ mesajları ve cam coverslip ile kapak, sırayla her yazı üzerine coverslip kadar iterek örnekleri ile temas. Gliserol coverslip ve slayt arasındaki boşluğu doldurma altında çekilir böylece % 70 gliserol coverslip kenarında pipet.
   8. Bir gün veya mühür coverslip oje ve tırnak cilası sadece kuruduktan sonra resim örnekleri ile çevresinde örnek. Karanlıkta 4 ° C'de depolayın

3. Protokolü 3: Görselleştirme , SOS kullanarak eGFP-CAAX mRNA

1. EGFP-CAAX mRNA sentezi
   1. 37 ° C'de 4 saat boyunca 1 mg 40 mL tepki hacmine pCS2-eGFP-CAAX plazmid¹⁶ NotI linearize
   2. Kısıtlama Özet reaksiyonu durdurmak için 10 mL RNase ücretsiz su, 2.5 mL % 10 SDS ve 2.0 mL ilave 10 mg/mL İndinavir K.
   3. 50 ° C'de 1 saat kuluçkaya
   4. Aşağıdaki reaksiyon ekleyin (Toplam birim 200 mL) ve sonraki adıma geçin: 50 mL RNase ücretsiz su, 20 mL 3 M sodyum asetat pH 5.2 ve 75.5 mL RNase ücretsiz su
      Not: Sodyum asetat aşırı sulanma önlemek için iki ayrı durumlarda RNase free su eklenir.
2. DNA'ın arıtma fenol/kloroform çıkarma ve etanol yağış aracılığıyla
   1. 200 mL fenol: kloroform: izoamil alkol ve girdap 20 s. ayrı için Santrifüjü 18.000 x g, sulu ve organik aşamalardan 5 min için ekleyin.
   2. Üst sulu katmana alt organik tabaka transferini önlemek emin bir yeni microcentrifuge tüp için transfer. Kloroform eşit bir hacmi yeni tüp ekleyin.
      Not: Kloroform eklenmesi isteğe bağlıdır, ancak bu örnekten fenol tümüyle kaldırılmasını sağlamak için önerilir.
   3. Girdap 20 s. ayrı Santrifüjü 18.000 x g, sulu ve organik aşamalardan 5 min için.
   4. Daha önce olduğu gibi üst sulu katmana alt organik tabaka transferini önlemek emin bir yeni microcentrifuge tüp için transfer.
   5. 3 M sodyum asetat pH 5.2 hacmi 1/10 ekleyin.
   6. DNA 18.000 x g 4 ° C'de 20 dk de 15 dk. santrifüj-20 ° C'de % 100 RNase free etanol ve chill 3 cilt ekleyerek çökelti Bir Pelet görünür olmalıdır. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
   7. Pelet 100 mL etanol/RNase-Alerjik soğuk % 70 su ile yıkayın. Pelet gevşek kırmak için hafifçe karıştırdıktan sonra 18.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi Bir Pelet görünür olmalıdır. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
   8. 5 min için Pelet kurumasına ve DNA 7 mL suda resuspend.
      Not: Pelet bağlı olarak hava akımı temin 5 dk daha uzun süre kuru gerekebilir.
3. Transkripsiyon ve eGFP-CAAX mRNA arıtma
   1. RNase ücretsiz bir şekilde vitro transkripsiyon reaksiyon arıtılmış doğrusallaştırılmış plazmid DNA adım 3.2 elde edilen yaklaşık 1 mg kullanarak ticari olarak mevcut Sp6 RNA polimeraz kiti ile hazırlayın. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
      Not: Sp6 RNA polimeraz kepli mRNA üretimi için kullanılması gerekir.
   2. Dnaz 1 mL ekleyin (2 U/mL; RNase free) ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
   3. Piyasada bulunan herhangi bir RNA arıtma kiti ile mRNA arındırmak. Aliquot tekrarlanan donma-çözülme önlemek ve-80 ° C'de depolamak için mRNA
4. Enjeksiyon ve görselleştirme
   1. Embriyo elde etmek protokol 1. 1'belirtildiği gibi.
   2. Mikroenjeksiyon cihazları kullanarak, eGFP-CAAX mRNA 300 pg 1-hücre aşamada enjekte et.
   3. EGFP gözünde bir floresan stereoscope kullanarak parlak ifade ile embriyo için ekran.
   4. Embriyo Protokolü 1.2 ile açıklandığı gibi görüntü.
   5. Alternatif olarak, dechorionate ve embriyoların istenen timepoint %4 düzeltmek için 4 saat oda sıcaklığında veya gecede 4° C'de PFA Embriyolardan 1 x 5 min için PBST, dört kez ve dechorionate, daha önce yapılırsa yıkayın. Gözleri teşrih ve protokol 2.3 içinde açıklandığı gibi slaytlarda mount.

Sonuçlar

20, Zebra balığı SOS görünür hpf meşru dorsal retina⁸. İlk dar mimarisi 23 hpf İmdat geçiş için geniş bir girinti ve 26 tarafından hpf artık görünür⁸olduğunu. Bu nedenle, normal Zebra balığı göz geliştirme sırasında SOS incelemek için embriyo arasında 20-23 hpf uyulmalıdır. Bu dönemde, gözlemlenebilir diseksiyon mikroskop ve DIC görüntüleme gelişmekte olan retina (şekil 1) bu...

Tartışmalar

Burada, standart bir dizi gelişmekte olan Zebra balığı embriyo SOS gözlemlemek için protokolleri mevcut. Kapatma gecikmesi fenotipleri belirlemek için bizim iletişim kuralları yeteneği göz choroid fissür kapatma gecikme görselleştirmek için kullanılan teknikler için benzer burun dorsal ve zamansal dorsal tarafında iki ayrı lobları ayrılması ayırt odaklı olması fenotipleri ventral gözünde.

Bu görselleştirme teknikleri inhibe veya rolleri SOS kapatılması içinde ç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017