Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Résumé

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Résumé

Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.

Introduction

La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale¹. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes². Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique³. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 11 % de la cécité pédiatrique, communément se manifestant par une structure de type trou de serrure qui fait saillie inférieurement de l’élève au centre de l’oeil^{4, 5,6}. La fonction de la fissure choroïde est de fournir un point d’entrée pour début vascularisation de plus en plus dans la cupule optique, après quoi les côtés de la fissure vont se fusionnent pour enfermer les vaisseaux⁷.

Alors que le colobome oculaire est connu depuis les temps anciens, nous avons récemment identifié un nouveau sous-ensemble de colobome patients avec perte de tissu qui affectent l’aspect supérieur/dorsale de le œil. Des travaux récents dans notre laboratoire a conduit à la découverte d’une structure oculaire dans le œil de poisson-zèbre dorsale, que nous appelons le sillon oculaire supérieur (SOS) ou fissure supérieure⁸. Il est important de noter que la structure présente des caractéristiques d’un sillon tant une fissure. Semblable à un sillon, c’est une couche de tissu continu qui s’étend de la nasale de la rétine temporale. En outre, la fermeture de la structure n’est pas véhiculée par une fusion des deux s’opposant à membrane basale, et il semble avoir besoin d’un processus morphogénétique par lequel la structure est remplie de cellules. Cependant, comme dans une fissure, il forme une structure qui sépare les parties nasales et temporelles de le œil dorsale avec la membrane basale. Par souci de cohérence, nous appellerons à elle comme SOS dans ce texte.

Le SOS est évolutivement conservée à travers des vertébrés, étant visible durant la morphogenèse oeil de poisson, poussin, Triton et souris⁸. Contrairement à la fissure choroïde, qui est présente de 20 à 60 heures après la fécondation (hpf) chez le poisson zèbre, le SOS est très transitoire, étant facilement visible de 20-23 hpf et absent par 26 hpf⁸. Des études récentes dans notre laboratoire ont révélé que, semblable à la fissure choroïde, le SOS joue un rôle dans une conduite vasculaire au cours de le œil la morphogenèse⁸. Bien que les facteurs qui contrôlent la formation et la fermeture du re ne sont pas encore totalement comprises, nos données mettent en évidence les rôles pour oeil dorsal-ventral patterning gènes⁸.

Poisson zèbre est un organisme d’excellent modèle pour étudier la SOS. Comme système modèle, il fournit un certain nombre d’avantages dans l’étude de développement de le œil : C’est un modèle de vertébrés ; chaque génération présente forte fécondité (~ 200 embryons) ; son génome a été entièrement séquencé, ce qui facilite la manipulation génétique ; et environ 70 % des gènes humains ont au moins un orthologue de poisson-zèbre, ce qui en fait un modèle idéal de base génétique des maladies humaines^9,10. Plus important encore, son développement se déroule à l’extérieur à la mère, et ses larves sont transparentes, ce qui permet la visualisation de le œil en développement avec la facilité relative de¹¹.

Dans cet ensemble de protocoles, les auteurs décrivent les techniques à travers lequel le SOS peuvent être visualisées dans des larves de poisson zèbre. La variété des techniques de visualisation utilisé dans le présent rapport permettra l’observation claire du re au cours du développement de l’oeil normal, ainsi que la capacité de détecter les défauts de fermeture de SOS. Nos protocoles d’exemple mettra en vedette des enquêtes de Gdf6, un BMP localisée à la partie dorsale oeil et régulateur connu de fermeture de SOS. En outre, ces techniques peuvent être associés à des manipulations expérimentales afin d’identifier les facteurs génétiques ou des agents pharmacologiques qui affectent la fermeture et la bonne formation de SOS. En outre, nous avons inclus un protocole par lequel l’imagerie fluorescente de toutes les membranes cellulaires est possible, permettant à l’expérimentateur d’observer les changements morphologiques pour les cellules qui entourent les SOS. Notre objectif est d’établir un ensemble de protocoles normalisés qui permet d’offrir de nouvelles perspectives sur cette nouvelle structure de l’oeil en développement dans l’ensemble de la communauté scientifique.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme.

1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel

1. Collecte des embryons
   1. Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a^+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oubliez pas de séparer le mâle de la femelle à l’aide d’un diviseur pour s’assurer que les embryons sont nés dans une gamme limitée de temps.
   2. Le lendemain matin, enlever l’et laisser le poisson-zèbre à reproduire pour ne plus que 30 min. recueillir les embryons dans des boîtes de pétri avec les médias de l’E3, décrits dans le livre du poisson-zèbre,¹²et placez-les dans un incubateur à 28,5 ° C.
   3. Enlevez tous les œufs non fécondés ou des embryons morts, qui apparaîtront blanche et opaque.
2. Préparation et vivre-imagerie des embryons de poisson-zèbre
   1. À 20 hpf, remplacer l’E3 media avec E3 media contenant 0,004 % 1-phényl 2-thiourée (PTU) pour empêcher la production de pigments.
      Remarque : L’ajout de PTU à un validant un peu plus tard, comme les 22-24 hpf, est peu susceptible d’interférer avec l’expérience en raison de l’âge de l’embryon à l’époque de l’imagerie. Toutefois, il est recommandé de traiter les embryons tôt afin d’éviter complètement la pigmentation il y a une bande de pigmentation qui apparaît dans l’oeil dorsal, qui peut interférer avec l’imagerie du re.
   2. S’assurer que tous les embryons sont aux stades du développement corrects en divers points menant au moment de l’observation. Il est recommandé que cela se fait au stade à laquelle somite nombre est clairement visible tels que décrits par Kimmel et al.¹³. Supprimer celles qui sont immatures développemental.
   3. Placer les embryons sous un microscope à dissection et dechorionate les embryons en tirant doucement le chorion à l’aide de pinces fines. Visualiser les SOS dans l’oeil dorsal. Le SOS peut apparaître comme une mise en retrait à la marge dorsale de le œil, et une ligne doit être visible à travers le œil dorsale. Pour la fermeture normale de SOS, observez les embryons à autour de 20-23 hpf. Pour l’examen des phénotypes de fermeture retardées SOS, observez les embryons à 28 hpf ou version ultérieure.
   4. Trier les embryons qui montrent le retard de fermeture de SOS de ceux qui ne le font pas.
   5. Pour photographier ces embryons à l’aide d’un microscope à dissection, préparer une boîte de pétri contenant 1 % d’agarose dans E3. Légèrement piquer au centre de l’agarose à créer un trou peu profond dans lequel le jaune de l’embryon peut s’asseoir lorsque l’embryon est placé sur l’agarose. Cela garantira que l’embryon n’est pas à un angle oblique quand se faire photographier.
   6. Anesthésier les embryons avec tricaïne 0,003 % en E3 et place latéralement sur l’agarose.
   7. Pour les embryons à l’aide d’un microscope confocal ou de composés d’images, transférer l’embryon dans 35 mm boîte de pétri contenant un petit bolus de non-gélifié 1 % agarose low-melting point en E3 (p/v). Rapidement la position de l’embryon latéralement à l’aide d’une ligne de pêche fine ou un cil et attendre l’agarose à refroidir. Une fois que l’agarose est ferme, verser suffisamment E3 dans le plat pour couvrir l’agarose. Pour plus de détails, voir Distel et Köster¹⁴.
      Remarque : Si vous utilisez un microscope inversé, l’embryon peut être placé contre la vitre d’une lamelle couvre-objet-fond en verre plat et photographié avec un standard 20 X lentille de l’objectif.
   8. Utiliser une lentille d’objectif eau immersion 20 x pour visualiser le SOS avec un microscope composé. Après visualisation, doucement tirer l’agarose des embryons et difficulté à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) ou permettre de poursuivre leur développement.

2. protocole 2 : Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine

1. Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine : jour 1
   1. Dechorionate embryons tel que décrit à l’étape 1.2.3, si pas déjà fait. Difficulté des embryons dans un tube de microcentrifuge à la validant désirée dans fraîchement préparés 4 % PFA pendant 2 h sur un agitateur de la température ambiante (22-25 ° C). Laver à 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois.
      Remarque : Après la gastrulation, embryons peuvent fixer mieux après dechorionation.
   2. Permeabilize embryons à la protéinase K de 10 mg/mL à la température ambiante pour 5 min. temps d’Incubation dépendra du stade de développement où les embryons sont fixes (voir Thisse et Thisse¹⁵).
   3. Laver à 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois.
   4. Bloquer les embryons dans une solution de 5 % chèvre sérum et 2 mg/mL sérum albumine bovine (BSA) dans 1xPBST pendant 1-2 h sur un agitateur de la température ambiante.
   5. Préparer la solution de l’anticorps primaire en diluant des anticorps de lapin anti-laminine dans la solution du bloc à une dilution de 1 : 200.
   6. Incuber les embryons dans anti-laminin anticorps primaire pendant la nuit sur un agitateur de 4 ° C.
2. Entier-Montez la coloration par immunofluorescence de laminine : jour 2
   1. Laver à 1 x PBST pendant 15 minutes, cinq fois.
   2. Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant les anticorps de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 dans 1 x PBST à une dilution de 1/1000.
      Remarque : Il est possible d’adapter cette étape en fonction des ressources disponibles à l’expérimentateur en utilisant un anticorps secondaire différent.
   3. Incuber les embryons dans l’anticorps secondaire pendant la nuit sur un agitateur de 4 ° C. Protéger autant que possible de cette étape à partir de la lumière.
   4. Laver à 1 x PBST pendant 15 minutes, quatre fois. Les embryons peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine, si nécessaire.
3. Dissection et montage des yeux embryonnaires
   1. Si vous le souhaitez, placez les embryons dans une petite boîte de Pétri et deyolk les embryons dans 1 x PBST. Cela doucement perturbant le jaune d’oeuf avec une pince fine et éliminer les cellules de jaune d’oeuf par raclage doux du sac vitellin.
   2. Préparer les concentrations suivantes de solutions série PBS-glycérol dans des tubes de microcentrifuge : 30 %, 50 % et 70 % de glycérol dans du PBS. Transfert des embryons dans 30 % glycérol/PBS, en veillant à placer les embryons sur le dessus de la solution et transférer aussi peu de la solution précédente que possible. Attendez que les embryons à couler au fond du tube.
   3. Lorsque les embryons ont coulé vers le bas, transférez-les sur 50 % glycérol/PBS. Répéter et transfert à 70 % glycérol/PBS.
   4. Une fois que les embryons ont sombré dans 70 % glycérol/PBS, déplacez-les vers un petit plat en plastique pour les dissections.
   5. Rompre l’embryon postérieur pour le cerveau postérieur et utiliser le tissu postérieur pour le génotypage, si nécessaire.
   6. Déplacer la tête d’une lame de verre, transfert de glycérol peu que possible. Utiliser la pince ou autre outil de dissection fine se pour tenir sur l’extrémité postérieure de garder la tête immobile. Utilisez une épingle fine minutien ou autres outils de dissection fine pour insérer dans le ventricule du cerveau antérieur de la partie antérieure et pousser vers le bas pour séparer les moitiés droite et gauche de la tête de l’autre en douceur. Répétez cette opération tout en se déplaçant vers l’arrière dans le mésencéphale et le ventricule du cerveau postérieur, essentiellement fileting la tête vers le bas de la ligne médiane. Cela minimise la manipulation manuelle de le œil et des tissus environnants, laissant ainsi intact le SOS.
   7. Montez chaque côté de la ligne de médiane tête vers le bas, yeux vers le haut. Position de quatre postes de graisse sous vide au niveau des coins (une distance appropriée apart pour la lamelle couvre-objet utilisé) et couvrir avec une lamelle de verre, poussant vers le bas dans l’ordre sur chaque borne jusqu'à la lamelle entre en contact avec les échantillons. Pipetter 70 % glycérol au bord de la lamelle couvre-objet pour que le glycérol est tiré sous, remplissant l’espace entre la lamelle et la diapositive.
   8. Échantillons d’image dans une journée, ou le joint autour de la lamelle couvre-objet avec vernis à ongles et échantillons d’image qu’une fois le vernis à ongles est sèche. Stocker dans l’obscurité à 4 ° C.

3. Protocole n° 3 : Visualisation de SOS utilisant EGFP-Alpha ARNm

1. Synthèse de l’ARNm eGFP-Alpha
   1. Linéariser 1 mg d’Alpha-eGFP-Bureau2 plasmidique¹⁶ avec NotI dans un volume réactionnel de 40 mL pour 4 heures à 37 ° C.
   2. Pour arrêter la réaction de digérer de restriction, ajouter 10 mL de RNase-libre d’eau, 2,5 mL 10 % SDS et 2,0 mL 10 mg/mL protéinase K.
   3. Incuber 1 h à 50 ° C.
   4. Ajoutez le code suivant à la réaction (volume total 200 mL) et passez à l’étape suivante : 20 mL 3M sodium acétate pH 5,2 et 75,5 mL exempte de RNase eaux, 50 mL, RNase-libre
      Remarque : L’eau exempte de RNase est ajouté à deux reprises afin d’éviter une dilution excessive de l’acétate de sodium.
2. Purification de l’ADN par l’intermédiaire de précipitation d’extraction et d’éthanol de phénol/chloroforme
   1. Ajouter 200 mL d’alcool de phénol : chloroforme : isoamylique et vortex pour 20 s. séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation à 18 000 x g pendant 5 min.
   2. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge, en veillant à éviter le passage de la couche organique de fond. Ajouter un volume égal de chloroforme dans le nouveau tube.
      Remarque : L’ajout de chloroforme est facultatif, mais il est recommandé d’assurer le retrait complet de phénol de l’échantillon.
   3. Vortexer pendant 20 s. séparer les phases aqueuses et organiques par centrifugation à 18 000 x g pendant 5 min.
   4. Comme avant, transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge, en veillant à éviter le passage de la couche organique de fond.
   5. Ajouter 1/10 volume d’acétate de sodium 3M pH 5,2.
   6. Précipiter l’ADN en ajoutant 3 volumes de 100 % exempt de RNase éthanol et refroidissement à-20 ° C pendant 15 min. centrifuger à 18 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Un culot doit être visible. Décanter le liquide surnageant.
   7. Laver le culot avec 100 mL d’eau froide de l’éthanol/RNase-libre de 70 %. Après le mélange doucement pour détacher le culot, centrifuger à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Un culot doit être visible. Décanter le liquide surnageant.
   8. Sécher le culot pendant 5 min et remettre en suspension l’ADN dans 7 mL d’eau.
      Remarque : Le culot devrez peut-être être séchés pendant plus de 5 min selon le débit d’air disponible.
3. Transcription et purification d’ADN messagère eGFP-Alpha
   1. D’une manière sans RNase, préparer une réaction de transcription in vitro avec un kit de polymérase ARN Sp6 disponible dans le commerce, à l’aide d’environ 1 mg de plasmide linéarisé purifiée ADN obtenu à l’étape 3.2. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
      NOTE : L’ARN polymérase Sp6 doit être utilisé pour la production d’ARNm plafonnés.
   2. Ajouter 1 mL de DNase (2 U/mL ; RNase librement) et incuber 30 min à 37 ° C.
   3. Purifier les ARNm avec n’importe quel kit de purification d’ARN disponible dans le commerce. Aliquote l’ARNm pour éviter le gel-dégel répété et conserver à-80 ° C.
4. Injection et visualisation
   1. Obtenir des embryons comme indiqué au point 1.1 du protocole.
   2. En utilisant un appareil de microinjection, injecter 300 pg d’ADN messagère eGFP-Alpha au stade 1 cellule.
   3. Écran pour les embryons avec l’expression lumineuse d’eGFP dans les yeux à l’aide d’un stéréoscope de fluorescence.
   4. Les embryons d’image tel que décrit dans le protocole 1.2.
   5. Alternativement, les dechorionate et les embryons de fixer à la validant désirée dans 4 % PFA pendant 4 heures à température ambiante ou pendant la nuit à 4° C. Lavez les embryons dans 1 x PBST pendant 5 min, quatre fois et dechorionate, si pas déjà fait. Disséquer les yeux et les monter sur des lames comme décrit au point 2.3 de protocole.

Résultats

Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive⁸. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible⁸. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à disse...

Discussion

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.

Ces techniques de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017