Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

استخدام الثقافات المجسمة ثلاثية الابعاد لتصور المورفولوجية والعلامات الوظيفية للغده اللعابية قد توفر رؤى جديده في أليات تلف الانسجه بعد الإشعاع. الوصف هنا هو بروتوكول للقسم ، والثقافة ، والإشعاع ، وصمه عار ، وصوره 50-90 μm الغدد اللعابية سميكه الأجزاء قبل وبعد التعرض للإشعاع المؤين.

Abstract

يخلق التهاب الجفاف والتهابات الفموية مضاعفات مزمنة في الفم تقلل من نوعيه الحياة في مرضي سرطان الراس والرقبة الذين يعالجون بالعلاج بالاشعه. وقد ركزت النهج التجريبية لفهم أليات الخلل في الغدد اللعابية والترميم علي في نماذج الجسم الحي ، والتي تعوقها عدم القدرة علي الشاشة بشكل منهجي المرشحين العلاجية والكفاءة في النقل القدرة علي التلاعب الجينات محدده. والغرض من هذا البروتوكول الثقافة العضوية الغدد اللعابية لتقييم الوقت القصوى للحياة الثقافية وتميز التغيرات الخلوية بعد العلاج الإشعاعي السابق فيفو. استخدمنا تلطيخ النيون المناعي والمجهر البؤري لتحديد متى السكان خليه محدده وعلامات موجودة خلال فتره الثقافة 30 يوما. الاضافه إلى ذلك ، يتم تقييم العلامات الخلوية التي تم الإبلاغ عنها سابقا في نماذج الإشعاع المجرية في الثقافات التي يتم المشع السابقة الجسم. المضي قدما ، وهذا الأسلوب هو منصة جذابة للتقييم السريع السابق الجسم البشري من murine والإنسان الغدد اللعابية الاستجابات الانسجه للعوامل العلاجية التي تحسن وظيفة اللعابية.

Introduction

وظيفة الغدة اللعابية السليمة ضرورية لصحة الفم ويتم تغييرها بعد علاج سرطان الراس والرقبة مع المعالجة الاشعاعيه1. في 2017 ، تم الإبلاغ عن ما يقرب من 50,000 حاله جديده من سرطان الراس والرقبة في الولايات المتحدة2. بسبب الآثار الضارة للانسجه والتي لا رجعه فيها في كثير من الأحيان من العلاج الإشعاعي علي الانسجه الطبيعية المحيطة مثل الغدد اللعابية ، وغالبا ما تترك المرضي مع الآثار الجانبية الحاده وانخفاض نوعيه الحياة2،3، 4- المضاعفات الشائعة الناجمة عن الاضرار الاشعاعيه تظهر في اعراض مثل جفاف (الشعور الذاتي للفم الجاف) ، تسوس الأسنان ، ضعف القدرة علي مضغ وابتلاع ، وضعف الكلام ، والاصابه بالميكروبات الدقيقة عن طريق الفم2، 3 , 4. هذه الاعراض مجتمعه يمكن ان تؤدي إلى سوء التغذية وضعف البقاء علي قيد الحياة في الافراد المتضررين5. في حين ان خلل الغدد اللعابية في هذا العدد من السكان قد تم توثيقها جيدا, وقد تم التنازع أليات الكامنة وراء الاضرار التي لحقت خلايا اسينار, وهناك القليل من التكامل بين النماذج الحيوانية المختلفة6,7.

الأساليب الحالية لدراسة وظيفة الغدة اللعابية والاضرار الناجمة عن الإشعاع تشمل استخدام في نماذج الجسم الخلوي ، وخطوط الخلايا الخلد ، وثنائيه الابعاد (2-د) الثقافات الخلية الاوليه ، وثلاثي الابعاد (3-D) ساليسفيري الثقافات8، 9،10،11،12. تقليديا ، ونماذج ثقافة الخلية من خطوط الخلايا الخلد والثقافات ثنائيه الابعاد تنطوي علي خلايا أحاديه الطبقات مثقف علي الأسطح المسطحة وقيمه للتجارب سريعة وسهله وفعاله من حيث التكلفة. ومع ذلك ، فان ظروف ثقافة الخلايا الاصطناعية يمكن ان تغير حاله التمايز والاستجابات الفسيولوجية للخلايا المعرضة لظروف مختلفه ، وغالبا ما تفشل النتائج في الترجمة إلى نماذج الكائنات الحية كلها14،15. الاضافه إلى ذلك ، تتطلب ثقافات الخلايا الخلده تحويرا للنشاط p53 ، وهو أمر بالغ الاهميه لاستجابه الغدة اللعابية لتلف الحمض النووي16،17.

ساليسفيري ثقافات ثلاثية الابعاد للخلايا الجذعية والسلف في الوقت المبكر في الثقافة وكانت مفيده لفهم الحساسية الاشعاعيه لهذه المجموعة الفرعية من خلايا الغدد اللعابية9,18. ومن القيود الحاسمة لجميع هذه النماذج الثقافية انها غير فعاله في تصور الهيكل ثلاثي الابعاد للغده اللعابية ، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتفاعلات خلايا الخلايا علي مختلف الطبقات ، والتي تعتبر حاسمه في تحوير اللعابية إفراز15. الحاجة إلى طريقه التي تشمل سلوك الانسجه ككل ولكن يمكن أيضا ان يتم التلاعب بها في ظل الظروف المختبرية لدراسة اثار العلاج ضروري لمزيد من اكتشاف أليات الكامنة وراء الغدة اللعابية الناجمة عن الإشعاع الخلل.

وقد تم توثيق الانسجه الحية والثقافة في السابق19,20 وغالبا ما تستخدم لدراسة التفاعلات الانسجه الدماغ21. في الدراسات السابقة ، تم تقسيم نكفي (PAR) انسجه الغدد اللعابية من الفئران في ما يقرب من 50 μm ومثقف لتصل إلى 48 h ، وتحليل القدرة علي البقاء ، وموت الخلايا ، ووظيفة تم تنفيذها بعد ذلك19. Su et al. (2016) توسعت علي هذه المنهجية عن طريق زراعه الغدد فك الإنسان (SMGs) مقسمه علي 35 μm أو 50 μm لمده 14 يوما20. الطريقة المقترحة هي التقدم في انه يشمل كلا من الغدد اللعابية نكفي و فك في 50 μm و 90 μm وتقييم الثقافات لمده 30 يوما. القدرة علي قطع مجموعه من سماكه الانسجه أمر مهم في تقييم التفاعلات خليه خليه وخليه-ECM التي هي ذات الصلة للعمليات الخلوية بما في ذلك قطبيه الاساسيه الرمزية واللعاب لإفراز. وعلاوة علي ذلك ، تعرضت شرائح الغدد اللعابية للإشعاع اثناء وجودها في الثقافة لتحديد جدوى هذا النموذج الثقافي لدراسة تلف الغدد اللعابية المستحث بالإشعاع.

والغرض من هذا البروتوكول الثقافة العضوية الغدد اللعابية لتقييم الوقت القصوى للحياة الثقافية وتميز التغيرات الخلوية بعد العلاج الإشعاعي السابق فيفو. لتحديد الحد الأقصى من المقاطع الزمنيه التي هي قابله للحياة بعد تشريح ، تريلون الأزرق تلطيخ ، الحية تلطيخ الخلية ، و مناعي تلطيخ للموت الخلية تم تنفيذها. واستخدم المجهر البؤري المجهري وتلطيخ النيون المناعي لتقييم مجموعات الخلايا المحددة ، والهياكل المورفولوجية ، ومستويات الانتشار. كما تعرضت ثقافات قسم الانسجه للإشعاع المؤين لتحديد اثار الإشعاع علي علامات مختلفه في هذا النموذج ثلاثي الابعاد. وتمت مقارنه التحريض علي موت الخلايا ، واضطراب السيتوكيلميتال ، وفقدان علامات التمايز ، والانتشار التعويضي في ثقافات الجسم السابق المشعة بالدراسات السابقة للنماذج المجرية. وتوفر هذه المنهجية وسيله للتحقيق في دور تفاعلات الخلايا الخلوية بعد الاضرار الاشعاعيه وتوفر نموذجا تجريبيا لتقييم فعاليه التدخلات العلاجية بكفاءة (التلاعب بالجينات أو العوامل الدوائية ) التي قد تكون اقل ملاءمة للنماذج المجرية.

Protocol

1. اعداد الذبذبات

  1. رذاذ مكونات للانفصال من الذبذبات بما في ذلك صينية العازلة ، شفره المرفقات ، والعفن كتله الاغاروز ، والفيلم المختبر مع 70 ٪ الايثانول ، ثم الاشعه فوق البنفسجية تعقيم لمده لا تقل عن 30 دقيقه.
  2. وضع وتامين ورقه اضافيه من الفيلم المختبري علي الدرج العازلة لمنع الجليد من الوقوع فيها.
  3. ملء غرفه الجليد مع سحق الجليد ، وأزاله الفيلم المختبر من علبه العازلة ، وملء صينية العازلة مع 100 mL من الجليد الباردة 1x الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) حل تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين-امبيسلين (PSA).
  4. وضع شفره الحلاقة الفولاذ المقاوم للصدا في حامل النصل. استخدام مفك البراغي لتشديد/تخفيف وتغيير زاوية النصل.

2. اعداد عينه من الانسجه في كتله اجنشا والتماس باستخدام الذبذبات

  1. الاوتوكلاف جميع الاداات اللازمة تشريح والتعقيم بما في ذلك ملقط ، مقص ، والرسام.
  2. اعداد 3 ٪ نقطه انصهار منخفضه اجنشا في 1x العقيمة والميكروويف حتى يذوب في محلول. تاكد من ان الحل لا يغلي فوق ودوامه الزجاجة بشكل دوري لخلط.
    ملاحظه: منع المنخفضة ذوبان اجنشا من ترسيخ من خلال إبقائه في حمام الماء الدافئ. والسوائل منخفضه الذوبان هي السائل عند 37 درجه مئوية وتحدد في 25 درجه مئوية. ومع ذلك ، يجب ان يكون حمام المياه أدناه 40 درجه مئوية من أجل صب الاجثار حول الانسجه في درجه الحرارة الفسيولوجية.
  3. عزل الغدد اللعابية ووضع الانسجه تشريحها في 2 مل الجليد الباردة 1x تلفزيوني تستكمل مع 1 ٪ PSA في العقيمة ، 30 ملم طبق الثقافة.
  4. باستخدام ملقط الاوتوكلاف ، وأزاله الغدد اللعابية من 1x تلفزيوني + 1 ٪ PSA الحل والموقف في الجزء السفلي من العفن التضمين. ملء العفن مع السائل 3 ٪ نقطه انصهار منخفضه اجنشات لتغطيه الانسجه.
  5. باستخدام ملقط ، وضبط الانسجه إلى منتصف كتله ووضع الغدة اللعابية في الطائرة المناسبة. أفضل المقاطع العرضية لفك والغدد النكفية هي في الطائرة العمودية.
  6. مكان اجبرز كتله علي الجليد لمده 10 دقيقه لتتصلب.
  7. بعناية تشغيل شفره الحلاقة حول الحافة الخارجية من اجنشا لتخفيف والسماح للكتلة تنزلق علي الفيلم المختبر الاشعه فوق البنفسجية تعقيمها من الخطوة 1.1.
  8. استخدام شفره الحلاقة لقطع مربع اجبرز التي تحتوي علي الغدة اللعابية. تاكد من ان الطائرة من القسم مستقيمة وموازيه للجانب المعاكس من كتله (السطح الذي سيتم لصقها أسفل). منذ الاغاروزها لا يتسلل الانسجه ، لا تقليم قباله الكثير من اجنشا حول الانسجه بحيث سيتم دعم الانسجه بشكل جيد.
  9. استخدام الغراء الفائق لإرفاق كتله إلى سطح القطع.
  10. القسم في 50 μm أو 90 μm سمك بواسطة الذبذبات بسرعة 0.075 مم/ثانيه وتردد 100 هرتز.
    ملاحظه: اعداد الذبذبات علي اعلي تردد وادني سرعه شفره يوفر شرائح الأمثل.
  11. جمع المقاطع في طبق ثقافة الانسجه 24 حسنا التي تحتوي علي ~ 1 مل الجليد الباردة لكل بئر باستخدام الاوتوكلاف ، فرشاه الشعر الطبيعي ، ووضع الفرشاة في 70 ٪ الايثانول بين مجموعات شريحة للحفاظ علي العقم.

3. مقاطع الخياطة

  1. الاوتوكلاف ملعقة صغيره وملقط.
  2. جعل الأوراق المالية الثقافة الذبذبات مع أو بدون مصل البقري الجنينية: DMEM/F12 وسائل الاعلام تستكمل مع 1 ٪ PSA ، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين ، 1.1 μM هيدروكورتيزون ، 0.1 μM حمض الريتينويك ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 80 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة ، 5 ملم L-الجلوتامين ، 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين كبريتات ، و 10 μL/mL خليط عنصر الأثر. أضف مبلغا مناسبا لهذا الأمر لجعل 0% ، 2.5% ، 5.0% ، أو 10% حلول.
  3. قبل التماس ، أضافه 300 μL من وسائل الاعلام قبل تسخينها ووضع 12 ملم قطرها ، 0.4 μm المسام حجم الغشاء ادراج في كل بئر من لوحه ثقافة الانسجه 24 جيدا. يجب ان تصل وسائل الاعلام إلى أسفل الغشاء لإنشاء واجهه سائله للثقافة.
  4. وضع برفق المقاطع اللعابية علي راس الغشاء ادراج باستخدام ملعقة صغيره والثقافة في 37 درجه مئوية في ترطيب 5 ٪ CO2 و 95 ٪ الهواء الغلاف الجوي حاضنه.
    1. أضافه تقريبا 300 μL وسائط الثقافة الاساسيه في البئر وقطرات قليله في ادراج الغشاء (تقريبا 40 μL) كل يوم أو حسب الحاجة. وأظهرت الزراعة السليمة ان الخلايا قادره علي البقاء علي قيد الحياة والحفاظ عليها لمده تصل إلى 30 يوما الجسم الحي السابق.

4. تشعيع أقسام الغدد اللعابية

  1. معالجه المقاطع بجرعة واحده من الإشعاع (5 غراي) باستخدام الكوبالت-60 (أو ما يعادلها) المشع.
    1. أقسام النقل إلى منشاه المشع باستخدام حاويه الستايروفوم مغطاه لتجنب التقلبات في درجه الحرارة. الاضافه إلى ذلك ، يجب توخي الحذر اثناء النقل مره أخرى إلى الحاضنة المختبرية للتاكد من ان وسائل الاعلام لا دفقه علي غطاء الثقافة والحث علي التلوث.
    2. وضع لوحه 24 بئر تحتوي علي أقسام الغدد اللعابية 80 سم من مصدر الإشعاع ، في وسط 32 "س 32" حقل الإشعاع. وسوف تختلف حسابات الجرعة الاشعاعيه والوقت المناظر في المبرد بواسطة الاداه والكوبالت-60 تسوس.
  2. مواصله رصد وزراعه هذه الأقسام علي النحو المبين في القسم 3.

5. القدرة علي البقاء تلطيخ

  1. يستنشق وسائل الاعلام القديمة وغسل شرائح مرتين مع معقمه ، قبل الإحماء 1x تلفزيوني.
  2. الأقسام وصمه عار مع صبغ الأزرق التريلون.
    1. استخدم ملعقة صغيره لتحريك الشريحة من الثقافة إلى شريحة زجاجيه.
    2. أضف 0.4% من المحلول الأزرق التريبين إلى شريحة الذبذبات مع حجم كاف لتغطيه الانسجه (10 – 20 μL).
    3. احتضان الشرائح في درجه حرارة الغرفة (RT) في التريتان الأزرق لمده 1 – 2 دقيقه لصبغ لاختراق الانسجه. الخلايا غير القابلة للحياة ستكون ملطخه باللون الأزرق ، ستكون الخلايا القابلة للحياة غير ملطخه.
  3. المقاطع وصمه عار مع calcein ، AM صبغ الخلية الحية.
    1. أضافه كميه كافيه من وصمه عار لتغطيه القسم في بئر واحده من 24 جيدا-لوحه (200-300 μL).
    2. احتضان الشرائح في RT لمده 15 دقيقه للسماح باختراق الصبغة.
    3. قم بازاله المقطع بعناية من البئر ووضعه علي شريحة زجاجيه. جبل شرائح مع 1 قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة.
    4. مقاطع الصورة علي المجهر الفلورسنت في الاثاره/الانبعاثات الموجية من 488 نانومتر و 515 nm.

6. الأجسام المضادة تلطيخ المقاطع الذبذبات

ملاحظه: يوفر التالية بروتوكول تلطيخ الأجسام المضادة العامة المحددة ل Ki-67; ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع اي الأجسام المضادة. يتم اجراء جميع يغسل في RT ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. في طبق ثقافة الانسجه متعددة الآبار ، يستنشق قباله وسائل الاعلام ويغسل 2x علي الأقل مع 1x العقيمة تلفزيوني.
  2. إصلاح المقاطع باستخدام 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. يستنشق قباله 4 ٪ PFA ويغسل 3x مع PBT [1x تلفزيوني ، 1 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) ، 0.1 ٪ تريتون X-100].
    ملاحظه: يمكن تخزين المقاطع في 1x تلفزيوني في 4 درجه مئوية والملون في وقت لاحق. الحد الأقصى لوقت التخزين الذي تم اختباره في هذه المخطوطة هو 3 أسابيع. وقت تخزين أطول سوف تحتاج إلى الأمثل من قبل المستخدم الفردي إذا كان ذلك مطلوبا.
  4. يتخلل المقاطع باستخدام 0.3 ٪ تريتون X-100 في 1x تلفزيوني لمده 30 دقيقه.
    ملاحظه: يمكن تعديل هذه الخطوة وتحسينها لتلطيخ الأجسام المضادة المحددة والتغلغل.
  5. Pipet قباله حل التغلغل.
  6. غسل شرائح 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني ، 1 ٪ بوسنيا ، و 0.1 ٪ تريتون X-100 (PBT).
  7. منع الشرائح مع عامل الحجب مع 1 ٪ المصل الماعز العادي لمده 1 ساعة.
  8. غسل الشرائح 3x لمده 5 دقائق مع PBT.
  9. احتضان الشرائح بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية مع 500 μL المضادة لKi67 أرنب الأضداد الاحاديه الجسم المخفف في 1 ٪ جيش الصرب البوسنيين في 1x تلفزيوني.
    ملاحظه: لتلطيخ phسبائك ، تخطي الخطوة 6.9 والمضي قدما باستخدام بروتوكول لل phمسبوك معينه المستخدمة. لمضاد الحمض النووي ، انتقل إلى الخطوة 6.15.
  10. يستنشق المضادة لKi67 أرنب الأجسام الأضداد الاحاديه.
  11. غسل الشرائح 6x لمده 5 دقائق في 1x تلفزيوني.
  12. احتضان الشرائح في 500 μL من فلوريسسينتلي مترافق الأجسام المضادة الثانوية متوافقة مع الأجسام المقاومة لKi67 المخفف في 1 ٪ جيش صرب الجمهورية في 1x تلفزيوني في RT ل 1.5 h مغطاه من الضوء.
    ملاحظه: استنادا إلى الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة ، يمكن زيادة تحسين وقت الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية من قبل المستخدم الفردي. الاضافه إلى ذلك ، فان الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. يجب ان يتم تنفيذ جميع يغسل اللاحقة في الظلام.
  13. يستنشق الأجسام المضادة الثانوية.
  14. غسل شرائح ل 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
  15. غسل الشرائح لمده 5 دقائق في الماء منزوع الأيونات.
  16. شرائح مضاده للبقع مع DAPI (1 ميكروغرام/مل) لمده 20 دقيقه في RT.
  17. غسل الشرائح (مره واحده) لمده 5 دقائق في الماء منزوع الأيونات.
  18. شرائح الجبل مع قطره واحده (~ 40 μL) من وسائل الاعلام المتصاعدة. لتجنب الفقاعات الزائدة ، ضع المشبك ببطء علي الوسائط المتصاعدة علي الشريحة ، بدءا من زاوية 45 درجه.
    1. لمنع سحق المقاطع سميكه مع coverslip ، جبل كل شريحة مع فاصل. يمكن إنشاء فاصل عن طريق وضع حافه من الشحوم فراغ في مربع حول القسم الانسجه.
    2. عند وضع المشبك ، يمكن ختم حواف المشبك بالشحوم الفراغية. اضغط لأسفل علي حواف المشبك مع الإبهام لتلتزم بحزم علي الشريحة. بدلا من ذلك ، ختم كوفيرسليب علي شريحة المجهر باستخدام طلاء الأظافر واضحة.

7. التصوير المقاطع الذبذبات

  1. صوره الشرائح الملونة في غضون 5 أيام من تلطيخ.
  2. الحصول علي أقسام بصريه من شرائح الذبذبات الملونة باستخدام المجهر البؤري. مع المجهر البؤري ، الحصول علي z-كومه في حجم خطوه محدده أو اتخاذ الصور الفردية اعتمادا علي تصميم المستخدم التجريبية. يمكن فحص الصور علي اي شاشه كمبيوتر بعد التجميع البؤري.
    ملاحظه: نظرا لسماكه شرائح الذبذبات ، فمن المستحسن ان يتم استخدام المجهر البؤري أو نطاق مع القدرة علي المكدس z لتصور التفاصيل داخل العينات. للصور المستخدمة في هذه المخطوطة ، تم استخدام هدف النفط 63x ؛ ومع ذلك ، يمكن تصميم هذا وتعديله بشكل أكبر من قبل المستخدم الفردي والنطاق المحدد المستخدم. تم استخدام دقه البكسل الموصي بها لكل عامل الهدف والتكبير/التصغير مع أخذ عينات نيكويست المفترضة من 2.5 بكسل في X و Y لأصغر بنيه قابله للحل البصري. ومع ذلك ، يقترح بعض المعلقين 2.3 بكسل ، بينما يقترح آخرون 2.8 بكسل. يرجى الرجوع إلى دليل المجهر البيولوجي البؤري22 للحصول علي مزيد من التفاصيل حول كيفيه اجراء هذه الحسابات.

النتائج

تزرع الثقافات الاساسيه ثنائيه الابعاد في مصل الأبقار الجنيني (الذي تمت الاضافه اليه) في حين يتم استزراع الثقافة الاساسيه ثلاثية الابعاد ساليسفيري عاده في الظروف الخالية من المصل10,11. بالاضافه إلى ذلك ، فان الدراستين السابقتين باستخدام ثقا...

Discussion

وقد استخدمت أبحاث الغدد اللعابية عددا من النماذج الثقافية ، بما في ذلك الثقافات الدفينة ثنائيه الابعاد ، والثقافات الاساسيه ثنائيه الابعاد ، والثقافات ساليسفيري ثلاثية الابعاد ، وثقافات الأعضاء ثلاثية الابعاد من المفسرين الجنينيين للتاكد من الاسئله حول علم الاحياء وقد أثمرت هذه النماذ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل جزئيا التمويل التجريبي الذي قدمه مكتب جامعه اريزونا للبحوث والاكتشاف والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DE023534) إلى كريستين ليمسو. وقدمت منحه التدريب علي البيولوجيا السرطانية ، T32CA009213 ، دعما لمكافاه ون يو وونغ. ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا السيد رايس علي مساهمته التقنية القيمة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vibratome VT1000SLeica BiosystemsN/AVibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor BladesElectron Microscopy Sciences72000
AgaroseFisher ScientificBP165-25Low-melt
ParafilmSigma-AldrichP6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin BLonza17-745HPSA
24-well plateCellTreat229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SuperglueLoctiteN/APurchased at hardware store
Natural Red Sable Round PaintbrushPrinceton Art & Brush Co7400R-2
Gentamicin SulfateFisher ScientificICN1676045
TransferrinSigma-AldrichT-8158-100mg
L-glutatmineGibco25030-081
Trace ElementsMP BiomedicalsICN1676549
InsulinFisher Scientific12585014
Epidermal Growth FactorCorning354001
HydrocortisoneSigma-AldrichH0888
Retinoic acidFisher ScientificR2625-50MG
Fetal Bovine SerumGibcoA3160602
DMEM/F12 MediaCorning150-90-CV
Millicell Cell Culture InsertMillipore SigmaPICM0125012 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan BlueSigma-AldrichT8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)Thermo-FisherR37601Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 AntibodyCell Signaling Technology9129S
Anti-E-cadherin AntibodyCell Signaling Technology3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 AntibodyCell Signaling Technology9661L
Anti-SMA AntibodySigma-AldrichC6198
Anti-amylase AntibodySigma-AldrichA8273
Anti-CD31 AntibodyAbcamab28364
Anti-TUBB3 AntibodyCell Signaling Technology5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling KitThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermo-FisherA12381
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldehyde PrillsFisher Scientific5027632
New England Nuclear Blocking AgentPerkin Elmer2346249No longer sold
DAPICell Signaling Technology4083S
Prolong Gold Antifade Mounting MediaInvitrogenP36934
Leica SPSII Spectral ConfocalLeica BiosystemsN/AFor confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast MicroscopeLeica BiosystemsN/A
Cobalt-60 Teletherapy InstrumentAtomic Energy of Canada Ltd Theratron-80N/A
Amac Box, ClearThe Container Store60140Agarose block mold

References

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  3. Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
  4. Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
  5. Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
  6. Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
  7. Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  8. Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
  9. Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
  10. Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
  11. Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
  12. Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
  13. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  14. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
  17. Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
  18. Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
  19. Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
  20. Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
  21. Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
  22. Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  23. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  24. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
  25. Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
  26. Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
  27. Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
  28. Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
  29. Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
  30. Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
  31. Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
  32. Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved