顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

要約

3次元 organotypic 培養を用いて唾液腺の形態や機能マーカーを可視化することで、放射線後の組織損傷のメカニズムについて、新たな知見を得ることができます。ここで説明されているのは、電離放射線への曝露の前に、培養、照射、染色、50 ~ 90 μ m の厚い唾液腺切片を断面化するためのプロトコルである。

要約

Hyposalivation と口内乾燥症は、放射線治療を受けている頭頸部癌患者の生活の質を低下させる慢性口腔合併症を作り出す。唾液腺機能障害と回復のメカニズムを理解するための実験的アプローチは、生体内モデルに着目しており、治療候補のスクリーニングを体系的に行うことができず、トランスフェクションの効率が低下している特定の遺伝子を操作する能力。この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。Immunofluorescent 染色と共焦点顕微鏡検査を利用して、30日間の培養期間中に特定の細胞集団とマーカーがいつ存在するかを判断しました。さらに、生体内放射線モデルで以前に報告された細胞マーカーは、ex 生体内に照射された培養液中で評価される。前進して、この方法は、唾液機能を改善する治療薬に対するマウスおよびヒトの唾液腺組織応答の迅速な ex インビボ評価のための魅力的なプラットホームである。

概要

適切な唾液腺機能は、口腔の健康に不可欠であり、放射線治療¹による頭頸部癌処置の後に変化する。2017年、米国では、約5万の新しい頭頸部癌症例が報告された。唾液腺のような周囲の正常組織に対する放射線療法の組織損傷およびしばしば不可逆的効果のために、患者はしばしば重篤な副作用を残し、生活の質を低下させる^2、3、 ⁴.放射線障害によって引き起こされる一般的な合併症は、口内乾燥症 (口内乾燥の主観的感覚)、齲蝕、咀嚼・嚥下能力の障害、発話障害、経口フローラ²などの症状に現れる^3,4.これらの症状を総称して、罹患した個体⁵における栄養不良および生存障害を引き起こす可能性がある。この集団における唾液腺機能障害は十分に立証されているが、腺房細胞への損傷の根底にあるメカニズムは論争されており、異なる動物モデル^6、7間の統合はほとんどない。

唾液腺機能と放射線による損傷を研究する現在の方法は、in vivo モデルの使用、不死化細胞株、二次元 (2-d) 一次細胞培養、および三次元 (3-d) salisphere の培養^{8、 9、10、11、12}。伝統的に、不死化細胞株と二次元培養物からの細胞培養モデルは、平らな表面で培養された単層細胞を含み、迅速で、簡単で、費用対効果の高い実験に有用である。しかしながら、人工細胞培養条件は、様々な条件に曝露した細胞の分化状態および生理的応答を変化させることができ、そしてその結果は、生物モデル^14,15全体に翻訳することがしばしば失敗する。さらに、不死化細胞培養には p53 活性の変調が必要であり、これは DNA 損傷^16,17に対する唾液腺応答にとって重要である。

培養中の初期時点での幹細胞および前駆細胞の salisphere 培養が濃縮されており、この唾液腺細胞のこのサブセットの放射線感受性を理解するのに有用である^9、18。これらすべての培養モデルの決定的な限界は、細胞外マトリックス (ECM) および細胞細胞相互作用を含む唾液腺の三次元構造を、唾液の調節に極めて重要である様々な層にわたって可視化する上では効果がないことである。分泌¹⁵.組織全体の行動を包含する方法の必要性しかし、治療の効果を研究するために実験室条件下で操作することも可能であり、放射線誘発性唾液腺の根底にあるメカニズムをさらに発見する必要がある機能 不全。

生きたティッシュの区分および文化は前に^19,20文書化され、多くの場合、脳組織相互作用²¹を研究するために使用される。これまでの研究では、マウス由来の耳下腺唾液腺組織を約50μ m に切片化し、最大 48 h の培養を行い、その後¹⁹個の生存率、細胞死、機能の解析を行った。Su et al.(2016) 顎下腺 (SMGs) を35μ m または50μ m で切片にして²⁰日間培養することにより、この方法論を拡充した。本手法は、50μ m および90μ m で切片となった耳下腺および顎下唾液腺の両方を含み、30日間培養の評価を行うという進歩である。組織の厚さの範囲をカットする能力は、尖 basolateral 極性および分泌の神経支配を含む細胞プロセスに関連する細胞細胞および細胞-ECM 相互作用を評価する上で重要である。さらに、この培養モデルの実現可能性を判断するために培養中に唾液腺切片を照射し、放射線による唾液腺損傷を研究した。

この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。後郭清可能な最大時間切片を決定するために、トリパンブルー染色、生細胞染色、および細胞死に対する免疫組織化染色が実施された。共焦点顕微鏡と immunofluorescent 染色は、特定の細胞集団、形態学的構造、および増殖のレベルを評価するために利用された。組織セクション培養物はまた、この3-d モデルにおける様々なマーカーに対する放射線の影響を決定するために電離放射線に暴露された。細胞死の誘導、骨格破壊、分化マーカーの欠損、および照射された ex インビボ培養物における代償性増殖を、インビボモデルの以前の研究と比較した。この方法論は、放射線損傷後の細胞間相互作用の役割を調査するための手段を提供し、治療的介入の有効性を効率的に評価するための実験的モデルを提供する (遺伝子操作または薬理学的薬剤) は、in vivo モデルにはあまり適していない可能性があります。

プロトコル

1. ビブラトームの準備

1. 緩衝トレー、ブレードアタッチメント、アガロースブロックモールド、および 70% エタノールの実験室フィルムを含むビブラトームの取り外し可能なコンポーネントをスプレーし、その後、UV 殺菌を少なくとも30分間行います。
2. 氷が落下するのを防ぐために、バッファトレイの上に追加シートフィルムを置き、固定します。
3. 氷の部屋を砕いた氷で満たし、実験室のフィルムを緩衝トレーから取り出し、100 mL の氷冷1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液を 1% のペニシリン-ストレプトマイシン-アンピシリン (PSA) で補足して緩衝トレーに充填する。
4. ブレードホルダーにステンレススチールかみそりの刃を置きます。ドライバを使用して、ブレードの角度を締め付け/緩め、変更します。

2. アガロースブロック内の組織サンプルの調製およびビブラトームを使用した断面化

1. 鉗子、はさみおよびペイントブラシを含むすべての必要な解剖および区分用具をオートクレーブに収めなさい。
2. アガロースが溶液に溶解するまで、滅菌 1x PBS およびマイクロ波に 3% の低融点アガロースを準備します。溶液が沸騰していないことを確認し、混合するために定期的にボトルを旋回。
   注: 低融点アガロースを温水浴に保つことによって固化しないようにしてください。低メルトアガロースは37° c で、25° c に設定されています。しかし、生理的温度でアガロースを組織の周りに注ぐためには、水浴を40° c 以下にする必要があります。
3. 唾液腺を分離し、切開した組織を 2 mL の氷冷 1x PBS に、無菌の30mm 培養皿に 1% の PSA を補充した。
4. オートクレーブ鉗子を使用して、1x PBS + 1% PSA 溶液から唾液腺を除去し、埋め込み型の底部に位置します。液体 3% の低融点アガロースで鋳型を充填し、組織をカバーします。
5. 鉗子を使用して、ブロックの中央に組織を調整し、適切な面に唾液腺を配置します。顎下と耳下腺にとって最良の断面は垂直面である。
6. アガロースブロックを氷上に設置し、10分間硬化させる。
7. アガロースの外縁の周りを慎重にかみそりの刃を動かし、ステップ1.1 から UV 滅菌実験室フィルムにブロックをスライドさせて緩めます。
8. かみそりの刃を使用して、唾液腺を含むアガロースボックスを切り出します。セクションの平面が、ブロックの反対側 (接着されるサーフェス) と平行になっていることを確認します。アガロースは組織に侵入しないので、組織の周りにあまりにも多くのアガロースをトリミングしないようにして、組織が十分にサポートされるようにします。
9. 切断面にブロックを取り付けるには、superglue を使用します。
10. 50μ m または90μ m の厚さのセクションでは、0.075 mm/s の速度と 100 Hz の周波数でビブラトームします。
    注: 最高周波数でビブラトームを設定し、最も低いブレード速度は最適なスライスを提供します。
11. 〜 1 mL の氷冷 PBS を含む24ウェル組織培養皿の切片を、オートクレーブされた天然の毛ブラシを使用して、70% エタノールにスライスコレクション間に入れ、無菌性を維持する。

3. 培養セクション

1. マイクロスパチュラおよび鉗子をオートクレーブする。
2. ウシ胎児血清 (FBS) の有無にかかわらずストックビブラトーム培養培地を作る: DMEM/F12 培地は、1% PSA、5μ g/mL トランスフェリン、1.1 μ m ヒドロコルチゾン、0.1 μ m レチノイン酸、5μ g/mL インスリン、80 ng/mL 上皮成長因子、5 mM L-グルタミン、50μ g/mL硫酸ゲンタマイシン及び10μ l/mL 微量元素混合物である。適切な量の FBS を追加して、0%、2.5%、5.0%、または 10% のソリューションを作成します。
3. 断面化する前に、予温められた培地の300μ l を加えて、12 mm 直径、0.4 μ m の細孔サイズの膜インサートを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れる。メディアは、培養用の液体空気界面を作成するために、膜底に到達する必要があります。
4. 加湿 5% CO2 と 95% 空気雰囲気インキュベーター内の37° c で、マイクロスパチュラと培養を使用して 、膜インサートの上に唾液切片を優しく寝かせます。
   1. ウェルに約300μ l の一次培養培地を加え、膜インサート (約40μ l) を1日おきに数滴または必要に応じて滴下します。適切な培養は、細胞が生存することができ、最大30日間のインビボで維持することができることを示した。

4. 唾液腺切片の照射

1. 60 (またはそれに相当する) 照射装置を使用して、1回の放射線量 (5 Gy) で切片を処理します。
   1. 温度の変動を避けるために、覆われた発泡スチロール容器を使用して照射装置施設への輸送セクション。さらに、培地が培養蓋に飛び散ることがなく、汚染を誘発しないようにするために、ラボインキュベーターへの輸送中には注意が必要です。
   2. 放射線源から 80 cm の唾液腺切片を含む24ウェルプレートを、放射線場の 32 "x 32" の中心に置きます。照射装置の放射線量計算と対応する時間は、計器とコバルト-60 崩壊によって異なります。
2. セクション3で説明されているように、これらのセクションの監視と培養を続けます。

5. 生存性染色

1. 古いメディアを吸引し、無菌の、事前に温められた 1x PBS でスライスを2回洗浄します。
2. トリパンブルー染料で汚れのセクション。
   1. スライスを培養からガラススライドに移動するには、マイクロスパチュラを使用します。
   2. ティッシュ (10-20 μ l) をカバーする十分な容積が付いているビブラトームのスライスに 0.4% トリパンの青の解決を加えなさい。
   3. 色素が組織に浸透するために、トリパンブルーの室温 (RT) でスライスを 1 ~ 2 分間インキュベートします。中絶細胞は青色に染色され、生存細胞は未染色されます。
3. カルセインを用いて切片を染色し、生細胞染料である。
   1. 24の井戸版 (200-300 のμ l) の1つの井戸のセクションをカバーするのに十分な量の汚れを加えなさい。
   2. RT でスライスを15分間インキュベートし、染料の浸透を可能にします。
   3. 慎重に井戸からセクションを削除し、ガラスのスライド上に配置します。1滴のマウントメディアでスライスをマウントします。
   4. 488 nm および 515 nm の励起/放出波長の蛍光顕微鏡のイメージのセクション。

6. 抗体染色ビブラトームセクション

注: 以下は、Ki-67 に特異的な一般抗体染色プロトコルを提供します。しかし、このプロトコルは、任意の抗体と共に使用することができる。特に断りのない限り、すべての洗浄は RT で行われる。

1. 多井戸組織培養皿では、培地をオフに吸引し、滅菌 1x PBS で少なくとも2x を洗浄する。
2. 4° c で一晩 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用してセクションを固定します。
3. 4% PFA をオフ吸引し、PBT で3倍洗浄します [1x PBS, 1% ウシ血清アルブミン (BSA), 0.1% トリトン X-100].
   注: セクションは4° c で 1x PBS に保存され、後で染色することができます。この原稿で試験した最大貯蔵時間は3週間であった。必要な場合は、個々のユーザーがより長いストレージ時間を最適化する必要があります。
4. 透過処理は 0.3% トリトン X-100 を 1x PBS で30分間使用しました。
   注: このステップは、特定の抗体染色および透過処理に対して修正および最適化することができます。
5. Pipet 透過処理ソリューションをオフにします。
6. 1x PBS、1% BSA、0.1% トリトン X-100 (PBT) で5分間3倍にしてください。
7. 1 h の 1% 正常なヤギの血清が付いているブロックのエージェントが付いているスライスをブロックしなさい。
8. PBT で5分間3倍のスライスを洗います。
9. 1x PBS で 1% BSA で希釈した500μ l 抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を使用して、4° c で一晩インキュベートします。
   注: ファロイジン染色の場合、ステップ6.9 をスキップし、使用された特定のファロイジンのプロトコルを使用して続行します。DNA 対比染色については、ステップ6.15 にスキップしてください。
10. 抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を吸引する。
11. 1x PBS で5分間スライス6x を洗ってください。
12. 光から覆われた 1.5 h のために RT で 1x PBS で 1% BSA で希釈した Ki67 抗体と互換性のある蛍光共役二次抗体の500μ l 中のスライスをインキュベートします。
    注: 使用される二次抗体に基づいて、二次抗体とのインキュベーション時間は、個々のユーザによってさらに最適化され得る。また、二次抗体は光感受性である。以降のすべての洗浄は、暗所で実行する必要があります。
13. 二次抗体を吸引する。
14. 1x PBS で5分間、3倍のスライスを洗ってください。
15. 脱イオン水で5分間、スライスを洗います。
16. RT の 20 min に DAPI (1 μ g/mL) の対比染色スライス。
17. 脱イオン水でスライス (1 回) を5分間洗浄します。
18. マウントメディアの1滴 (~ 40 μ l) でスライスを取り付けます。余分な泡を避けるために、45°の角度から始めて、スライド上のマウントメディア上にゆっくりとカバースリップを置きます。
    1. 厚い部分をカバースリップで押しつぶさないようにするには、各スライスをスペーサで取り付けます。スペーサはティッシュセクションのまわりで正方形に真空のグリースの縁を置くことによって作成することができる。
    2. カバースリップを敷設するとき、カバースリップの端は真空グリースで密封することができます。親指でカバースリップの端を押し下げて、スライド上にしっかりと密着させます。あるいは、クリアマニキュアを使用して顕微鏡スライドにカバースリップを密封します。

7. イメージングビブラトームセクション

1. 染色してから5日以内に染色されたスライドを撮影する。
2. 共焦点顕微鏡を用いて染色されたビブラトームスライスの光学切片を得る。共焦点顕微鏡では、定義されたステップサイズで z スタックを得るか、またはユーザの実験計画に応じて個々の画像を取る。画像は、共焦点収集後の任意のコンピュータ画面上で調べることができる。
   注: ビブラトームスライスの厚さのため、共焦点顕微鏡または z スタック機能を持つ範囲を使用して、サンプル内の詳細を視覚化することをお勧めします。この原稿で使用されている画像については、63x オイルの目的が使用されました。ただし、これは個々のユーザおよび使用される特定のスコープによって調整され、さらに変更することができます。最小の光学的に解決可能な構造体の X と Y の2.5 ピクセルの想定されたナイキストサンプリングを使用して、各目的とズームファクターの推奨ピクセル解像度。ただし、一部のコメンテーターは2.3 ピクセルを提案し、その他は2.8 ピクセルを提案します。これらの計算を行う方法の詳細については、生物共焦点顕微鏡第²²巻のハンドブックを参照してください。

結果

初代2次元培養物は、ウシ胎児血清 (FBS) 補充培地で増殖させ、一方、一次3− D salisphere 培養は、通常、無血清状態で培養される^10、11。さらに、唾液腺からのビブラトーム培養を利用した2つの以前の研究では、0% または 10% の FBS を補充した培地^19,20でその切片を培養した。マウス?...

ディスカッション

唾液腺研究では、不死化2次元培養、主な2次元培養、3次元 salisphere 培養、および胚外植片からの三次元器官培養を含む多くの培養モデルを利用して、基礎となる生物学と生理学に関する疑問を確認しました。これらの培養モデルは、多様な研究課題にわたって洞察に富んだ情報をもたらし、唾液中の研究においても重要なツールであり続けます。これらの培養モデルの限界には、不死化中の ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold