Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

Zusammenfassung

Durch die Verwendung dreidimensionaler organotypischer Kulturen zur Visualisierung der Morphologie und funktionellen Marker von Speicheldrüsen können neue Einblicke in die Mechanismen von Gewebeschäden nach Strahlung gegeben werden. Hier wird ein Protokoll zu den Abschnitten, Kultur, Bestrahlung, Fleck und Bild 50 – 90 μm dicken Speicheldrüsenabschnitten vor und nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung beschrieben.

Zusammenfassung

Hyposalivation und Xerostomia erzeugen chronische orale Komplikationen, die die Lebensqualität bei Kopf-und Nackenkrebspatienten, die mit Strahlentherapie behandelt werden, verringern. Experimentelle Ansätze zum Verständnis von Mechanismen der Speicheldrüsenfunktionsstörungen und Restaurationen haben sich auf in vivo-Modellen konzentriert, die durch die Unfähigkeit, therapeutische Kandidaten und Effizienz in der Transfektion systematisch zu untersuchen behindert werden, behindert werden. Fähigkeit, bestimmte Gene zu manipulieren. Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Wir haben die immunfluoreszierende Färbung und die konfokale Mikroskopie eingesetzt, um festzustellen, wann bestimmte Zellpopulationen und Marker während einer 30-tägigen Kulturperiode vorhanden sind. Darüber hinaus werden in vivo Strahlungsmodelle in Kulturen ausgewertet, die ex vivo bestrahlt werden. Diese Methode, die sich vorwärts bewegt, ist eine attraktive Plattform für die schnelle Ex-vivo-Bewertung von Murin-und menschlichen Speichelgewebe Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe, die Speichelfunktion verbessern.

Einleitung

Die richtige Speicheldrüsenfunktion ist für die Mundgesundheit von entscheidender Bedeutung und wird nach der Kopf-und Nackenkrebsbehandlung mit der Strahlentherapie^{1 verändert}. 2017 wurden in den USA 2 knapp 50.000 neue Fälle von Kopf-und Nackenkrebsgemeldet. Aufgrund der gewebeschädigenden und häufig irreversiblen Auswirkungen der Strahlentherapie auf umgebende normale Gewebe wie Speicheldrüsen sind die Patienten oft mit schweren Nebenwirkungen und verminderter Lebensqualität^{2,3, 4}. Platz Häufige Komplikationen, die durch Strahlenschäden verursacht werden, manifestieren sich in Symptomen wie Xerostomie (das subjektive Gefühl des trockenen Mundes), Zahnkaries, Beeinträchtigung der Fähigkeit zu kauen und zu schlucken,Sprachbeeinträchtigungen und kompromittierten Mundmikrobiomes 2^{, 3 , 4}. Diese Symptome können kollektiv zu Unterernährung und Beeinträchtigung des Überlebens bei betroffenen Personen führen 5. Während die Speicheldrüsenfunktionsstörungen in dieser Population gut dokumentiert sind, wurden die zugrundeliegenden Mechanismen der Schädigung von Akinarzellen bestritten, und es gibt kaum Integration zwischen den verschiedenen Tiermodellen^6,7.

Die aktuellen Methoden zur Untersuchung der Speicheldrüsenfunktion und der strahlenbedingten Schädigung umfassen die Verwendung von In-vivo-Modellen, verewigten Zelllinien, zweidimensionalen (2-D) Primärzellkulturen und dreidimensionalen (3-D) Salisphere-Kulturen^{8, 9,10,11,12}. Traditionell sind Zellkulturmodelle aus verewigten Zelllinien und 2-D-Kulturen einschichtige Zellen, die auf flachen Oberflächen kultiviert werden und für schnelles, einfaches und kostengünstiges Experimentieren wertvoll sind. Künstliche Zellkultur-Bedingungen können jedoch den Differenzierungsstatus und die physiologischen Reaktionen von Zellen verändern, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, und die Ergebnisse können oft nicht auf ganze Organorganismus-Modelle^14,15übersetzen. Darüber hinaus benötigen verewigte Zellkulturen eine Modulation der p53-Aktivität, was für die Reaktion der Speicheldrüse auf DNA-Schäden^{16,17entscheidend}ist.

3-D Salisphere Kulturen sind für Stamm-und Vorläuferzellen in der frühen Zeit Punkte in der Kultur angereichert und waren nützlich, um die Radiosensibilität dieser Untergruppe von Speicheldrüsenzellen^9,18zuverstehen. Eine kritische Einschränkung all dieser Kulturmodelle ist, dass sie bei der Visualisierung der 3-D-Struktur der Speicheldrüse, einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und Zellzellinteraktionen über verschiedene Schichten, die bei der Modulation von Speichelvarianten entscheidend sind, wirkungslos sind. Sekretion¹⁵. Die Notwendigkeit einer Methode, die das Verhalten des Gewebes als Ganzes umfasst, aber auch unter Laborbedingungen manipuliert werden kann, um die Auswirkungen der Behandlung zu untersuchen, ist notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen der strahleninduzierten Speicheldrüse weiter zu entdecken. fehlfunktion.

Die Lebendgeweb-Sektionierung und-kultur wurde bereits^{19,20 dokumentiert}und wird häufig zur Untersuchung von Gehirngewebeinteraktionen²¹verwendet. In früheren Studien wurde Parotid (PAR) Speicheldrüsengewebe von Mäusen auf etwa 50 μm abgetrennt und für bis zu 48 Stunden kultiviert, und die Analyse der Lebensfähigkeit, des Zelltodes und der Funktion wurde danach¹⁹durchgeführt. Su et al. (2016) erweiterte diese Methodik durch die Kultivierung der menschlichen submandibulären Drüsen (SMGs), die für 14 Tage auf 35 μm oder50 μm verteilt sind. 20 Tage lang wurden sie mit 35 μm oder 50 μm abgetrennt. Die vorgeschlagene Methode ist insofern ein Fortschritt, als sie sowohl parotide als auch submandibuläre Speicheldrüsen umfasst, die mit 50 μm und 90 μm abgetrennt sind und die Kulturen 30 Tage lang auswerten. Die Fähigkeit, einen Bereich der Gewebedicke zu schneiden, ist wichtig bei der Bewertung von Zellzell-und Zell-ECM-Interaktionen, die für zelluläre Prozesse relevant sind, einschließlich apical-Basolateralpolarität und Innervation für die Sekretion. Darüber hinaus wurden die Speicheldrüsenscheiben bestrahlt, während sie in der Kultur die Machbarkeit dieses Kulturmodells zur Untersuchung von strahlenbedingten Speicheldrüsenschäden feststellen konnten.

Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Um die maximalen Zeitabschnitte zu bestimmen, die nach der Trennung lebensfähig sind, wurden trypan-Blau-Färbung, lebende Zellfärbung und immunhistochemische Färbung für den Zelltod durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie und die immunfluoreszierende Färbung wurden eingesetzt, um bestimmte Zellpopulationen, morphologische Strukturen und Proliferationsniveaus zu bewerten. Auch die Gewebeschnittkulturen waren ionisierender Strahlung ausgesetzt, um die Auswirkungen der Strahlung auf verschiedene Marker in diesem 3-D-Modell zu bestimmen. Die Induktion des Zelltodes, die Zytoskelettstörung, der Verlust von Differenzierungsmarkern und die Kompensationsvermehrung in bestrahlten Ex-vivo-Kulturen wurden mit früheren Studien von in vivo-Modellen verglichen. Diese Methodik bietet ein Mittel, um die Rolle von Zellzellinteraktionen nach Strahlenschäden zu untersuchen und stellt ein experimentelles Modell zur Verfügung, um die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen (Genmanipulationen oder pharmakologische Wirkstoffe) effizient zu bewerten. ), die für in vivo Modellen weniger geeignet sein können.

Protokoll

1. Zubereitung von Vibrationen

1. Sprühbare, abnehmbare Bauteile des Vibratoms inklusive Puffertablett, Messerbefestigung, Acharo-Blockform und Laborfolie mit 70% Ethanol, dann UV-Sterilize für mindestens 30 min.
2. Legen und sichern Sie ein zusätzliches Blatt Laborfolie über das Puffertablett, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt.
3. Füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis, entfernen Sie die Laborfolie aus dem Puffertablett und füllen Sie das Puffertablett mit 100 ml eiskalter 1x Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), ergänzt um 1% Penicillin-Streptomycin-Ampicillin (PSA).
4. Legen Sie eine Edelstahl-Rasierklinge in den Messerhalter. Mit dem Schraubenzieher können Sie den Winkel der Klinge anziehen und verändern.

2. Zubereitung der Gewebeprobe im Agrose-Block und Abtrennung mit dem Vibratom

1. Autoklave alle notwendigen Trenn-und Trennwerkzeuge, einschließlich Zangen, Scheren und Pinsel.
2. Bereiten Sie 3% niedrige Schmelzpunkt auf, die in sterilen 1x PBS und Mikrowelle entwickelt wurden, bis sich der Acharose in Lösung auflöst. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht überkocht und wirbeln Sie die Flasche regelmäßig mischen.
   Achtung: Verhindern Sie, dass sich der schmelzarme Awanz verfestigt, indem Sie ihn in einem warmen Wasserbad halten. Der schmelzarme Achrot ist bei 37 ° C flüssig und setzt bei 25 ° C. Das Wasserbad sollte jedoch unter 40 ° C liegen, um den Acharoten bei physiologischer Temperatur um das Gewebe zu gießen.
3. Isolieren Speicheldrüsen und platzieren Sie das zersekelte Gewebe in 2 mL eiskalte 1x PBS, ergänzt mit 1% PSA in einem sterilen, 30 mm Kulturgericht.
4. Mit Hilfe von Autoklaven-Zangen, entfernen Sie Speicheldrüsen von 1x PBS + 1% PSA-Lösung und Position am Boden einer Einbettung Form. Füllen Sie die Form mit Flüssigkeit 3% niedriger Schmelzpunkt, um das Gewebe zu bedecken.
5. Stellen Sie das Gewebe mit Hilfe der Zangen in die Mitte des Blocks ein und positionieren Sie die Speicheldrüse in der entsprechenden Ebene. Die besten Querschnitte für die submandibulären und parotiden Drüsen befinden sich in der vertikalen Ebene.
6. Platz agarose Block auf Eis für 10 Minuten zu härten.
7. Führen Sie vorsichtig eine Rasierklinge um den äußeren Rand des Agrotes, um sich zu lockern und den Block aus Schritt 1.1 auf den UV-sterilisierten Laborfilm ausrutschen zu lassen.
8. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine Acharo-Kiste mit der Speicheldrüse auszuschneiden. Achten Sie darauf, dass die Ebene des Abschnitts gerade und parallel zur gegenüberliegenden Seite des Blocks ist (die Oberfläche, die abgeklebt wird). Da die Acharose das Gewebe nicht infiltrieren, schneiden Sie nicht zu viel Agirete um das Gewebe ab, so dass das Gewebe gut unterstützt wird.
9. Verwenden Sie Superkleber, um den Block an der Schnittfläche zu befestigen.
10. Ausschnitt bei 50 μm oder 90 μm Dicke durch Vibratome bei einer Geschwindigkeit von 0,75 mm und einer Frequenz von 100 Hz.
    Hinweis: Das Setzen des Vibratoms auf die höchste Frequenz und die niedrigste Messergeschwindigkeit liefert die optimalsten Scheiben.
11. Sammeln Sie Abschnitte in einem 24-Brunnen-Gewebekultur-Gericht mit ~ 1 mL eiskalten PBS pro gut mit einer autoklavierten, natürlichen Haarpinsel, indem Sie die Bürste in 70% Ethanol zwischen Scheiben Sammlungen, um Sterilität zu erhalten.

3. Kulturabschnitte

1. Autoklave eine Mikro-Spachtel und Zangen.
2. Machen Sie Stock-Vibratome Kulturmedien mit oder ohne fetales Rinderserum (FBS): DMEM/F12 Medien ergänzt mit 1% PSA, 5 μg/mL Transferrin, 1,1 μM Hydrocortison, 0,1 μM Retinosäure, 5 μg/mL Insulin, 80 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mM L-Glutamin, 50 μg/mL Gentamicin-Sulfat und 10 μL/mL Spurenelemente-Gemisch. Fügen Sie eine angemessene Menge an FBS hinzu, um 0%, 2,5%, 5,0% oder 10% Lösungen zu machen.
3. Vor der Abspaltung 300 μL vorgewärmtes Medium hinzufügen und in jeden Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte einen 12 mm Durchmesser mit einer Porengröße einlegen. Die Medien sollten den Membranboden erreichen, um eine Flüssigluft-Schnittstelle für die Kultur zu schaffen.
4. Die Speichelabschnitte mit dem Mikrospachtel und der Kultur bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre Inkubator auf die Membraneinlage legen.
   1. Etwa 300 μL Primärkulturmedien in den Brunnen und ein paar Tropfen in die Membraneinsätze (ca. 40 μL) jeden zweiten Tag oder bei Bedarf. Die richtige Kultivierung zeigte, dass die Zellen überleben und bis zu 30 Tage ab vivo gewartet werden können.

4. Bestrahlung von Speicheldrüsenabschnitten

1. Behandeln Sie die Abschnitte mit einer einzigen Strahlendosis (5 Gy) mit dem Kobalt-60 (oder gleichwertigen) Bestrahler.
   1. Transport von Abschnitten zur Bestrahleranlage mit einem überdachten Styroporbehälter zur Vermeidung von Temperaturschwankungen. Darüber hinaus muss beim Transport zurück in den Inkubator des Labors darauf geachtet werden, dass die Medien nicht auf den Kulturdeckel zupraschen und zu einer Verunreinigung führen.
   2. Platzieren Sie die 24-Well-Platte mit Speicheldrüsenabschnitten 80 cm von der Strahlungsquelle entfernt, in der Mitte eines 32 "x 32"-Strahlungsfeldes. Die Berechnungen der Strahlendosis und die entsprechende Zeit im Bestrahler variieren je nach Instrument und Kobalt-60-Zerfall.
2. Die Überwachung und Kultivierung dieser Abschnitte, wie sie in Abschnitt 3 beschrieben sind, wird weiter überwacht und kultiviert.

5. Haltbarkeit

1. Aspirieren Sie alte Medien und waschen Sie Scheiben zweimal mit sterilen, vorgewärmten 1x PBS.
2. Stapelabschnitte mit trypanblauem Farbstoff.
   1. Verwenden Sie einen Mikrospachtel, um die Scheibe von der Kultur auf eine Glasscheibe zu verschieben.
   2. Fügen Sie der Vibratomscheibe 0,4% Trypusblaue Lösung mit genügend Volumen hinzu, um das Gewebe zu bedecken (10 – 20 μL).
   3. Inkubieren Sie Scheiben bei Raumtemperatur (RT) im Trypan-Blau für 1 – 2 min für den Farbstoff, um in das Gewebe einzudringen. Nicht lebensfähige Zellen werden blau gefärbt und lebensfähige Zellen werden nicht befleckt.
3. Stapelabschnitte mit Calcein, AM-Live-Zell-Farbstoff.
   1. Fügen Sie genügend Fleckenvolumen hinzu, um den Abschnitt in einem Brunnen einer 24-Wellplatte (200 – 300 μL) abzudecken.
   2. Inkubate Scheiben bei RT für 15 Minuten, um Farbstoffdurchdringen zu ermöglichen.
   3. Den Abschnitt vorsichtig vom Brunnen entfernen und auf eine Glasscheibe legen. Mount Scheiben mit 1 Tropfen Montageband.
   4. Bildausschnitte auf einem Leuchtstoffmikroskop mit Erredung/Emissionswellenlängen von 488 nm und 515 nm.

6. Antikörper-Färbung Vibratome Abschnitte

Hinweis: Im Folgenden finden Sie ein allgemeines Antikörper-Färbung, das speziell für Ki-67 spezifisch ist; Dieses Protokoll kann jedoch mit jedem Antikörper verwendet werden. Alle Waschungen werden bei RT durchgeführt, sofern nicht anders vermerkt.

1. In der Multi-well-Gewebekulturschale die Medien absaugen und mindestens 2x mit sterilen 1x PBS waschen.
2. Fixierte Abschnitte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C.
3. 4% PFA absaugen und 3x mit PBT waschen [1x PBS, 1% Rinder-Serum Albumin (BSA), 0,1% Triton X-100].
   Hinweis: Abschnitte können bei 4 ° C in 1x PBS gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt verfärbt werden. Die maximale Lagerzeit, die in diesem Manuskript getestet wurde, betrug 3 Wochen. Eine längere Speicherzeit muss der einzelne Nutzer optimieren, wenn dies gewünscht wird.
4. Durchlässige Abschnitte mit 0,3% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min.
   Hinweis: Dieser Schritt kann modifiziert und optimiert werden, um eine spezifische Antikörper-Färbung und Durchlässigkeit zu ermöglichen.
5. Die Durchlässigkeit.
6. Wasch 3x für 5 min mit 1x PBS, 1% BSA und 0,1% Triton X-100 (PBT).
7. Blockieren Sie die Scheiben mit Blockiermittel mit 1% normalem Ziegenserum für 1 h.
8. Die Scheiben 3x für 5 min mit PBT waschen.
9. Die Scheiben über Nacht bei 4 ° C mit 500 μL anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper verdünnt in 1% BSA in 1x PBS.
   NOTE: Für die Phalloidin-Färbung, überspringen Schritt 6.9 und fahren Sie mit dem Protokoll für die spezifische Phalloidin verwendet. Für DNA-Gegenfleck, überspringen Sie zu Schritt 6.15.
10. Aspirate anti-Ki67 Kaninchen monoklonalen Antikörper.
11. Die Scheiben 6x für 5 min in 1x PBS waschen.
12. Inkubieren Sie die Scheiben in 500 μL fluoresziertem konjugierten sekundären Antikörper, die mit dem Anti-Ki67-Antikörper kompatibel sind, der in 1% BSA in 1x PBS bei RT für 1,5 h aus Licht bedeckt ist.
    Hinweis: Auf Basis des verwendeten sekundären Antikörpers kann die Inkubationszeit mit dem sekundären Antikörper durch den einzelnen Nutzer weiter optimiert werden. Außerdem ist der sekundäre Antikörper lichtempfindlich. Alle nachfolgenden Waschungen müssen im Dunkeln durchgeführt werden.
13. Aspirate sekundäre Antikörper.
14. Waschscheiben für 3 x für 5 min mit 1x PBS.
15. Die Scheiben 5 min in deionisiertem Wasser waschen.
16. Gegenfleckscheiben mit DAPI (1μg/mL) für 20 min bei RT.
17. Scheiben (einmal) für 5 min in deionisiertem Wasser waschen.
18. Teigscheiben mit einem Tropfen (~ 40 μL) von Montagebrädern. Um überschüssige Blasen zu vermeiden, legen Sie den Koppel langsam auf das Montagemutter auf der Rutsche, beginnend mit einem 45 °-Winkel.
    1. Um zu verhindern, dass die dicken Abschnitte mit dem Kofenlip zerkleinert werden, montieren Sie jede Scheibe mit einem Abstandshalter. Ein Abstandshalter kann erzeugt werden, indem man einen Rand aus Vakuumfett in ein Quadrat um den Gewebeabschnitt legt.
    2. Beim Verlegen des Kerklips können die Kanten des Kerkel mit Vakuumfett versiegelt werden. Drücken Sie mit dem Daumen auf die Kanten des Kegenlippens, um ihn fest auf die Rutsche zu kleben. Alternativ können Sie die Keillippe mit klarem Nagellack auf die Mikroskope schieben.

7. Bildgebung von Vibratome

1. Bild der gebeizten Folien innerhalb von 5 Tagen nach der Färbung.
2. Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie optische Abschnitte der gebeizten Vibratome. Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie einen z-Stack in definierter Schrittgröße oder nehmen Sie je nach experimentellem Design des Nutzers einzelne Bilder. Bilder können nach einer konfokalen Sammlung auf jedem Computerbildschirm untersucht werden.
   Hinweis: Aufgrund der Dicke der Vibratome wird empfohlen, Details innerhalb der Proben mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Bereich mit z-Stack-Fähigkeit zu visualisieren. Für die Bilder, die in diesem Manuskript verwendet werden, wurde ein 63x-Ölobjekt verwendet; Dies kann jedoch vom einzelnen Nutzer und dem jeweiligen Umfang angepasst und weiter modifiziert werden. Empfohlene Pixelauflösung für jeden Objektiv-und Zoomfaktor mit der vermuteten Nyquist-Probenahme von 2,5 Pixeln in X und Y für die kleinste optisch auflösbare Struktur wurde verwendet. Einige Kommentatoren schlagen jedoch 2,3 Pixel vor, andere vermuten 2,8 Pixel. Weitere Informationen zu diesen Berechnungen finden Sie im Handbuch der Biologischen Konfokalen Mikroskopie²² .

Ergebnisse

Primär werden 2-D-Kulturen in fetalem Rinderserum (FBS) angebaut, die Medien ergänzen,^währenddie primäre 3-D-Salisphere-Kultur typischerweise unter serumfreien Bedingungen^10,11kultiviert wird. Darüber hinaus haben die beiden vorhergehenden Studien, die Vibratomkulturen aus Speicheldrüsen verwendeten, ihre Abschnitte in 0% oder 10% FBS kultiviert,^dieMedien^{19,20ergänzt}

Diskussion

Die Speicheldrüsenforschung hat eine Reihe von Kulturmodellen genutzt, darunter verewigte 2-D-Kulturen, primäre 2-D-Kulturen, 3-D-Salisphere-Kulturen und 3-D-Organkulturen von embryonalen Explanten, um Fragen zur zugrunde liegenden Biologie und Physiologie zu klären. Diese Kulturmodelle haben in einer Vielzahl von Forschungsfragen aufschlussreiche Informationen geliefert und werden auch in Zukunft wichtige Werkzeuge in der Speichelforschung sein. Zu den Grenzen dieser Kulturmodelle gehören die Modulation der p53-Akti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold