Лучевая терапия Органотипных культур от подчелюстной и околоушной слюнных желез модели ключ в естественных характеристик

Резюме

Использование трехмерных органотипных культур для визуализации морфологии и функциональных маркеров слюнных желез может обеспечить новый взгляд на механизмы повреждения тканей после облучения. Описанный здесь протокол к разделу, культуре, излучать, пятно, и изображение 50-90 мкм толщиной слюнных желез разделы до и после воздействия ионизирующего излучения.

Аннотация

Гипосаливация и ксеростомия создают хронические устные осложнения, которые снижают качество жизни больных раком головы и шеи, которые лечатся лучевой терапией. Экспериментальные подходы к пониманию механизмов дисфункции слюнных желез и восстановления были сосредоточены на в моделях естественных условиях, которые являются инвалидами из-за неспособности систематически экран терапевтических кандидатов и эффективность в трансфекции способность манипулировать конкретными генами. Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание и кофокальные микроскопии, чтобы определить, когда конкретные популяции клеток и маркеры присутствуют в течение 30-дневного периода культуры. Кроме того, сотовые маркеры ранее зарегистрированных в в естественных условиях излучения модели оцениваются в культурах, которые облученных ex естественных условиях. Двигаясь вперед, этот метод является привлекательной платформой для быстрого ex в естественных условиях оценки мышиных и человека слюнных желез ткани ответы на терапевтические агенты, которые улучшают функцию слюнных.

Введение

Правильная функция слюнных желез имеет важное значение для здоровья полости рта и изменяется после лечения рака головы и шеи с лучевой терапией¹. В 2017, около 50 000 новых случаев рака головы и шеи были зарегистрированы в Соединенных Штатах². Из-за повреждающих ткани и часто необратимых последствий лучевой терапии на окружающих нормальных тканях, таких как слюнные железы, пациенты часто остаются с тяжелыми побочными эффектами и уменьшением качества жизни^{2,3, 4}. в Общие осложнения, вызванные радиационным повреждением проявляется в таких симптомах, как Ксеростомия (субъективное чувство сухости во рту), кариеса зубов, нарушение способности жевать и глотать, нарушения речи и скомпрометированных устных микробиомов^{2, 3-х , 4}. Эти симптомы коллективно может привести к недоеданию и нарушение выживания в пострадавших лиц⁵. В то время как дисфункция слюнных желез в этой популяции была хорошо документирована, основные механизмы повреждения клеток ацинар были оспорены, и мало интеграции между различными моделями животных^6,7.

Текущие методы изучения функции слюнной железы и радиационно-индуцированных повреждений включают использование в моделях естественных условиях, увековечены клеточных линий, двумерных (2-D) первичных клеточных культур, а также трехмерные (3-D) культуры салисферы^{8, 9},^10,11,12. Традиционно, модели клеточной культуры от увековечены клеточных линий и 2-D культур привлекать однослоистых клеток культивировали на плоских поверхностях и ценны для быстрой, простой и экономически эффективных экспериментов. Однако, искусственные условия культуры клетки могут изменить состояние дифференцировки и физиологические реакции клеток, котор подвергли действию к различным условиям, и результаты часто не могут перевести к всем моделям организма^14,15. Кроме того, увековечены клеточных культур требует модуляции р. р. деятельности, которая имеет решающее значение для реакции слюнных желез на повреждение ДНК^16,17.

3-D культуры салисфера обогащаются для стволовых клеток и клетки-предшественников в раннем времени точки в культуре и были полезны для понимания радиозентивности этого подмножества слюнных желез клеток^9,18. Критическое ограничение всех этих моделей культуры они неэффективны в визуализации 3-D структуры слюнной железы, в том числе внеклеточной матрицы (ЕОС) и клеточных взаимодействий в течение различных слоев, которые имеют решающее значение в модуляции слюнных секреции¹⁵. Необходимость метода, который включает в себя поведение ткани в целом, но может также манипулировать в лабораторных условиях для изучения последствий лечения необходимо для дальнейшего обнаружить основные механизмы радиационно-индуцированной слюнной железы Дисфункции.

Живая ткань секционирования и культуры был документально ранее^19,20 и часто используется для изучения мозга ткани взаимодействия²¹. В предыдущих исследованиях, околоушной (пар) слюнных желез ткани от мышей был секционного примерно на 50 мкм и культивировали до 48 ч, и анализ жизнеспособности, гибель клеток, и функция была выполнена после¹⁹. SU et al. (2016) расширена по этой методологии путем культивирования человеческих Подчелюстные железы (SMGs) секционные на 35 мкм или 50 мкм в течение 14 дней²⁰. Предлагаемый метод является продвижение в том, что она включает в себя как околоушной и подчелюстной слюнных желез секционные на 50 мкм и 90 мкм и оценка культур в течение 30 дней. Способность вырезать диапазон толщины ткани имеет важное значение при оценке клеточных и клеточных взаимодействий, которые актуальны для клеточных процессов, включая апокально-базолатеральной полярности и иннервации для секреции. Кроме того, ломтики слюнной железы были облучены в то время как в культуре, чтобы определить целесообразность этой модели культуры для изучения радиационно-индуцированных повреждений слюнных желез.

Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Чтобы определить максимальное время разделы, которые являются жизнеспособными после рассечения, ТриАН синего окрашивания, живые окрашивание клеток, и иммуногистолехимического окрашивания для клеточной смерти были выполнены. Кофокальная микроскопия и иммунолюминесцентная окрашивание использовались для оценки популяции конкретных клеток, морфологических структур и уровней распространения. Ткани раздел культур также подвергаются ионизирующего излучения для определения последствий излучения на различных маркеров в этой 3-D модели. Индукция клеточной смерти, разрушение цитоскелета, потеря маркеров дифференциации, и компенсационного распространения в облученных ex естественных условиях культуры были по сравнению с предыдущими исследованиями в моделях естественных условиях. Эта методология предоставляет средства для изучения роли клеточных взаимодействий после радиационного поражения и обеспечивает экспериментальную модель для эффективной оценки эффективности терапевтических вмешательств (манипуляции генами или фармакологические агенты ), которые могут быть менее подходящими для в естественных условиях моделей.

протокол

1. Приготовление вибратома

1. Спрей съемные компоненты вибратом включая буфер лоток, лезвие крепления, агарозы блок плесень, и лабораторный фильм с 70% этанола, то УФ-стерилизации, по крайней мере 30 мин.
2. Поместите и закрепите дополнительный лист лабораторной пленки над буферным лотком, чтобы предотвратить падение льда.
3. Заполните ледяную камеру колотым льдом, снимите лабораторный фильм из буферного лотка и заполните буфер с 100 мл ледяного раствора 1x фосфата-буферного раствора (PBS), дополненное 1% пенициллин-стрептомицин-ампициллин (PSA).
4. Поместите лезвие бритвы из нержавеющей стали в держатель лезвия. Используйте отвертку, чтобы затянуть/ослабить и изменить угол лезвия.

2. Подготовка образца ткани в блоке агарозы и секционирование с использованием вибратомы

1. Автоклав все необходимые рассечение и секционирования инструменты, включая щипцы, ножницы и кисти.
2. Подготовка 3% низкая точка плавления агарозы в стерильных 1x PBS и микроволновой печи, пока агарозы растворяется в растворе. Убедитесь, что раствор не кипятить и вихревой бутылку периодически смешивать.
   Примечание: предотвратите низкоплавное агарозы от затвердевать путем держать его в ванне теплой воды. Низкоплавное агарозы жидкости при температуре 37 ° c и устанавливает при температуре 25 °C. Однако, водяной бане должен быть ниже 40 ° c для того, чтобы вылить агарозы вокруг ткани при физиологической температуре.
3. Изолировать слюнных желез и поместить расчлененные ткани на 2 мл ледяной 1x PBS дополнены 1% PSA в стерильных, 30 мм блюдо культуры.
4. Использование автоклапинных щипцов, удаление слюнных желез от 1x PBS + 1% PSA решение и положение в нижней части вложения плесени. Заполните плесень с жидкостью 3% низкая точка плавления агарозы для покрытия ткани.
5. Используя щипцы, отрегулируйте ткань к середине блока и положение слюнной железы в соответствующем плоскости. Лучшие поперечники для подчелюстной и околоушной железы находятся в вертикальной плоскости.
6. Место агарозы блока на льду в течение 10 минут, чтобы затвердевать.
7. Аккуратно Запустите лезвие бритвы вокруг внешнего края агарозы, чтобы ослабить и пусть блок слайд на УФ-стерилизовать лабораторный фильм из шага 1,1.
8. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать в коробке агарозы, содержащей слюнные железы. Убедитесь, что плоскость раздела прямая и параллельная противоположной стороне блока (поверхность, которая будет приклеена). Так как агарозы не проникают в ткань, не обрезайте слишком много агарозы вокруг ткани, поэтому ткань будет хорошо поддерживаться.
9. Используйте суперклей для прикрепления блока к режущей поверхности.
10. Секция на 50 мкм или 90 мкм толщина от вибратомы со скоростью 0,075 мм/с и частотой 100 Гц.
    Примечание: Настройка вибратомы на самой высокой частоте и низкая скорость лезвия обеспечивает наиболее оптимальные ломтики.
11. Соберите разделы в 24-хорошо ткань культуры блюдо, содержащее ~ 1 мл ледяной PBS на хорошо использованием автоматической, натуральные волосы кисти, поместив кисть в 70% этанола между срез коллекций для поддержания бесплодия.

3. секции культивирования

1. Автоклав микро-шпатель и щипцы.
2. Сделать фондовом вибратомы культуры СМИ с или без плода бычий сыворотки (ФПС): ДМЭМ/F12 СМИ дополнены 1% PSA, 5 мкг/мл трансферрин, 1,1 мкм гидрокортизон, 0,1 мкм ретиноевой кислоты, 5 мкг/мл инсулина, 80 нг/мл эпидермального фактора роста, 5 мм L-глютамина, 50 мкг/мл гентатаин сульфат, и 10 мкл/мл смесь трассировки элементов. Добавьте соответствующее количество ФПС, чтобы сделать 0%, 2,5%, 5,0%, или 10% решений.
3. До секционирования, добавить 300 мкл предварительно нагреваемых средств массовой информации и поместить 12 мм диаметром, 0,4 мкм поры размера мембраны вставки в каждый колодец 24-хорошо ткань культуры пластины. Средства массовой информации должны достичь дна мембраны для создания интерфейса жидкостного воздуха для культуры.
4. Аккуратно положите слюнные разделы поверх вставки мембраны с помощью микро-шпателя и культуры при температуре 37 ° c в увлажненный 5% CO₂ и 95% атмосферы воздуха инкубатора.
   1. Добавьте приблизительно 300 мкл первичных сред культуры в колодец и несколько капель в мембранные вставки (приблизительно 40 мкл) через день или по мере необходимости. Надлежащее культивирование показало, что клетки способны выживать и поддерживаться до 30 дней ex естественных условиях.

4. облучение участков слюнных желез

1. Лечить разделы с одной дозой излучения (5 гр) с использованием кобальта-60 (или эквивалент) irрадиатор.
   1. Транспорт разделы для irрадиатор объекта с помощью крытого контейнера пенополистирола, чтобы избежать колебаний температуры. Кроме того, необходимо позаботиться во время транспортировки обратно в лабораторию инкубатор для обеспечения того, чтобы средства массовой информации не брызгать на культуру крышкой и вызвать загрязнение.
   2. Поместите 24-хорошо пластины, содержащие участки слюнной железы 80 cm от источника излучения, в центре 32 "х 32" поле излучения. Расчеты дозы излучения и соответствующее время в радиаторе будут варьироваться в зависимости от прибора и распада кобальта-60.
2. Продолжайте мониторинг и культивирование этих разделов, как описано в разделе 3.

5. пятнать жизнеспособности

1. Аспирин старых средств массовой информации и мыть ломтики дважды стерильные, предварительно нагретой 1x PBS.
2. Окрашивание участков с синей краской трипона.
   1. Используйте микро-шпатель для перемещения ломтик от культуры к стеклянной слайде.
   2. Добавить 0,4% трипаное синее решение на срез вибратомы с достаточным объемом для покрытия ткани (10 – 20 мкл).
   3. Инкубировать ломтики при комнатной температуре (RT) в синий трипаном для 1-2 мин для красителя проникать в ткань. Нежизнеспособные клетки будут окрашены в синий цвет, а жизнеспособные клетки будут незапятнанными.
3. Пятно разделы с calcein, AM живой-клеточной краски.
   1. Добавить достаточное количество пятен, чтобы покрыть секции в одном хорошо 24 хорошо пластины (200-300 мкл).
   2. Инкубировать ломтики на RT в течение 15 мин, чтобы позволить красителя проникновения.
   3. Аккуратно удалите секцию из колодца и поместите на стеклянную горку. Гора ломтики с 1 капля монтажа средств массовой информации.
   4. Разделы изображения на флуоресцентном микроскопе при возбуждении/излучении длин волн 488 нм и 515 нм.

6. антитело окрашивание участков вибратома

Примечание: ниже приводится общий окраски антител протокол специфическое для Ki-67; Однако, этот протокол может быть использован с любым антителом. Все мойки проводятся в РТ, если не указано иное.

1. В мульти-хорошо ткани культуры блюдо, аспирин от средств массовой информации и мыть по крайней мере 2x стерильных 1x PBS.
2. Исправьте разделы с помощью 4% параформальдегида (ФА) на ночь при температуре 4 °C.
3. Аспирин от 4% и мыть 3x с PBT [1x PBS, 1% бычьего сыворотки альбумина (БСА), 0,1% тритон X-100].
   Примечание: разделы могут храниться в 1x PBS при температуре 4 °C и окрашиваются в более позднее время. Максимальное время хранения, испытано в этой рукописи, составляло 3 недели. Более длительное время хранения необходимо будет оптимизировать отдельным пользователем, если это желательно.
4. Проникая разделы с использованием 0,3% Тритон X-100 в 1x PBS в течение 30 мин.
   Примечание: этот шаг можно доработать и оптимизировать для специфически пятнать и проникания антитела.
5. Pipet от раствора перностизации.
6. Вымойте ломтики 3x в течение 5 минут с 1x PBS, 1% БСА, и 0,1% тритон X-100 (PBT).
7. Блок ломтики с блокирующим агентом с 1% нормальный козьего сыворотки для 1 ч.
8. Вымойте ломтики 3x в течение 5 минут с PBT.
9. Инкубировать ломтики ночь на 4 ° c с 500 мкл анти-Ki67 кролика моноклональных антител разбавленных в 1% БСА в 1x PBS.
   Примечание: для Фаллоидин окрашивание, пропустить шаг 6,9 и продолжить использовать протокол для конкретного phаллоидин используется. На ДНК-контрапятно, перейдите к шагу 6,15.
10. Аспирин анти-Ki67 кролика моноклональных антител.
11. Вымойте ломтики 6X в течение 5 минут в 1x PBS.
12. Инкубировать ломтики в 500 МКН из флуоресцентно спряженных вторичных антител совместимы с антителом Anti-Ki67 разбавленным в 1% БСА в 1x PBS на RT для 1,5 h покрыты от света.
    Примечание: основано на вторичной антитело используемой, время инкубации с вторичным антителом можно более добавочным оптимизировать индивидуальным потребителем. Кроме того, вторичное антитело является светочувствительным. Все последующие мойки должны выполняться в темноте.
13. Аспирин вторичных антител.
14. Вымойте ломтики для 3x в течение 5 минут с 1x PBS.
15. Вымойте ломтики на 5 минут в обожионизированной воде.
16. Контрпятно ломтики с DAPI (1мкг/мл) в течение 20 минут на RT.
17. Вымойте ломтики (один раз) на 5 минут в обожионизированной воде.
18. Гора ломтики с одной каплей (~ 40 мкл) монтажа средств массовой информации. Чтобы избежать лишних пузырей, медленно поместите покрывало на монтажные носители на слайде, начиная с угла 45 °.
    1. Чтобы предотвратить дробление толстых участков с помощью комбинезона, установите каждый кусочек с помощью прокладки. Прокладка может быть создана путем размещения обода вакуумной смазки в квадрат вокруг ткани раздела.
    2. При укладке кроя, края покрышек можно запечатать вакуумной смазкой. Нажмите на края комбинезона с большим пальцем, чтобы твердо придерживаться его на слайде. Кроме того, печать покрывало на Микроскоп слайд, используя четкие Лак для ногтей.

7. секции вибратоза изображений

1. Изображение окрашенных слайдов в течение 5 дней окрашивания.
2. Получить оптические разделы окрашенных фрагментов вибратомы с помощью конфокального микроскопа. С помощью конфокального микроскопа, получить z-стек на определенный шаг размер или принять отдельные изображения в зависимости от пользовательского экспериментального дизайна. Изображения могут быть рассмотрены на любом экране компьютера после конфокальной коллекции.
   Примечание: из-за толщины ломтиков вибратомы рекомендуется использовать кофокальный Микроскоп или область с возможностью стека z для визуализации деталей в образцах. Для изображений, используемых в этой рукописи, была использована 63-х нефтяная цель; Однако, это может быть приспособлена и дополнительно модифицирована индивидуальным пользователем и конкретной сферой применения. Рекомендованное разрешение пикселей для каждого объективного и зум-фактора с предполагаемыми сэмплирования Найквиста 2,5 пикселей в X и Y для мельчайших оптически разрешимых структур. Тем не менее, некоторые комментаторы предлагают 2,3 пикселей, в то время как другие предполагают 2,8 пикселей. Пожалуйста, обратитесь к справочнике биологической Кофокальной микроскопии²² для получения дополнительной информации о том, как сделать эти расчеты.

Результаты

Первичные 2-D культуры выращиваются в фетальной сыворотке говядины (ФПС) дополнены средствами массовой информации в то время как первичная 3-D культура салисферы, как правило, культивируются в сыворотке без условий^10,11. Кроме того, два пред...

Обсуждение

Исследования слюнных желез использовал ряд моделей культуры, в том числе увековечены 2-D культур, первичных 2-D культур, 3-D культуры салисферы, и 3-D органные культуры из эмбриональных эксфолиантов для выяснения вопросов на основе биологии и физиологии. Эти модели культуры дали глубокую ин...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold