下颌骨和腮腺表型模型对组织型培养的放射治疗是机体活力特征的关键

摘要

利用三维有机型培养物来可视化唾液腺的形态和功能标记, 可以为辐射后组织损伤的机制提供新的见解。这里描述的是一个协议的部分, 培养, 辐照, 染色, 和图像50-90 微米厚的唾液腺部分之前和之后的电离辐射照射。

摘要

尿道下管和口口术会引起慢性口腔并发症, 降低接受放射治疗的头颈部癌症患者的生活质量。了解唾液腺功能障碍和修复机制的实验方法集中在体内模型上, 这些模型因无法系统筛选治疗候选体和转染效率而受到阻碍操纵特定基因的能力。这一唾液腺有机型培养协议的目的是评估培养活力的最长时间, 并描述体内放射治疗后的细胞变化特征。我们使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜来确定在30天的培养期间, 特定的细胞群和标记物何时存在。此外, 以前在体内辐射模型中报告的细胞标记在体内辐照的培养物中进行评估。展望未来, 该方法是一个有吸引力的平台, 用于快速的体外评估小鼠和人唾液腺组织对治疗药物的反应, 改善唾液功能。

引言

适当的唾液腺功能对口腔健康至关重要, 并在头颈部癌症治疗后使用放射治疗1 改变。2017年, 美国报告了近 50,⁰⁰⁰例头颈部癌症新病例。由于放射治疗对唾液腺等周围正常组织的破坏和往往不可逆转的影响, 患者往往会受到严重的副作用和生活质量的下降 2^{,3, 4}. 我的工作是什么？辐射损伤引起的常见并发症表现为症状, 如口干 (口腔干燥的主观感觉)、蛀牙、咀嚼和吞咽能力受损、言语障碍和口腔微生物受损 2^{,3 个,4}. 这些症状共同导致受影响个人营养不良和生存受损 5。虽然这一人群中的唾液腺功能障碍有据可查, 但对腺节细胞损伤的潜在机制存在争议, 不同动物模型^{6、7 之间}几乎没有整合。

目前研究唾液腺功能和辐射引起的损伤的方法包括使用体内模型、永生细胞系、二维 (2-D) 原代细胞培养和三维 (三维) salisphere 培养物^{8, 9,10,11,12}。传统上, 来自不朽细胞系和二维培养的细胞培养模型涉及在平坦表面培养的单层细胞, 对于快速、简单且经济高效的实验非常有价值。然而, 人工细胞培养条件会改变暴露在各种条件下的细胞的分化状态和生理反应, 其结果往往不能转化为整个生物体模型^14,15.此外, 永生细胞培养物需要调节 p53 活性, 这对唾液腺对 dna 损伤的反应至关重要, 为 16^,17。

三维 salisphere 培养在培养的早期时间为干细胞和祖细胞^丰富, 对了解这一亚度腺体细胞的放射敏感性有很好的了解 9^,18。所有这些培养模型的一个关键限制是, 它们在可视化唾液腺的三维结构方面是无效的, 包括细胞外基质 (ECM) 和细胞在不同层的相互作用, 而这些是调节唾液的关键分泌物¹⁵。需要一种方法, 包括整个组织的行为, 但也可以在实验室条件下操纵, 以研究治疗的效果, 是必要的, 以进一步发现辐射引起的唾液腺的潜在机制功能 障碍。

活组织切片和培养已被记录以前^19,20 , 经常被用来研究脑组织相互作用²¹。在以前的研究中, 小鼠腮腺 (PAR) 唾液腺组织被分割在大约 50μm, 培养到 48小时, 此后对活力、细胞死亡和功能进行了分析^{, 19}。Su 等人(2016) 通过在 14天20天内培养人类下颌骨腺体 (Smg) 以35μm 或50μm 的速度进行扩展.该方法的进展是, 它包括腮腺和下颌唾液腺被分割在50μm 和90μm 和评估的培养30天。切割一系列组织厚度的能力对于评估细胞和细胞-ecm 相互作用很重要, 而这些相互作用与细胞过程有关, 包括顶基底外侧极性和分泌的神经支配。此外, 在培养过程中对唾液腺切片进行了辐照, 以确定该培养模型研究辐射引起的唾液腺损伤的可行性。

这一唾液腺有机型培养协议的目的是评估培养活力的最长时间, 并描述体内放射治疗后的细胞变化特征。为了确定解剖后可行的最长时间段, 进行了色氨酸蓝染色、活细胞染色和细胞死亡的免疫组织化学染色。共聚焦显微镜和免疫荧光染色用于评估特异性细胞群、形态结构和增殖水平。组织切片培养物也暴露在电离辐射下, 以确定辐射对这一三维模型中各种标记的影响。将诱导细胞死亡、细胞骨架破坏、分化标记丧失和在辐照体外培养物中的代偿增殖与以往体内模型的研究进行了比较。该方法为研究辐射损伤后细胞间相互作用提供了一种手段, 并为有效评估治疗干预 (基因操纵或药理药物) 的有效性提供了实验模型), 可能不太适合体内模型。

研究方案

1. 振动体的制备

1. 喷涂可拆卸部件的振动, 包括缓冲盘, 刀片附件, 琼脂糖块模具, 和实验室膜与70% 乙醇, 然后 uv 消毒至少30分钟。
2. 在缓冲盘上放置并固定一张额外的实验室薄膜, 以防止冰层掉进去。
3. 用碎冰填充冰室, 从缓冲盘中取出实验室膜, 然后用100毫升的冰凉1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液填充缓冲盘, 辅以1% 青霉素-氨匹西林 (PSA)。
4. 将不锈钢剃须刀刀片放入刀片支架中。使用螺丝刀拧紧并改变刀片的角度。

2. 琼脂糖块中组织样品的制备和振动体切片

1. 高压灭菌器所有必要的解剖和切片工具, 包括钳子、剪刀和画笔。
2. 在无菌 1x PBS 和微波中制备3% 的低熔点琼脂糖, 直到琼脂糖溶解成溶液。确保溶液不会沸腾, 定期将瓶子旋涡混合。
   注: 防止低熔融琼脂糖在一个温暖的水浴中固化。低熔融琼脂糖是37°c 的流体, 设置在25°c。然而, 水浴应低于 40°c, 以便在生理温度下将琼脂糖倒在组织周围。
3. 分离唾液腺, 并将解剖组织放入2毫升冰冷 1x PBS 中, 在无菌的30毫米培养皿中补充1% 的 PSA。
4. 使用高压钳, 从 1x PBS + 1% PSA 溶液中取出唾液腺, 并将其放置在嵌入模具的底部。用液体填充3% 低熔点琼脂糖覆盖组织。
5. 使用钳子, 将组织调整到块的中间, 并将唾液腺放置在适当的平面上。下颌和腮腺的最佳横截面在垂直平面上。
6. 在冰上放置琼脂糖块10分钟硬化。
7. 小心地在琼脂糖的外缘周围运行剃须刀片, 以松开, 并让块从步骤1.1 开始滑落到紫外线消毒的实验室薄膜上。
8. 用剃须刀片切掉一个含有唾液腺的琼脂糖盒。确保截面的平面是直的, 与块的另一侧平行 (将粘合的表面)。因为琼脂糖不渗透组织, 不修剪太多琼脂糖周围的组织, 所以组织将得到很好的支持。
9. 使用超级胶将块连接到切割表面。
10. 在50μm 或90μm 厚度的截面上, 以0.075 毫米的速度和 100 hz 的频率通过振动体进行振动。
    注: 将振动组设置为最高频率和最低刀片速度可提供最佳切片。
11. 收集在一个24孔组织培养盘含有 ~ 1 毫升冰凉 PBS 每口使用蒸压, 天然毛发画笔的部分, 把刷子在70% 的乙醇之间的切片集合, 以保持无菌。

3. 培养区

1. 高压灭菌器, 微型铲子和钳子。
2. 制作有或不含有胎儿牛血清 (FBS) 的股票振动体培养基: DMEM/F12 培养基补充 1% PSA, 5μg/ml 转铁蛋白, 1.1μm 氢化可的松, 0.1μm 维甲酸, 5μgml 胰岛素, 80 ngml 表皮生长因子, 5mm l-谷氨酰硫酸庆大霉素和10μlml 微量元素混合物。添加适当数量的 FBS, 使0%、2.5%、5.0% 或10% 的解决方案。
3. 在切片之前, 加入300Μl 的预热介质, 并将直径为12毫米、0.4μm 的孔径膜插入24孔组织培养板的每口井中。培养基应到达膜底, 形成用于培养的液-空气界面。
4. 在加湿 5% co 2 和95% 空气气氛孵化器中, 用微铲子在37°c 时培养, 轻轻地将唾液部分放置在膜插入物的顶部。
   1. 每隔一天或根据需要, 将大约300Μl 原生培养基放入井中, 并在膜插入物中滴几滴 (约 40Μl)。适当的培养表明, 这些细胞能够存活, 并在体内维持长达 3 0天。

4. 唾液腺部分的辐射

1. 使用钴-60 (或等效) 辐照器治疗单剂量辐射 (5 戈瑞) 的部分。
   1. 运输部分到辐照器设施使用有盖发泡胶容器, 以避免温度波动。此外, 在运输回实验室孵化器的过程中, 需要小心, 以确保介质不会溅到培养盖上并诱发污染。
   2. 将距离放射源80厘米的24孔板放置在 32 "x 32" 辐射场的中心。辐射剂量计算和相应的时间将因仪器和钴-60 衰变而异。
2. 如第3节所述, 继续监测和培养这些部分。

5. 可振动染色

1. 吸收旧培养基, 用无菌、预热的 1x PBS 清洗切片两次。
2. 用色氨酸蓝色染料染色部分。
   1. 使用微型铲子将切片从培养物移动到玻璃滑梯上。
   2. 在有足够体积覆盖组织 (10–20μl) 的振动片中加入0.4% 的色氨蓝色溶液。
   3. 在室温下 (RT) 在色氨酸蓝色中进行切片, 时间为 1–2分钟, 使染料能够穿透组织。不可行的细胞将被染成蓝色, 有活力的细胞将不被染色。
3. 用钙素染色, AM 活细胞染料染色。
   1. 添加足够体积的污渍, 以覆盖24井板 (200–300μl) 的井中的部分。
   2. 在 RT 中培养切片 15分钟, 以允许染料渗透。
   3. 小心地从井上取下部分, 放在玻璃滑梯上。使用1滴安装介质安装切片。
   4. 荧光显微镜上的图像切片, 发射波长为488纳米和515纳米。

6. 抗体染色振动部分

注: 以下是针对 ki-67 的一般抗体染色协议;然而, 该协议可以与任何抗体一起使用。除非另有说明, 所有清洗都在 RT 进行。

1. 在多井组织培养皿中, 抽吸培养基, 用无菌 1x PBS 清洗至少2倍。
2. 在4°C 下使用4% 的甲醛 (PFA) 过夜固定部分。
3. 吸收4% 的 PFA 和洗涤3倍与 PBT [1x PBS, 1% 牛血清白蛋白 (BSA), 0.1% Triton X-100]。
   注: 部分可以存储在 1x PBS 在4°C 和染色后的时间。在这份手稿中测试的最长储存时间为3周。如果需要, 单个用户需要优化更长的存储时间。
4. 在 1x PBS 中使用 0.3% Triton X-100 对切片进行30分钟的渗透。
   注: 此步骤可以修改和优化特定的抗体染色和渗透。
5. 管道脱落渗透液。
6. 用 1x PBS、1% BSA 和 0.1% Triton X-100 (PBT) 清洗切片 3x 5分钟。
7. 用1% 正常山羊血清阻滞剂将切片块1小时。
8. 用 PBT 清洗切片 3x 5分钟。
9. 用500μl 抗 ki67 兔单克隆抗体在 1x PBS 中稀释 1% BSA, 在4°c 下隔夜将切片进行隔夜培养。
   注: 对于 phalloidin 染色, 跳过步骤 6.9, 然后使用所使用的特定 phalloidin 的协议。对于 DNA 反染色, 请跳到步骤6.15。
10. 吸血抗 ki67 兔单克隆抗体。
11. 在 1x PBS 中清洗切片 6x 5分钟。
12. 将切片在500Μl 荧光共轭二级抗体中培养, 该抗体与抗 Ki67 抗体在 1x PBS 中稀释的 1% BSA 中, 在 rt 中被光覆盖1.5 小时。
    注: 根据所使用的二级抗体, 个体用户可以进一步优化与二级抗体的培养时间。此外, 二级抗体是光敏的。所有后续的清洗都必须在黑暗中进行。
13. 吸收二级抗体。
14. 用 1x PBS 清洗切片 3x 5分钟。
15. 在去离子水中清洗切片5分钟。
16. 用 DAPI (1Μg/ml) 进行反染色切片20分钟。
17. 在去离子水中清洗切片 (一次) 5分钟。
18. 用一滴 (~ 40μl) 的安装介质安装切片。为避免过量气泡, 请从45°角度开始, 慢慢将盖板放置在幻灯片上的安装介质上。
    1. 为了防止用盖板压碎厚的部分, 请用间隔器安装每个切片。通过将真空润滑脂的边缘放置在组织部分周围的正方形中, 可以创建一个垫片。
    2. 铺设盖板时, 盖板的边缘可以用真空润滑脂密封。用拇指按下盖板的边缘, 将其牢固地粘附在滑梯上。或者, 使用透明的指甲油将盖板密封在显微镜幻灯片上。

7. 成像振动部分

1. 在染色后5天内对染色的幻灯片进行成像。
2. 使用共聚焦显微镜获得染色振动体切片的光学切片。使用共聚焦显微镜, 获得一个 z 堆栈在一个定义的步骤大小或采取个别图像, 具体取决于用户的实验设计。共聚焦采集后, 任何计算机屏幕上都可以检查图像。
   注: 由于振动体切片的厚度, 建议使用共聚焦显微镜或具有 z 堆栈功能的示波器来可视化样品中的细节。对于本手稿中使用的图像, 使用了63x 的石油目标;但是, 这可以由单个用户和使用的特定范围进行定制和进一步修改。对于最小的光学可解析结构, 使用了每个目标的推荐像素分辨率和假定的 Nyquist 采样在 X 和 Y 中的变焦系数。然而, 一些评论家建议2.3 像素, 而另一些评论家则建议2.8 像素。有关如何进行这些计算的更多详细信息, 请参阅《生物共聚焦显微镜手册22》。

结果

原代二维培养在胎儿牛血清 (FBS) 补充培养基中生长, 而原代三维 salisphere 培养通常在^无血清条件下培养 10^,11。此外, 前两项研究利用唾液腺的振动体培养物, 以0% 或10% 的 fbs 补充培养基 19^,20。使用振动体将小鼠下颌切片切割成50μm 的厚度, 并使用一系列 FBS 浓度 (0%、2.5%、5.0% 和 10%) 确定...

讨论

唾液腺体的研究已经利用了一些培养模型, 包括不朽的二维培养, 初级二维培养, 三维 salisphere 培养, 和三维器官培养从胚胎外植体, 以确定潜在的生物学和生理学的问题。这些文化模式在各种研究问题上产生了有见地的信息, 并将继续成为唾液研究的重要工具。这些培养模型的局限性包括在永生过程中对 p53 活性的调节、原代培养的短暂活力、培养过程中分化和分泌蛋白的丧失, 以及无法评估细胞、...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold