Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

Resumo

Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.

Resumo

A hiposalivação e xerostomia criam complicações orais crônicas que diminuem a qualidade de vida em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que são tratados com radioterapia. Abordagens experimentais para a compreensão de mecanismos de disfunção da glândula salivar e restauração têm focado em modelos in vivo, que são deficientes por uma incapacidade de sistematicamente tela candidatos terapêuticos e eficiências na transfecção capacidade de manipular genes específicos. A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Nós utilizamos a mancha imunofluorescente e a microscopia confocal para determinar quando as populações e os marcadores específicos da pilha estão atuais durante um período da cultura de 30 dias. Além disso, marcadores celulares previamente relatados em modelos de radiação in vivo são avaliados em culturas que são irradiadas ex vivo. Avançando, este método é uma plataforma atrativa para a avaliação ex vivo rápida de respostas murino e humanas do tecido da glândula salivar aos agentes terapêuticos que melhoram a função salivar.

Introdução

A função apropriada da glândula salivar é essencial à saúde oral e é alterada depois do tratamento do cancro da cabeça e da garganta com radioterapia¹. Em 2017, quase 50.000 casos novos do cancro da cabeça e da garganta foram relatados nos Estados Unidos². Devido aos efeitos tecido-prejudiciais e freqüentemente irreversíveis da terapia de radiação em tecidos normais circunvizinhos tais como as glândulas salivares, os pacientes são deixados frequentemente com efeitos secundários severos e a qualidade de vida diminuída^2,3, a ⁴. Complicações comuns causadas por danos causados por radiação manifestam-se em sintomas como xerostomia (sensação subjetiva de boca seca), cárie dentária, capacidade prejudicada de mastigar e engolir, comprometimentos de fala e Ademir orais comprometidos^{2, 3. º , 4}. estes sintomas coletivamente podem levar à desnutrição e à sobrevida prejudicada em indivíduos afetados⁵. Enquanto a disfunção da glândula salivar nesta população tem sido bem documentada, os mecanismos subjacentes de danos às células acinares têm sido disputados, e há pouca integração entre diferentes modelos animais^6,7.

Os métodos atuais de estudar a função da glândula salivar e os danos radiação-induzidos incluem o uso de in vivo modela, linhas de pilha imortalized, culturas de pilha preliminares bidimensionais (2-D), e culturas tridimensionais (3-D) do salisphere^{8, 9,10,11,12}. Tradicionalmente, os modelos de cultura celular de linhas celulares imortalizadas e culturas 2-D envolvem células únicas em camadas cultivadas em superfícies planas e são valiosas para uma experimentação rápida, fácil e econômica. No entanto, as condições de cultura de células artificiais podem alterar o status de diferenciação e as respostas fisiológicas das células expostas a várias condições, e os resultados muitas vezes não conseguem traduzir para modelos de organismos inteiros^14,15. Além, as culturas de pilha imortalizado exigem a modulação da atividade p53, que é crítica para a resposta da glândula salivar aos danos do ADN^16,17.

as culturas 3-D do salisphere são enriquecidas para pilhas da haste e do progenitor em pontos do tempo adiantado na cultura e têm sido úteis para compreender a radiosensibilidade deste subconjunto de pilhas da glândula salivar^9,18. Uma limitação crítica de todos estes modelos da cultura é que são ineficazes em Visualizar a estrutura 3-D da glândula salivar, incluindo a matriz extracelular (ECM) e as interações da pilha-pilha sobre várias camadas, que são cruciais em modulando salivar secreção de¹⁵. A necessidade de um método que engloba o comportamento do tecido como um todo, mas também pode ser manipulado em condições laboratoriais para estudar os efeitos do tratamento é necessário para descobrir ainda mais os mecanismos subjacentes da glândula salivar induzida por radiação Disfunção.

O seccionamento e a cultura vivos do tecido foram documentados previamente^19,20 e são usados frequentemente para estudar interações do cérebro-tecido²¹. Em estudos prévios, o tecido da glândula salivar do parotid (PAR) dos ratos foi seccionado em aproximadamente 50 μm e cultivado para até 48 h, e a análise da viabilidade, da morte de pilha, e da função foi executada Depois disso¹⁹. Su et al. (2016) expandiu-se sobre esta metodologia, cultivando glândulas submandibulares humanas (SMGs) seccionadas a 35 μm ou 50 μm por 14 dias²⁰. O método proposto é um avanço em que inclui ambas as glândulas salivares parótidas e submandibulares seccionadas em 50 μm e 90 μm e avaliação das culturas por 30 dias. A habilidade de cortar uma escala da espessura do tecido é importante em avaliar as interações da pilha-pilha e do Cell-ECM que são relevantes para os processos celulares que incluem a polaridade apical-basolateral e a inervação para a secreção. Além disso, as fatias da glândula salivar foram irradiadas quando na cultura para determinar a viabilidade deste modelo da cultura para estudar dano radiação-induzido da glândula salivar.

A finalidade deste protocolo da cultura queratinócitos da glândula salivar é avaliar o tempo máximo da viabilidade da cultura e caracterizar mudanças celulares depois do tratamento de radiação ex vivo. Para determinar as seções do tempo máximo que são borne-dissecção viável, a mancha azul do Tripan, a mancha viva da pilha, e a mancha immunohistochemical para a morte da pilha foram executadas. Microscopia confocal e coloração imunofluorescente foram utilizadas para avaliar populações específicas de células, estruturas morfológicas e níveis de proliferação. As culturas da seção do tecido foram expostas igualmente à radiação ionizante para determinar os efeitos da radiação em vários marcadores neste modelo 3-D. A indução de morte celular, ruptura do citoesqueleto, perda de marcadores de diferenciação e proliferação compensatória em culturas ex vivo irradiadas foram comparadas com estudos prévios de modelos in vivo. Esta metodologia fornece um meio para investigar o papel das interações célula-célula após dano de radiação e fornece um modelo experimental para avaliar eficientemente a eficácia de intervenções terapêuticas (manipulações genéticas ou agentes farmacológicos ) que podem ser menos adequados para modelos in vivo.

Protocolo

1. preparação do do

1. Pulverize componentes destacáveis do do que inclui a bandeja do amortecedor, o acessório da lâmina, o molde do bloco do agarose, e a película do laboratório com etanol 70%, a seguir UV-sterilize por pelo menos 30 minutos.
2. Coloc e prenda uma folha adicional de película do laboratório sobre a bandeja do amortecedor para impedir que o gelo caia dentro.
3. Encha a câmara de gelo com gelo esmagado, retire a película do laboratório da bandeja do amortecedor, e encha a bandeja do amortecedor com 100 mL da solução salina tampão do fosfato do gelo-frio 1x (PBS) suplementada com a penicilina-estreptomicina-ampicilina de 1% (PSA).
4. Coloque uma lâmina de barbear em aço inoxidável no suporte da lâmina. Use a chave de fenda para apertar/afrouxar e mudar o ângulo da lâmina.

2. preparação da amostra de tecido em bloco de agarose e seccionamento usando o do

1. Autoclave todas as ferramentas de dissecção e corte necessárias, incluindo fórceps, tesouras e pincéis.
2. Prepare 3% de baixo agarose ponto de fusão em estéril 1X PBS e microondas até que o agarose se dissolve em solução. Assegure-se de que a solução não ferva e gire a garrafa periodicamente para misturar.
   Nota: impeça o agarose da baixo-derretimento de solidificar mantendo o em um banho de água morno. O agarose do baixo-derretimento é fluido em 37 ° c e ajusta-se em 25 ° c. Entretanto, o banho de água deve estar abaixo de 40 ° c a fim derramar o agarose em torno do tecido na temperatura fisiológica.
3. Isole as glândulas salivares e coloc o tecido dissecado em 2 mL gelo-frio 1X PBS suplementado com o PSA de 1% em um prato estéril, da cultura de 30 milímetros.
4. Usando fórceps autoclavado, remova as glândulas salivares de 1X PBS + 1% PSA solução e posição na parte inferior de um molde de incorporação. Encha o molde com o agarose baixo do ponto de derretimento do líquido 3% para cobrir o tecido.
5. Usando o fórceps, ajuste o tecido ao meio do bloco e posicione a glândula salivar no plano apropriado. As melhores secções transversais para as glândulas submandibulares e parótidas estão no plano vertical.
6. Coloc o bloco do agarose no gelo por 10 minutos para endurecer.
7. Execute com cuidado uma lâmina de barbear em torno da borda exterior do agarose para afrouxar e deixe o bloco deslizar para fora na película UV-sterilized do laboratório da etapa 1,1.
8. Use uma lâmina de barbear para cortar uma caixa de agarose contendo a glândula salivar. Assegure-se de que o plano da seção é reto e paralelo ao lado oposto do bloco (a superfície que será colada para baixo). Desde que o agarose não se infiltra o tecido, não apare fora demasiado agarose em torno do tecido assim que o tecido será apoiado bem.
9. Use a supercola para fixar o bloco na superfície de corte.
10. Seção em 50 μm ou 90 μm de espessura por do a uma velocidade de 0, 75 mm/s e freqüência de 100 Hz.
    Nota: a definição do do na frequência mais alta e a velocidade mais baixa da lâmina proporcionam as fatias mais ideais.
11. Colete seções em um 24-bem tecido cultura prato contendo ~ 1 mL gelo-frio PBS por bem usando um autoclavado, pincel de cabelo natural, colocando a escova em 70% etanol entre coleções fatia para manter a esterilidade.

3. seções de cultivo

1. Autoclave uma microespátula e fórceps.
2. Fazer estoque meios de cultura vibratoma com ou sem soro bovino fetal (FBS): DMEM/F12 mídia suplementada com 1% PSA,5 μg/mL transferrina, 1,1 μM de hidrocortisona, 0,1 μM de ácido retinóico, 5 μg/mL de insulina, 80 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 5 mM L-glutamina, 50 μg sulfato de gentamicina e 10 μL/mL de mistura de oligoelementos. Adicione uma quantidade apropriada de FBS para fazer soluções de 0%, 2,5%, 5,0% ou 10%.
3. Antes de seccionamento, adicione 300 μL de meios pré-aquecidos e coloque um diâmetro de 12 mm, uma pastilha de membrana de tamanho de poros de 0,4 μm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. A mídia deve chegar à parte inferior da membrana para criar uma interface de ar líquido para a cultura.
4. Coloque delicadamente as seções salivares sobre a inserção da membrana usando o micro espátula e a cultura em 37 ° c na incubadora humidificada da atmosfera de 5% co₂ e 95% Air.
   1. Adicione aproximadamente 300 μL de meios de cultura primários no poço e algumas gotas nas pastilhas de membrana (aproximadamente 40 μL) a cada outro dia ou conforme necessário. A cultura adequada mostrou que as células são capazes de sobreviver e ser mantido por até 30 dias ex vivo.

4. irradiação das secções da glândula salivar

1. Trate seções com uma única dose de radiação (5 GY) usando cobalto-60 (ou equivalente) irradiador.
   1. Seções do transporte à facilidade do irradiador usando um recipiente coberto do isopor para evitar flutuações na temperatura. Além, o cuidado precisa de ser tomado durante o transporte de volta à incubadora do laboratório para assegurar-se de que os meios não espirrem na tampa da cultura e induzem a contaminação.
   2. Coloque a placa de 24 poços contendo seções da glândula salivar 80 cm da fonte de radiação, no centro de um campo de radiação 32 "x 32". Os cálculos da dose de radiação e o tempo correspondente no irradiador variarão pelo instrumento e pela deterioração de Cobalt-60.
2. Continue monitorando e cultivando essas seções conforme descrito na seção 3.

5. coloração da viabilidade

1. Aspirar meios velhos e lavar fatias duas vezes com estéril, pre-aquecido 1X PBS.
2. Seções da mancha com tintura azul do Tripan.
   1. Use uma microespátula para mover a fatia da cultura para um slide de vidro.
   2. Adicione 0,4% de solução azul de Tripan à fatia de vibratoma com volume suficiente para cobrir o tecido (10 – 20 μL).
   3. Incubar fatias em temperatura ambiente (RT) no azul de Tripan por 1 – 2 min para que o corante penetre no tecido. Células não viáveis serão manchadas de azul, e células viáveis serão desmanchadas.
3. Seções da mancha com calcein, tintura da vivo-pilha do AM.
   1. Adicione volume suficiente de mancha para cobrir a seção em um poço de uma placa de 24 poços (200 – 300 μL).
   2. Incubar fatias em RT por 15 min para permitir a penetração da tintura.
   3. Retire cuidadosamente a secção do poço e coloque-a numa lâmina de vidro. Montar fatias com 1 gota de suportes de montagem.
   4. Seções da imagem em um microscópio fluorescente em comprimentos de onda da excitação/emissão de 488 nanômetro e de 515 nanômetro.

6. anticorpo que mancha seções do do

Nota: o seguinte fornece um anticorpo geral que mancha o protocolo específico para Ki-67; no entanto, este protocolo pode ser usado com qualquer anticorpo. Todas as lavas são conduzidas na RT, salvo indicação em contrário.

1. No prato da cultura do tecido do multi-poço, aspirar fora dos meios e lavar pelo menos 2x com o PBS 1x estéril.
2. Fixar secções com 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.
3. Aspirar fora de 4% PFA e lavar 3x com PBT [1X PBS, 1% albumina sérica bovina (BSA), 0,1% Triton X-100].
   Nota: as secções podem ser armazenadas em 1X PBS a 4 ° c e manchadas num momento posterior. O tempo máximo de armazenamento testado neste manuscrito foi de 3 semanas. O tempo de armazenamento mais longo precisará ser otimizado pelo usuário individual, se isso for desejado.
4. Seções de permeabilização usando 0,3% Triton X-100 em 1X PBS por 30 min.
   Nota: esta etapa pode ser modificada e otimizada para coloração e permeabilização de anticorpos específicos.
5. Pipet fora da solução da permeabilização.
6. Lave as fatias 3x por 5 min com 1X PBS, 1% BSA e 0,1% Triton X-100 (PBT).
7. Bloqueie as fatias com o agente de bloqueio com 1% de soro de cabra normal por 1 h.
8. Lave as fatias 3x por 5 min com PBT.
9. Incubar as fatias durante a noite a 4 ° c com 500 μL de anticorpo monoclonal de coelho anti-67 diluído em 1% de BSA em 1X PBS.
   Nota: para a coloração de faloidina, pule a etapa 6,9 e prossiga usando o protocolo para o faloidina específico usado. Para a contratura do ADN, avance para o passo 6,15.
10. Aspirar anti-67 anticorpo monoclonal de coelho.
11. Lave as fatias de 6x por 5 min em 1X PBS.
12. Incubar as fatias em 500 μL de anticorpo secundário conjugado fluorescentamente compatível com o anticorpo anti-67 diluído em 1% BSA em 1X PBS em RT por 1,5 h coberto de luz.
    Nota: com base no anticorpo secundário utilizado, o tempo de incubação com o anticorpo secundário pode ser optimizado pelo utilizador individual. Além disso, o anticorpo secundário é sensível à luz. Todas as lavas subsequentes devem ser executadas no escuro.
13. Aspirar anticorpo secundário.
14. Lave as fatias por 3x por 5 min com 1X PBS.
15. Lave as fatias por 5 min em água desionizada.
16. Fatias de contracoloração com DAPI (1μg/mL) por 20 min em RT.
17. Lave as fatias (uma vez) durante 5 min em água desionizada.
18. Montar fatias com uma gota (~ 40 μL) de suportes de montagem. Para evitar bolhas em excesso, coloque lentamente a lamínula na mídia de montagem no slide, começando com um ângulo de 45 °.
    1. Para evitar esmagar as secções grossas com a lamínula, monte cada fatia com um espaçador. Um espaçador pode ser criado coloc uma borda da graxa do vácuo em um quadrado em torno da seção do tecido.
    2. Ao colocar a lamínula, as bordas da lamínula podem ser seladas com graxa a vácuo. Pressione para baixo nas bordas da lamínula com o polegar para aderir firmemente a ele no slide. Alternativamente, sele a lamínula na corrediça do microscópio usando o lustrador de prego desobstruído.

7. seções do do da imagem latente

1. Imagem as lâminas manchadas dentro de 5 dias de coloração.
2. Obtenha seções ópticas das fatias do manchadas usando um microscópio confocal. Com um microscópio confocal, obtenha uma pilha z em um tamanho de etapa definido ou faça exame de imagens individuais dependendo do projeto experimental do usuário. As imagens podem ser examinadas em qualquer tela do computador após a coleta confocal.
   Nota: devido à espessura das fatias do do, recomenda-se que um microscópio confocal ou um espaço com capacidade da z-pilha esteja usado para visualizar detalhes dentro das amostras. Para as imagens utilizadas neste manuscrito, utilizou-se um objetivo de óleo de 63x; no entanto, isso pode ser adaptado e modificado pelo usuário individual e pelo escopo específico usado. A resolução de pixel recomendada para cada objetivo e fator de zoom com a amostragem de Nyquist presumido de 2,5 pixels em X e Y para a menor estrutura opticamente resolvível foi usada. No entanto, alguns comentaristas sugerem 2,3 pixels, enquanto outros sugerem 2,8 pixels. Refira por favor o manual da microscopia confocal biológica²² para mais detalhes em como fazer estes cálculos.

Resultados

As culturas 2-D preliminares são crescidas em meios suplementados do soro bovino fetal (FBS) quando a cultura 3-D preliminar de salisphere for cultivada tipicamente em condições soro-livres^10,11. Além disso, os dois estudos prévios utilizando culturas do de glândulas salivares cultivou suas seções em 0% ou 10% FBS suplementados Media^19,20. As fatias submandibulares...

Discussão

A pesquisa da glândula salivar utilizou uma série de modelos de cultura, incluindo culturas 2-D imortalizadas, culturas 2-D primárias, culturas de salisphere 3-D e culturas de órgãos 3-D de explantes embrionários para averiguar questões sobre Biologia e fisiologia subjacentes. Esses modelos de cultura produziram informações perspicazes em uma variedade diversificada de perguntas de pesquisa e continuarão a ser ferramentas importantes na pesquisa salivar. As limitações desses modelos de cultura incluem a modul...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold