زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية

Summary

نحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة لزرع 2'-ديوكسيغوانوسين المعالجة E18.5 الغدة الصعترية في كبسولة الكلى من فأر عارية. هذه الطريقة ينبغي أن يساعد في دراسة كل من وظائف الخلايا الظهارية الثيميك ونضج الخلايا T.

Abstract

الغدة الصعترية هو جهاز مناعي مركزي مهم، والذي يلعب دورا أساسيا في تطوير وتمايز الخلايا T. زراعة الغدة الصعترية هي طريقة هامة للتحقيق في وظيفة الخلايا الظهارية الغدية ونضج الخلايا T في الجسم الحي. هنا سوف نصف الطرق التجريبية المستخدمة في مختبرنا لزرع 2'-ديوكسيغوانوسين (لاستنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة) علاج الغدة الصعترية الجنينية في كبسولة الكلى من فأر ة عارية الكمية. هذه الطريقة بسيطة وفعالة على حد سواء ولا تتطلب مهارات أو أجهزة خاصة. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة البسيطة أن الغدة الصعترية المزروعة يمكن أن تدعم بشكل فعال إنتاج الخلايا T المتلقي. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم زيادة توضيح عدة نقاط رئيسية فيما يتعلق بالبروتوكول.

Introduction

الغدة الصعترية هو الجهاز المناعي المركزي ، داخل الغدة الصعترية تخضع لاختيار إيجابي وسلبي ، وتصبح ناضجة الخلايا T^1،2. نتائج اختيار إيجابية أو سلبية غير طبيعية في نقص المناعة أو أمراض المناعة الذاتية على التوالي^3،4. لذلك، زرع الأعضاء الغدة الصعترية هو نهج مهم لدراسة عملية اختيار الخلايا T في الغدة الصعترية المانحة. هذه الطريقة حاسمة بشكل خاص عند تحليل وظيفة الظهارية الثيميك بوساطة الطفرات الجينية التي تسبب النمط الظاهري القاتل الجنيني عند تغيير⁵.

من أجل دراسة نضج الخلايا T المتلقي في الغدة الصعترية المزروعة، استنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة داخل الغدة الصعترية أمر ضروري. ولهذا الغرض، عادة ما يتم اختيار الغدة الصعترية الجنينية 14-، 15- أو 16 يوما (E14، E15، E16) الغدة الصعترية^6،7. الغدة الصعترية من مراحل أكثر نضجا يمكن أيضا أن تستنفد بنجاح من الخلايا الليمفاوية المانحة عن طريق علاج مع 2'-ديوكسيغوانوسين. ومع ذلك، لم يتم وصف بروتوكول مفصل لاستنفاد الخلايا الليمفاوية واستخدام ثقافة الغدة الصعترية القديمة من قبل^8،9. في حين تم إدخال بروتوكولات زرع من قبل العديد من الدراسات^10،11، ومن الضروري إجراء مزيد من التعديل وتحسين هذه البروتوكولات.

يتم فصل بروتوكولنا إلى جزأين: '1' استنفاد الخلايا الليمفاوية T من مرحلة النمو المتأخرة E18.5 الغدة الصعترية من قبل الثقافة في 2'-deoxyguanosine التي تحتوي على وسائل الإعلام. '2' زرع الغدة الصعترية المثقفة في المتلقين. في هذا الإجراء، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتسليم الأنسجة الكبيرة (E18.5 thymus) في كبسولة الكلى مع انخفاض فرصة الإصابة في الكلى. في حين تركز على الغدة الصعترية في مرحلة لاحقة، يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكولنا مباشرة أو مع تعديلات لزرع الغدة الصعترية في مختلف مراحل النمو أو غيرها من الأنسجة ذات الحجم المماثل.

Protocol

ويلتزم البروتوكول المقدم بالمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات بجامعة جينان فيما يتعلق برعاية الحيوانات.

ملاحظة: المواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الغدة الصعترية الجنينية

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل التجربة، وتعقيم مقاعد البدلاء / هود مع الإيثانول 70٪.
2. باستخدام ثاني أكسيد الكربون، والتخدير والرحيم الماوس الإناث الحوامل (18.5 يوما بعد التزاوج الناجح). ثم مسح منطقة البطن مع الإيثانول 70٪.
   ملاحظة: هنا نحن التزاوج Insm1^+/lacZ الإناث وInsm1^+/lacZ الذكور. وقد تم حقن البنتوباربيتال داخل المشيمة قبل عزل الأجنة عن الرحم، وتم قطع الرأس لكل جنين.
3. باستخدام مقص، وجعل "V" على شكل قطع على البطن بدءا من المثانة وتشغيل حتى كل قرن من الرحم.
4. باستخدام المقص، وقطع mesometrium وعنق الرحم / المهبل، وجمع الرحم. ضع الرحم في طبق بيتري يحتوي على ملح بارد بالفوسفات (PBS) على الجليد. بعد ذلك، فضح الأجنة التي هي في decidua المغلفة، عن طريق قطع جدار الرحم الأمامي من قرن الرحم واحد إلى الآخر. باستخدام ملاقط غرامة، قشر مرة أخرى الأنسجة المغلفات المغلفة وقطع الحبل السري للإفراج عن الأجنة. ضع جميع الأجنة في طبق بيتري جديد على الجليد حتى عزل الغدة الصعترية.
5. مسح الجنين مع الكحول 70٪ ووضعها في طبق بيتري جديد. من هذه الخطوة على، تأكد من الحفاظ على الظروف العقيمة.
6. عن طريق قطع قريبة من الفك السفلي مع مقص، وإزالة رأس الجنين واستنزاف الدم مع منشفة ورقية. بعد ذلك، إصلاح الجنين على نفس طبق بيتري في موقف supine.
   ملاحظة: قطعنا قطعة من ذيل كل جنين لInsm1 وlacZ علم الوراثة.
7. باستخدام مقص، وقطع جدار الصدر الجانبي أفقيا على طول الجبهة الإبطية، ومن ثم قطع الحجاب الحاجز لفتح الصدر. يجب أن يكون الغدة الصعترية الآن مرئية كفصوص بيضاء تقع أمام القصبة الهوائية والمتاخمة للقلب.
8. ضع ملقط عازمة طرف وراء الغدة الصعترية ومن ثم سحب قبالة الغدة الصعترية بلطف. تأكد من التحقق من سلامة الغدة الصعترية للتأكد من أنه يحتوي على فصوص مشتركة اثنين.
9. غسل الغدة الصعترية مع 1X PBS وتقليم قبالة الأنسجة الضامة والأوعية الدموية تحت مجهر مجسم.

2- ثقافة الغدة الصعترية الجنينية المعزولة

1. إضافة 500 درجة مئوية من وسط الثقافة (RPMI1640 + 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS) + 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربيوميسين) إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. نقل الثيمي نظيفة في الآبار مع واحد الغدة الصعترية لكل بئر. يعرض الشكل 1 الغدة الصعترية المعزولة في وسائل الإعلام الثقافية.
2. إلى كل الغدة الصعترية التي تحتوي على جيدا إضافة 2'-ديوكسيجرانوسين إلى تركيز نهائي من 1.25 mM.
3. ثقافة الغدة الصعترية المعزولة لمدة ثمانية أيام، ومنعش كل من وسائل الإعلام الثقافة و2'-ديوكسيجرانوسين كل يومين.

3. إنشاء الفضاء تحت القبعات في كبسولة الكلى

1. لإعداد الإبرة وأنبوب التسريبالمقطوع (الشكل 2)، وقطع إبرة الوريد فروة الرأس على جزء الأنبوب في زاوية 45 درجة باستخدام مقص.
2. وزن الماوس عارية ومن ثم التخدير مع pentobarbital (1.5٪) حقن (75 ميكروغرام / ز وزن الجسم).
3. عندما لا يتم ملاحظة أي رد فعل بعد قرصة اصبع القدم، ضع الماوس على طاولة التشغيل في وضع جانبي الحق.
4. مع مسحة اليود البوفيدون 0.5٪، تطهير الجلد مرتين في المنطقة الجراحية من الداخل إلى خارج الجسم.
5. باستخدام مقص، جعل شق الجلد 5-9 ملم موازية للعمود الفقري في منطقة الكلى اليسرى (بين الضلع الأخير وقمة الحرقفي). بعد ذلك، افتح تجويف البطن عن طريق قطع الأنسجة والعضلات تحت الجلد وفضح الكلى.
6. مع تعرض الكلى، استخدم زوجًا من الملقط في يد واحدة لرفع العضلات والأنسجة الدهنية من حافة الشق على جانب العمود الفقري. مع اليد الأخرى، اضغط بلطف على الكلى خارج (بدلا من ذلك، يمكن الضغط على الكلى باستخدام أصابع كلتا اليدين).
7. للتأكد من أن كبسولة الكلى رطبة أثناء الجراحة، بلل سطح الكلى مع محلول ملحي (0.9٪ حمض الكلى).
8. إنشاء شق في كبسولة الكلى، وخدش بلطف كبسولة الكلى على الجانب الأيمن السفلي باستخدام طرف إبرة أعدت في الخطوة 3.1. يجب أن يكون حجم النك 1/2-2/3 عرض الكلى; لا خدش على الكلى.
9. حرك أنبوب التسريب المعد في الخطوة 3.1 إلى شق على كبسولة الكلى. فكّن الكبسولة الكلوية بلطف مع الكلى على طول الجانب الطويل للكلية حتى تصل إلى 3-4 ملم داخل كبسولة الكلى. سحب مرة أخرى أنبوب التسريب. يتم تأسيس المساحة تحت القبعات الكلى.

4. زرع الغدة الصعترية المورين الجنينية

1. غسل الغدة الصعترية المستزرعة في الخطوة 2.3 مرتين في المالحة لاستنزاف وسائل الإعلام الثقافية.
2. قم بتوصيل أنبوب التسريب المقطوع المعد في الخطوة 3.1 بحقنة في واجهة توصيل الحقنة الخاصة به. يستنشق الغدة الصعترية المعدة في أنبوب التسريب ببطء.
3. أدخل أنبوب التسريب المقطوع برفق في كبسولة الكلى ووصل إلى القطب العلوي. تسليم الغدة الصعترية في كبسولة الكلى. سحب الأنبوب ببطء في حين دفع في وقت واحد الغطاس من الحقنة بلطف.
4. باستخدام مصباح الكحول، تسخين قليلا الإبرة المعدة في الخطوة 3.1. بعد التأكد من أن الغدة الصعترية كلها داخل الفضاء تحت القبعات، استخدم الإبرة ساخنة لكي النك.
5. بعد الكي ، استعادة الكلى في تجويف البطن. خياطة الصبغة والعضلات.
6. باستخدام خياطة فراش عمودي ة معدلة توقف، أغلق شق الجلد (ربط ما لا يقل عن ثلاثة عقدة وقطع أي خيط الزائدة).
7. باستخدام مسحة اليود البوفيدون، تطهير الشق. لتخفيف الألم، تم إجراء حقن تحت الجلد من الفلونيكسين (2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) خلال الجراحة ثم لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
8. حتى يتعافى تماما من التخدير، والحفاظ على الماوس الحارة تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء.
9. الحفاظ على الغدة الصعترية في كبسولة الكلى المتلقي لمدة 8 أسابيع قبل تشريح الغدة الصعترية المزروعة وإجراء تحليل الفينوتيبيك كما سبق وصفه^5،8،9.

النتائج

هنا نُظهر الغدة الصعترية E18.5 المعزولة التي تحتوي على فصوص كاملة (الشكل1). بالإضافة إلى ذلك، نعرض إبرة الوريد فروة الرأس التي تمقصها لتشكيل شطبة على أنبوب التسريب (الشكل 2). بعد ذلك، نعرض أيضًا صورة تمثيلية عن موضع الغدة الصعترية التي تم زرعها في كبسولة الكلى (?...

Discussion

زرع الكُبسة الكلوية للمُدَدَدَيّة الجنينية هو طريقة هامة لدراسة وظيفة الخلايا الظهارية الثيميك وعملية نضج الخلايا التائية في الجسم الحي. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات التجريبية على زراعة الأعضاء الغدة الصعترية الجنينية وزرع^6،7، بروتوكولنا يوفر ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use