הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

Summary

אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.

Abstract

התימוס הוא איבר החיסון המרכזי חשוב, אשר ממלא תפקיד חיוני בפיתוח והבידול של תאים T. השתלת התימוס היא שיטה חשובה לחקירת תפקוד התא האפיתל הרתי ו T התבגרות תאים ב vivo. כאן נתאר את השיטות הנסיוניות המשמשות בתוך המעבדה שלנו להשתלה 2 '-deoxyguanosine (כדי לרוקן לימפוציטים של התורם) שטופלו בתימוס מתחלקים לתוך קפסולת הכליה של עכבר עירום athymic. שיטה זו היא פשוטה ויעילה ואינה דורשת מיומנויות או מכשירים מיוחדים. התוצאות שהתקבלו באמצעות שיטה זו פשוטה הראה כי התימוס המושתלים יכול לתמוך ביעילות הייצור של תאי T של המטופל. בנוסף, מספר נקודות מפתח ביחס לפרוטוקול יהיה מובהר עוד יותר.

Introduction

התימוס הוא איבר החיסון המרכזי, בתוך thymocytes התימוס עוברים בחירה חיובית ושלילית, ולהיות תאים T בוגרים^1,2. בחירה חיובית או שלילית לא תקין תוצאות כשל חיסוני או הפתווגיות אוטואימוניות בהתאמה^3,4. לכן, השתלת איברים התימוס היא גישה חשובה ללמוד את התהליך של בחירת תאים T ב בלוטת התימוס של התורם. שיטה זו היא חיונית במיוחד כאשר ניתוח הרתי אפיתל בתיווך על ידי מוטציות גנים אשר לגרום פנוטיפים מעובריים קטלני כאשר מוטציה⁵.

כדי ללמוד את ההבשלה של תאים T של המטופל בתימוס המושתלים, דלדול לימפוציטים של התורם בתוך התימוס הוא הכרחי. למטרה זו, עובריים 14, 15 או 16 יום (E14, E15, E16) התימוס הוא בדרך כלל בחירה^6,7. התימוס משלבים בוגרים יותר יכול להיות גם מרוקן בהצלחה של לימפוציטים של התורם על ידי טיפול עם 2 '-deoxyguanosine. עם זאת, פרוטוקול מפורט עבור לימפוציטים מכלה ושימוש של תרבות בלוטת התימוס הישנה לא תוארה קודם לכן^8,9. בעוד פרוטוקולי ההשתלה הוכנסו על ידי מספר מחקרים^10,11, שינוי נוסף ושיפור של פרוטוקולים אלה הוא הכרחי.

הפרוטוקול שלנו מופרד לשני חלקים: (i) המחסור של לימפוציטים T משלב התפתחותי מאוחר E 29.8 בלוטת התימוס על ידי תרבות ב 2 '-deoxyguanosine המכיל מדיה. (ii) השתלת התימוס התרבותי לתוך הנמענים. בהליך זה, פיתחנו דרך פשוטה לספק את הרקמה הגדולה (E 29.8 בלוטת התימוס) לתוך קפסולה כליות עם סיכוי מופחת של פציעה בכליות. בעוד ממוקד על בלוטת התימוס בשלב מאוחר יותר, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם ישירות או עם שינויים עבור השתלת בלוטת התימוס בשלבים התפתחותיים שונים או רקמות בגודל דומה אחרים.

Protocol

הפרוטוקול המוצג דבק בהנחיות של ועדת האתיקה של אוניברסיטת ג'ינאן לגבי טיפול בבעלי חיים.

הערה: החומרים הנמצאים בשימוש מפורטים ברשימת החומרים.

1. בידוד של התימוס העובריים

1. לחיטוי כל כלי ניתוח לפני הניסוי, ולעקר את הספסל/המכסה עם 70% אתנול.
2. באמצעות פחמן דו חמצני, מורדם והמתת חסד העכבר הנשי ההרה (18.5 ימים פוסט ההזדווגות מוצלחת). ואז לנגב את אזור הבטן עם 70% אתנול.
   הערה: כאן הזדווג Insm1^+/lacz נקבות ו Insm1^+/lacz זכרים. הזרקה תוך-לפנטוברביטל בוצעו לפני בידוד של עוברים מהרחם ועריפת ראש בוצעו עבור כל עובר.
3. באמצעות מספריים, להפוך "V" בצורת לחתוך על הבטן החל שלפוחית השתן ופועל עד כל קרן של הרחם.
4. באמצעות המספריים, לחתוך את meסומי trium ואת צוואר הרחם/הנרתיק, ולאסוף את הרחם. הניחו את הרחם בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח באגירה קרה (PBS) על הקרח. לאחר מכן, חשפו את העוברים שנמצאים בתוך האדם העוטף, על ידי חיתוך קיר הרחם הקדמי מקרן רחם אחת לשנייה. תוך שימוש בפינצטה משובחת, קלף לאחור את הרקמות העטופים וחתך את חבל הטבור כדי לשחרר את העוברים. הניחו את כל העוברים בצלחת פטרי חדשה על הקרח עד לבידוד התימוס.
5. נגב עובר עם 70% אלכוהול ומניחים אותו בצלחת פטרי חדשה. משלב זה, ודא שנשמרים תנאים סטריליים.
6. על ידי חיתוך קרוב הלסת התחתונה עם מספריים, להסיר את ראשו של העובר ולנקז את הדם עם מגבת נייר. הבא, לתקן את העובר על אותה צלחת פטרי במצב פרקדן.
   הערה: אנחנו חותכים פיסת זנב של כל עובר עבור Insm1 ו לקטהקלדה.
7. באמצעות מספריים, חותכים את קיר החזה לרוחב אופקית לאורך החזית בדלת השחי, ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת כדי לפתוח את החזה. התימוס צריך עכשיו להיות גלוי כמו שתי אונות לבנות הממוקם מול קנה הנשימה ובצמוד ללב.
8. להניח מלקחיים מכופף עצה מאחורי התימוס ולאחר מכן למשוך את התימוס בעדינות. הקפידו לבדוק את שלמות התימוס כדי לאשר שהיא מכילה שתי אונות מתנוקת.
9. לשטוף את התימוס עם 1x PBS ולקצץ את רקמות החיבור ואת כלי הדם תחת stereomicroscope.

2. תרבות של התימוס העובריים המבודדת

1. הוסף 500 μL של התרבות בינונית (RPMI1640 + 15% סרום בפרה העובר (FBS) + 100 U/mL פניצילין ו 100 μg/mL סטרפטומיצין) לכל טוב של צלחת 24 הבאר. להעביר את הרתי נקי לתוך הבארות עם אחד בלוטת התימוס בכל. איור 1 מציג את התימוס המבודד במדיית התרבות.
2. לכל בלוטת התימוס מכיל גם להוסיף 2 '-deoxygranosine לריכוז הסופי של 1.25 מ"מ.
3. תרבות התימוס המבודד במשך שמונה ימים, מרעננת הן את מדיית התרבות והן את 2 '-deoxygranosine כל יומיים.

3. הקמת המרחב הsubcapsular בקפסולת הכליות

1. כדי להכין את המחט ואת צינור האינפוזיה חתוכים (איור 2), לחתוך את המחט וריד הקרקפת על החלק הצינור בזווית 45 מעלות באמצעות מספריים.
2. שוקלים את העכבר הערום ולאחר מכן מורדם אותו עם פנטוברביטל (1.5%) הזרקה (75 μg/g משקל הגוף).
3. כאשר לא לצבוט רפלקס לאחר הבוהן הוא נצפתה, למקם את העכבר על שולחן ההפעלה במיקום לרוחב ימין.
4. עם 0.5% povidone בספוגית יוד, לחטא את העור פעמיים באזור כירורגי מבפנים אל מחוץ לגוף.
5. באמצעות מספריים, לעשות חיתוך עור של 5 – 9 מ"מ במקביל לעמוד השדרה באזור הכליה השמאלי (בין הצלע האחרונה ואת הציצה כסל). הבא, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך הרקמה התת עורית ואת השריר לחשוף את הכליה.
6. עם חשיפת הכליה, השתמשו בזוג מלקחיים ביד אחת כדי להרים את השריר ואת רקמת השומן מקצה החתך בצד השדרה. עם זאת, לסחוט בעדינות את הכליה החוצה (לחילופין, את הכליה ניתן לסחוט החוצה באמצעות אצבעות של שתי ידיים).
7. כדי להבטיח כי קפסולה כליות לח במהלך הניתוח, להרטיב את פני השטח של הכליה עם תמיסת מלח (0.9% הנאל).
8. ליצור ניק בקפסולה כליה, ובעדינות לשרוט את קפסולת הכליה בצד ימין התחתון באמצעות קצה מחט הכין בשלב 3.1. הגודל של הניק צריך להיות 1/2 – 2/3 רוחב של הכליה; . אל תשרוט את הכליה
9. החלק את צינור האינפוזיה שהוכן בשלב 3.1 לתוך הניק על כמוסת הכליה. בעדינות הנתק את קפסולת הכליה עם הכליה לאורך הצד הארוך של הכליה עד שהגיע 3 – 4 מ"מ בתוך קפסולת הכליה. משוך לאחור את צינור העירוי; שטח subcapsular הכליה נוצר.

4. להשתלות התימוס מורטין העובריים

1. לשטוף את התימוס תרבותי בשלב 2.3 פעמיים בתמיסת מלח כדי לרוקן את התקשורת התרבותית.
2. חבר את צינור העירוי החתוך שהוכן בשלב 3.1 למזרק בממשק המחבר המזרק שלו. מעלים את התימוס המוכן. לתוך צינור האינפוזיה לאט
3. הכנס בעדינות את צינור העירוי החתוך לתוך כמוסת הכליות והגיע לעמוד העליון. להעביר את התימוס לתוך קפסולת הכליה; למשוך את הצינור לאט ובמקביל דוחף את הבוכנה של המזרק בעדינות.
4. באמצעות מנורת אלכוהול, מעט חום המחט הכין בשלב 3.1. לאחר להבטיח כי התימוס כולו נמצא בתוך החלל הsubcapsular, להשתמש במחט מחוממת לצרוב את הניק.
5. לאחר הצרוב, לשחזר את הכליה בחלל הבטן. . תפר את הצפק והשריר
6. שימוש שונה הופסק תפר אנכי המזרן, לסגור את חתך העור (לקשור לפחות שלושה קשרים ולחתוך כל חוט עודף).
7. , בשימוש בספוגית יוד. חטא את החתך כדי להקל על הכאב, הזרקה תת עורית של flunixin (2 μg/g של משקל הגוף) בוצעה במהלך הניתוח ולאחר מכן עבור 3 ימים לאחר הניתוח.
8. עד התאוששות מלאה מהרדמה, לשמור על העכבר חם תחת מנורת אינפרא אדום.
9. לשמור על התימוס בקפסולה הכליה של המטופל במשך 8 שבועות לפני שהוא מבתר את התימוס המושתלים וביצוע ניתוח פנוטימית כמתואר בעבר^5,8,9.

תוצאות

כאן אנו מראים את מבודד E 29.8 בלוטת התימוס המכיל שתי אונות מלאה (איור 1). בנוסף, אנו מראים את המחט וריד הקרקפת כי היה מעוגל לטופס שיקוע על צינור אינפוזיה (איור 2). הבא, אנחנו גם מראים דמות ייצוגית של המיקום של התימוס כי היה מושתלים קפסולת הכליה (איור 3A

Discussion

Subcapsular הכליות השתלת בלוטת התימוס העוברית היא שיטה חשובה ללמוד את התאים אפיתל הרתי בתפקוד ואת תהליך ההבשלה של תאים T ב vivo. למרות שיש מחקרים ניסיוניים מספר על תרבות הגוף מעובריים התימוס השתלת^6,7, הפרוטוקול שלנו מספק הליך חלופי פשוט על תרבות התימוס מורנין עובריי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use