Transplantation sous-capsulaire rénale du thym embryonnaire Murine traité à la déoxyguanosine de 2'-Deoxyguanosine chez les souris nues

Résumé

Nous fournissons une méthode simple et efficace pour transplanter 2'-deoxyguanosine traité E18.5 thymus dans la capsule rénale d'une souris nue. Cette méthode devrait aider dans l'étude de la fonction des cellules épithéliales thymiques et de la maturation des lymphocytes T.

Résumé

Le thymus est un organe immunitaire central important, qui joue un rôle essentiel dans le développement et la différenciation des lymphocytes T. La transplantation de Thymus est une méthode importante pour étudier la fonction épithéliale thymique et la maturation des lymphocytes T in vivo. Ici nous décraurons les méthodes expérimentales utilisées dans notre laboratoire pour transplanter 2'-deoxyguanosine (pour épuiser les lymphocytes du donneur) ont traité le thymume embryonnaire dans la capsule rénale d'une souris nue athymique. Cette méthode est à la fois simple et efficace et ne nécessite pas de compétences ou d'appareils spéciaux. Les résultats obtenus par cette méthode simple ont prouvé que le thymus transplanté peut effectivement soutenir la production de lymphocytes T du destinataire. En outre, plusieurs points clés en ce qui concerne le protocole seront encore élucidés.

Introduction

Le thymus est l'organe immunitaire central, dans les thymocytes subissent une sélection positive et négative, et deviennent des cellules T matures^1,2. Une sélection anormale positive ou négative entraîne une immunodéficience ou des pathologies auto-immunes respectivement^3,4. Par conséquent, la transplantation d'organe de thymus est une approche importante pour étudier le processus de sélection des lymphocytes T dans le thymus du donneur. Cette méthode est particulièrement cruciale lors de l'analyse de la fonction épithéliale thymique médiée par des mutations génétiques qui causent un phénotype mortel embryonnaire lorsqu'il est muté⁵.

Afin d'étudier la maturation des lymphocytes T d'un receveur dans le thymus transplanté, l'épuisement des lymphocytes du donneur dans le thymus est nécessaire. À cette fin, embryonnaire de 14, 15 ou 16 jours (E14, E15, E16) thymus est généralement sélectionné^6,7. Le thymus des stades plus mûrs peut également être épuisé avec succès des lymphocytes du donneur en traitant avec 2'-deoxyguanosine. Cependant, un protocole détaillé pour épuiser les lymphocytes et l'utilisationde la culture plus ancienne de thymus n'a pas été précédemment décrit 8,⁹. Tandis que les protocoles de transplantation ont été introduits par plusieurs études^10,11, d'autres modifications et améliorations de ces protocoles sont nécessaires.

Notre protocole est séparé en deux parties : (i) L'épuisement des lymphocytes T du stade de développement tardif E18.5 thymus par culture dans les médias contenant 2'-deoxyguanosine. (ii) Transplantation du thymus cultivé en receveurs. Dans cette procédure, nous avons développé un moyen simple de livrer le grand tissu (E18.5 thymus) dans la capsule rénale avec le risque réduit de dommages de rein. Tout en se concentrant sur le thymus stade ultérieur, notre protocole peut également être utilisé directement ou avec des modifications pour la transplantation de thymus à divers stades de développement ou d'autres tissus de taille similaire.

Protocole

Le protocole présenté respecte les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université Jinan concernant les soins aux animaux.

REMARQUE : Les matériaux utilisés sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.

1. Isolement du thymus embryonnaire

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l'expérience, et stériliser le banc / hotte avec 70% d'éthanol.
2. À l'aide de dioxyde de carbone, anesthésiez et euthanasiez la souris femelle enceinte (18,5 jours après l'accouplement réussi). Ensuite, essuyez la région abdominale avec 70% d'éthanol.
   REMARQUE : Ici, nous avons accouplé les femelles Insm1^et les mâles Insm1 et Les mâles^{de lacZ.}  L'injection intraplacental du pentobarbital a été exécutée avant que l'isolement des embryons de l'utérus et la décapitation aient été exécutés pour chaque embryon.
3. À l'aide de ciseaux, faire une coupe en forme de « V » sur l'abdomen à partir de la vessie et en cours d'exécution jusqu'à chaque corne de l'utérus.
4. À l'aide des ciseaux, couper le mesometrium et le col de l'utérus/vagina, et recueillir l'utérus. Placer l'utérus dans un plat Petri contenant de la saline à phosphate froid (PBS) sur la glace. Ensuite, exposez les embryons qui se trouvent dans la décidua enveloppée, en coupant la paroi utérine antérieure d'une corne utérine à l'autre. À l'aide d'une pince fine, peler les tissus de décidua enveloppés et couper le cordon ombilical pour libérer les embryons. Placer tous les embryons dans un nouveau plat Petri sur la glace jusqu'à l'isolement du thymus.
5. Essuyez un embryon avec 70% d'alcool et placez-le dans un nouveau plat Petri. À partir de cette étape, assurez-vous que les conditions stériles sont maintenues.
6. En coupant près de la mâchoire inférieure avec des ciseaux, retirer la tête de l'embryon et drainer le sang avec un essuie-tout. Ensuite, fixez l'embryon sur le même plat Petri en position de supine.
   REMARQUE : Nous coupons un morceau de la queue de chaque embryon pour le génotypage Insm1 et lacZ.
7. À l'aide de ciseaux, couper la paroi thoracique latérale horizontalement le long de l'avant axillaire, puis couper le diaphragme pour ouvrir la poitrine. Le thymus doit maintenant être visible sous forme de deux lobes blancs situés devant la trachée et adjacents au cœur.
8. Placer les forceps pliés derrière le thymus, puis retirer le thymus doucement. Assurez-vous de vérifier l'intégrité du thymus pour confirmer qu'il contient deux lobes joints.
9. Laver le thymus avec 1x PBS et couper les tissus conjonctifs et les vaisseaux sanguins sous un stéréomicroscope.

2. Culture du thymus embryonnaire isolé

1. Ajouter 500 l de milieu de culture (RPMI1640 - sérum bovin fœtal (FBS) à 150 U/mL de pénicilline et 100 og/mL de streptomycine) à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Transférer le thymi propre dans les puits avec un thymus par puits. La figure 1 montre le thymus isolé dans les médias culturels.
2. À chaque puits contenant du thymus, ajouter 2'-deoxygranosine à une concentration finale de 1,25 mM.
3. Culture du thymus isolé pendant huit jours, rafraîchissant à la fois les médias de culture et 2'-deoxygranosine tous les deux jours.

3. Établir l'espace sous-capsulaire dans la capsule rénale

1. Pour préparer l'aiguille et le tube d'infusion coupé (Figure 2), couper l'aiguille de veine du cuir chevelu sur la partie du tube à un angle de 45 degrés à l'aide de ciseaux.
2. Pesez la souris nue, puis anesthésiez-la avec un pentobarbital (1,5%) l'injection (75 g/g de poids corporel).
3. Lorsqu'aucun pincement d'orteil suivant réflexe n'est observé, placez la souris sur la table d'opération dans une position latérale droite.
4. Avec un écouvillon de 0,5% d'iode de povidone, désinfecter la peau deux fois dans la zone chirurgicale de l'intérieur à l'extérieur du corps.
5. À l'aide de ciseaux, faire une incision cutanée de 5 à 9 mm parallèlement à la colonne vertébrale dans la région rénale gauche (entre la dernière côte et la crête iliaque). Ensuite, ouvrez la cavité abdominale en coupant à travers le tissu et le muscle sous-cutanés et exposer le rein.
6. Avec le rein exposé, utilisez une paire de pinces dans une main pour soulever le muscle et les tissus adipeux du bord de l'incision côté de la colonne vertébrale. Avec l'autre main, presser doucement le rein (alternativement, le rein peut être pressé à l'aide des doigts des deux mains).
7. Pour s'assurer que la capsule rénale est humide pendant la chirurgie, mouiller la surface du rein avec salin (0,9% NaCl).
8. Créez une entaille dans la capsule rénale, et grattez doucement la capsule rénale sur le côté inférieur droit à l'aide de la pointe de l'aiguille préparée à l'étape 3.1. La taille de la pseudo doit être de 1/2/2/3 largeurs du rein; ne pas gratter sur le rein.
9. Faites glisser le tube d'infusion préparé à l'étape 3.1 dans le pseudo sur la capsule rénale. Dissocier doucement la capsule rénale avec le rein le long côté du rein jusqu'à ce qu'elle atteigne 3 à 4 mm à l'intérieur de la capsule rénale. Retirer le tube d'infusion; l'espace sous-capsulaire rénal est établi.

4. Transplanter le thymus murine embryonnaire

1. Laver le thymus cultivé à l'étape 2.3 deux fois en salin pour épuiser les médias de culture.
2. Connectez le tube d'infusion coupé préparé à l'étape 3.1 à une seringue à son interface de connexion de seringues. Aspirez lentement le thymus préparé dans le tube d'infusion.
3. Insérez délicatement le tube d'infusion coupé dans la capsule rénale et atteignez le pôle supérieur. Livrer le thymus dans la capsule rénale; rétracter le tube lentement tout en poussant doucement le piston de la seringue.
4. À l'aide d'une lampe à alcool, chauffer légèrement l'aiguille préparée à l'étape 3.1. Après s'être assuré que tout le thymus se trouve à l'intérieur de l'espace sous-capsulaire, utilisez l'aiguille chauffée pour cautériser la pseudo.
5. Après la cautérisation, restaurer le rein dans la cavité abdominale. Suturer le péritoine et le muscle.
6. À l'aide d'une suture verticale interrompue modifiée, fermez l'incision cutanée (attachez au moins trois noeuds et coupez tout fil excédentaire).
7. À l'aide d'un écouvillon d'iode de povidone, désinfecter l'incision. Pour soulager la douleur, l'injection sous-cutanée de flunixin (2 g/g de poids corporel) a été effectuée pendant la chirurgie, puis pendant 3 jours après la chirurgie.
8. Jusqu'à ce qu'il soit complètement remis de l'anesthésie, gardez la souris au chaud sous la lampe infrarouge.
9. Gardez le thymus dans la capsule rénale du receveur pendant 8 semaines avant de disséquer le thymus transplanté et de procéder à une analyse phénotypique comme décrit précédemment^5,8,9.

Résultats

Ici, nous montrons l'isolement E18.5 thymus contenant deux lobes complets (Figure 1). En outre, nous montrons l'aiguille de veine de cuir chevelu qui a été coupée pour former un bisau sur le tube d'infusion (figure 2). Ensuite, nous montrons également une image représentative de la position du thymus qui a été transplanté dans la capsule rénale (Figure 3A) et le thymus après 8 semaines de croissance chez les souris récept...

Discussion

La transplantation sous-capsulaire rénale du thymus embryonnaire est une méthode importante pour étudier la fonction des cellules épithéliales thymiques et le processus de maturation des lymphocytes T in vivo. Bien qu'il existe plusieurs études expérimentales sur la culture embryonnaire d'organe de thymus et la transplantation^6,7, notre protocole fournit une procédure alternative simple sur la culture embryonnaire de thymus murine et sous-capsulaire réna...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use