2'-脱氧核苷在裸体小鼠中治疗鼠胚胎胸腺的肾下囊移植

摘要

我们提供一种简单而有效的方法,将治疗E18.5胸腺素的2'脱氧腺苷移植到裸鼠的肾胶囊中。该方法应辅助研究胸腺上皮细胞功能和T细胞成熟。

摘要

胸腺是重要的中央免疫器官,在T细胞的发育和分化中起着至关重要的作用。胸腺移植是研究胸腺上皮细胞功能和T细胞在体内成熟的重要方法。在这里,我们将描述在我们的实验室中使用的实验方法,将2'-脱氧腺苷(以耗尽供体的淋巴细胞)治疗胚胎胸腺移植到贫血裸鼠的肾脏胶囊中。此方法既简单又高效,不需要特殊技能或设备。通过这一简单方法获得的结果表明,移植胸腺能有效支持受体的T细胞生产。此外,还将进一步阐明与议定书有关的若干要点。

引言

胸腺是中央免疫器官,胸腺胸腺细胞内经过正阴性选择,成为成熟的T细胞1,2。异常阳性或阴性选择分别导致免疫缺陷或自身免疫性疾病3,4。因此,胸腺器官移植是研究供体胸腺中T细胞选择过程的重要途径。这种方法在分析由基因突变介导的胸腺上皮功能时尤为重要,基因突变在^突变5时引起胚胎致命表型。

为了研究受体的T细胞在移植胸腺中的成熟,有必要消耗胸腺内的供体淋巴细胞。为此,胚胎14天、15天或16天(E14,E15,E16)胸腺通常选择6,7。从更成熟的阶段胸腺也可以成功地耗尽捐赠者的淋巴细胞,通过治疗2'-脱氧腺苷。然而,关于消耗淋巴细胞和使用较老胸腺培养的详细方案之前没有描述8,9。虽然移植协议已被几个研究10,11引入,但进一步修改和改进这些协议是必要的。

我们的协议分为两部分:(i) 在含有2'脱氧腺苷的培养物中,通过培养物从晚期E18.5胸腺中消耗T淋巴细胞。(二) 将培养的胸腺移植到接受者体内。在此过程中,我们开发了一种简单的方法,将大组织(E18.5胸腺)输送到肾胶囊中,降低了肾损伤的几率。在关注后期胸腺的同时,我们的方案也可以直接用于或修改胸腺移植,用于不同发育阶段或其他类似大小的组织。

研究方案

所提出的方案符合暨南大学伦理委员会关于动物护理的指导方针。

注:所用材料列在"材料表"中。

1.胚胎胸腺的分离

1. 在实验前对所有手术器械进行高压灭菌,用70%乙醇对工作台/机进行灭菌。
2. 使用二氧化碳,麻醉和安乐死怀孕的雌性小鼠(成功交配后18.5天)。然后用70%乙醇擦拭腹部区域。
   注: 在这里,我们交配Insm1^+/lacZ女性和Insm1^+/lacZ男性。在从子宫分离胚胎之前,对五巴比妥进行内胎内注射,并为每个胚胎进行斩首。
3. 使用剪刀,从膀胱开始,在腹部做一个"V"形的切口,一直运行到子宫的每个角。
4. 使用剪刀,切割中庭和子宫颈/阴道,并收集子宫。将子宫放入含有冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)的培养皿中。接下来,通过将前子宫壁从一个子宫角切割到另一个子宫角,露出包裹中的胚胎。使用细钳子,剥去包裹的二叶精组织,并切断脐带以释放胚胎。将所有胚胎放在新的培养皿中,直到胸腺分离。
5. 用70%的酒精擦拭胚胎,并将其放入新的培养皿中。从此步骤开始,确保保持无菌条件。
6. 用剪刀剪下颚,取出胚胎的头部,用纸巾排血。接下来,将胚胎固定在同一个培养皿上。
   注:我们为Insm1和lacZ基因分型切出每个胚胎的尾部。
7. 使用剪刀,沿轴线水平切割侧胸壁,然后切开隔膜以打开胸部。胸腺现在应该是两个白色的叶位于气管前面,毗邻心脏。
8. 将弯曲的尖钳放在胸腺后面,然后轻轻拉出胸腺。请务必检查胸腺的完整性,以确认它包含两个关节叶。
9. 用1x PBS清洗胸腺,并在立体显微镜下修剪结缔组织和血管。

2. 分离胚胎胸腺的培养

1. 在24孔板的每口孔中加入500μL培养基(RPMI1640 + 15%胎儿牛血清(FBS)=100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。将干净的胸腺米转移到井中,每口井有一个胸腺。图 1显示了培养基中分离的胸腺。
2. 在每个胸腺中含有的井中,将2'-脱氧糖苷添加到1.25 mM的最终浓度中。
3. 将孤立的胸腺培养8天,每两天刷新一次培养基质和2'脱氧核糖核糖核病。

3. 在肾胶囊中建立下帽空间

1. 要准备针头和夹紧的输液管(图2),请用剪刀以45°角切割管部分上的头皮静脉针。
2. 称量裸鼠,然后用五巴比妥麻醉它(1.5%)注射(75微克/克体重)。
3. 当未观察到脚趾捏合后有反射时,将鼠标放在操作台上的右侧位置。
4. 用0.5%的波维酮碘拭子,在手术区从身体内到外侧对皮肤进行两次消毒。
5. 使用剪刀,使一个5-9毫米的皮肤切口平行于脊柱在左肾区域(在最后一根肋骨和iliac峰之间)。接下来,通过切开皮下组织和肌肉打开腹腔,并暴露肾脏。
6. 肾脏暴露后,一手使用一对钳子将肌肉和脂肪组织从脊柱侧切口边缘提起。用另一只手,轻轻地挤压肾脏(或者,肾脏可以用双手的手指挤出)。
7. 为确保肾胶囊在手术过程中潮湿,用盐水(0.9%NaCl)润湿肾脏表面。
8. 在肾胶囊中创建一个刻痕,并使用步骤 3.1 中准备的针头轻轻划伤右下角的肾胶囊。刻痕的大小应为肾脏的1⁄2⁄2/3宽度;不要划伤肾脏。
9. 将步骤 3.1 中准备的输液管滑入肾胶囊上的缺口中。沿着肾脏的长侧轻轻分离肾胶囊,直到在肾胶囊内达到3⁄4mm。拉回输液管;建立肾下囊空间。

4. 移植胚胎鼠胸腺

1. 洗涤在步骤 2.3 中两次培养的胸腺,以耗尽培养基。
2. 将步骤 3.1 中准备的夹击输液管连接到注射器连接接口处的注射器。将准备好的胸腺缓慢吸入输液管。
3. 轻轻地将夹紧的输液管插入肾胶囊,并到达上部杆。将胸腺送入肾胶囊;缓慢收回管,同时轻轻推动注射器的柱塞。
4. 使用酒精灯,稍微加热步骤 3.1 中准备的针头。在确保整个胸腺位于下盖空间内后,使用加热针烧结刻痕。
5. 烧灼后,恢复腹腔的肾脏。缝合围肠和肌肉。
6. 使用经过修改的中断式床垫缝合线,关闭皮肤切口(至少系三节,并切掉任何多余的线)。
7. 使用波维酮碘拭子,消毒切口。为了减轻疼痛,在手术过程中进行皮下注射氟辛(2微克/克体重),然后在手术后3天进行。
8. 直到完全从麻醉中恢复过来,在红外灯下保持小鼠温暖。
9. 在解剖移植的胸腺和进行前文型分析之前,将胸腺留在受体的肾胶囊中8周,并进行前所述5、8、9的体称性分析。

结果

这里我们展示的分离的E18.5胸腺包含两个完整的叶 (图1)。此外,我们显示头皮静脉针被剪切,形成输液管的斜面 (图 2)。接下来,我们还展示了在受体小鼠生长8周后移植在肾胶囊(图3A)和胸腺中所状的胸腺位置的代表性图像(图3B)。为了确定T细胞是否在移植胸腺的裸小鼠中产生,在移植的胸腺和外周血液中,我们使?...

讨论

胚胎胸腺肾下囊移植是研究胸腺上皮细胞功能和T细胞在体内成熟过程的重要方法。虽然对胚胎胸腺器官培养和移植有若干实验性研究6,7,我们的方案提供了一个简单的替代程序,对小鼠胚胎胸腺培养和肾下囊移植较老的胸腺组织。

我们的协议通过合并几个不同的修改6,7,10,11来改进以前的协议。 ^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use