Transplantação subcapsular renal do Thymus Embryonic murine 2 '-Deoxyguanosine-Tratado em ratos nus

Resumo

Nós fornecemos um método simples e eficiente para transplantar 2 '-deoxyguanosine tratou e 18.5 timo na cápsula renal de um rato nu. Este método deve auxiliar no estudo da função de células epiteliais tímicas e da maturação das células T.

Resumo

O timo é um importante órgão imunológico central, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento e diferenciação de células T. O transplante de timo é um método importante para investigar a função da célula epitelial tímica e a maturação das células T in vivo. Aqui nós descreveremos os métodos experimentais usados dentro de nosso laboratório para transplantar 2 '-deoxyguanosine (para esgotar os linfócitos do doador) timo embrionário tratado na cápsula renal de um rato nu camundongos. Este método é simples e eficiente e não requer habilidades especiais ou dispositivos. Os resultados obtidos através deste método simples mostraram que o Timo transplantado pode eficazmente suportar a produção das pilhas de T do receptor. Adicionalmente, vários pontos-chave no que diz respeito ao protocolo serão ainda mais elucidados.

Introdução

O timo é o órgão imunológico central, dentro dos timócitos Timo passam por seleção positiva e negativa, e tornam-se células T maduras^1,2. A seleção anormal positiva ou negativa resulta em imunodeficiência ou patologias auto-imunes^,respectivamente^3,4. Conseqüentemente, a transplantação do órgão do timo é uma aproximação importante para estudar o processo da seleção das pilhas de T no timo do doador. Este método é particular crucial ao analisar a função epithelial Thymic negociada por mutações genéticas que causam o phenotype letal embrionário quando mutado⁵.

A fim estudar a maturação de pilhas de T de um receptor no timo transplantado, a prostração de linfócitos do doador dentro do timo é necessária. Para este fim, o Timo embrionário de 14, 15 ou 16 dias (E14, E15, E16) é usualmente selecionado^6,7. Thymus de estágios mais maduros pode igualmente com sucesso ser esgotado dos linfócitos do doador tratando com 2 '-deoxyguanosine. Entretanto, um protocolo detalhado para esgotando linfócitos e o uso da cultura mais velha do Timo não tem sido descrito previamente^8,9. Embora os protocolos de transplante tenham sido introduzidos por vários estudos^10,11, é necessária uma maior modificação e melhoria desses protocolos.

Nosso protocolo é separado em duas partes: (i) depleção de linfócitos T do estágio de desenvolvimento tardio e 18,5 Timo pela cultura em 2 '-deoxyguanosine-contendo meios. (II) transplante do Timo cultivado em receptores. Neste procedimento, nós desenvolvemos uma maneira simples de entregar o grande tecido (E 18.5 Thymus) na cápsula renal com possibilidade reduzida de ferimento de rim. Ao centrar-se no timo mais atrasado da fase, nosso protocolo pode igualmente ser usado diretamente ou com as modificações para a transplantação do timo em vários estágios desenvolventes ou em outros tecidos feitos medida similares.

Protocolo

O protocolo apresentado adere às diretrizes do Comitê de ética da Universidade de Jinan em relação aos cuidados com os animais.

Nota: os materiais utilizados estão listados na tabela de materiais.

1. isolação do Timo embrionário

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do experimento, e esterilizar o banco/capuz com 70% etanol.
2. Usando o dióxido de carbono, anestesiar e eutanizar o rato fêmea grávido (18,5 dias de acoplamento bem sucedido do borne). Em seguida, limpe a região abdominal com 70% de etanol.
   Nota: aqui nós acasalamos Insm1^+/lacZ fêmeas e Insm1^+/lacZ machos. A injeção intraplacental do pentobarbital foi executada antes que o isolamento dos embriões do útero e a decapitação fossem executados para cada embrião.
3. Usando tesouras, faça um corte em forma de "V" no abdômen a partir da bexiga e correndo até cada chifre do útero.
4. Usando a tesoura, corte o mesométrio e colo/vagina, e recolher o útero. Coloque o útero em uma placa de Petri contendo soro de fosfato frio-tamponado (PBS) no gelo. Em seguida, expor os embriões que estão na decidua envelopada, cortando a parede uterina anterior de um chifre uterino para o outro. Usando tweezers finos, descasque para trás os tecidos envelopadas do decídua e corte o cabo de cordão umbilical para liberar os embriões. Coloque todos os embriões em um novo prato de Petri no gelo até o isolamento do timo.
5. Limpe um embrião com 70% de álcool e coloque-o em um novo prato de Petri. Desta etapa sobre, assegure-se de que as circunstâncias estéreis sejam mantidas.
6. Cortando perto da mandíbula inferior com uma tesoura, retire a cabeça do embrião e escorra o sangue com uma toalha de papel. Em seguida, fixar o embrião no mesmo prato de Petri em posição supina.
   Nota: nós cortamos um pedaço da cauda de cada embrião para Insm1 e lacZ Genotyping.
7. Usando tesouras, corte a parede torácica lateral horizontalmente ao longo da frente axilar e, em seguida, corte o diafragma para abrir o tórax. O Timo deve agora ser visível como dois lóbulos brancos localizados na frente da traquéia e adjacente ao coração.
8. Coloque fórceps de ponta dobrada atrás do Timo e, em seguida, retire o Timo suavemente. Certifique-se de verificar a integridade do timo para confirmar que ele contém dois lóbulos articulados.
9. Lave o Timo com 1X PBS e aparar os tecidos conjuntivos e vasos sanguíneos um estereomicroscópio.

2. cultura do Timo embrionário isolado

1. Adicionar 500 μL de meio de cultura (RPMI1640 + 15% de soro bovino fetal (FBS) + 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a cada poço de uma placa de 24 poços. Transfira o thymi limpo nos poços com um timo por bem. A Figura 1 exibe o Timo isolado em meios de cultura.
2. Para cada Thymus-contendo bem adicionar 2 '-deoxygranosine a uma concentração final de 1,25 mM.
3. Cultura o Timo isolado por oito dias, refrescando ambos os meios de cultura e 2 '-deoxygranosine cada dois dias.

3. estabeleça o espaço subcapsular na cápsula renal

1. Para preparar a agulha e o tubo de infusão cortada (Figura 2), corte a agulha da veia do couro cabeludo na parte do tubo em um ângulo de 45 ° usando uma tesoura.
2. Pesar o rato nu e, em seguida, anestesiá-lo com um pentobarbital (1,5%) injetável (75 μg/g de peso corporal).
3. Quando não for observado nenhum reflexo após a pinça do dedo do pé, coloque o mouse sobre a mesa de operação em uma posição lateral direita.
4. Com um cotonete do iodo do povidona de 0,5%, desinfete a pele duas vezes na área cirúrgica do interior à parte externa do corpo.
5. Usando a tesoura, faça uma incisão da pele de 5 – 9 milímetros paralela à espinha na área renal esquerda (entre a última costela e a crista ilíaca). Em seguida, abra a cavidade abdominal cortando através do tecido e do músculo subcutaneous e exponha o rim.
6. Com o rim exposto, use um par de pinças em uma mão para levantar o músculo e tecido adiposo fora da borda da incisão do lado da espinha. Com a outra mão, aperte suavemente o rim para fora (Alternativamente, o rim pode ser espremido usando os dedos de ambas as mãos).
7. Para garantir que a cápsula renal é úmida durante a cirurgia, molhe a superfície do rim com soro fisiológico (0,9% NaCl).
8. Crie um entalhe na cápsula do rim, e risque delicadamente a cápsula renal no lado direito mais baixo usando a ponta da agulha preparada na etapa 3,1. O tamanho do entalhe deve ser 1/2 – 2/3 larguras do rim; não arranhar no rim.
9. Deslize o tubo de perfusão preparado no passo 3,1 para o entalhe na cápsula renal. Dissociar suavemente a cápsula renal com o rim ao longo do lado longo do rim até atingir 3 – 4mm dentro da cápsula renal. Desenhe de volta o tubo de infusão; o espaço subcapsular do rim é estabelecido.

4. transplante do Timo murino embrionário

1. Lave o Timo cultivado na etapa 2,3 duas vezes em soro fisiológico para esgotar os meios de cultura.
2. Conecte o tubo de infusão cortado preparado na etapa 3,1 a uma seringa em sua interface de conexão da seringa. Aspirar o Timo preparado para o tubo de infusão lentamente.
3. Introduza suavemente o tubo de perfusão cortado na cápsula renal e chegue ao pólo superior. Entregar o timo na cápsula renal; Retraia o tubo lentamente ao simultaneamente empurrar o êmbolo da seringa suavemente.
4. Usando uma lâmpada de álcool, aqueça levemente a agulha preparada na etapa 3,1. Depois de garantir que todo o Timo está dentro do espaço subcapsular, use a agulha aquecida para cauterizar o Nick.
5. Após a cauterização, restaure o rim na cavidade abdominal. Sutura do peritônio e músculo.
6. Usando uma sutura de colchão vertical interrompida modificada, feche a incisão da pele (amarre pelo menos três nós e corte afastado toda a linha adicional).
7. Usando um cotonete do iodo do povidona, desinfete a incisão. Para aliviar a dor, a injeção subcutaneous do flunixin meglumine (2 μg/g do peso corporal) foi executada durante a cirurgia e então por 3 dias após a cirurgia.
8. Até que completamente recuperado da anestesia, mantenha o rato morno a lâmpada infravermelha.
9. Mantenha o timo na cápsula renal do receptor por 8 semanas antes de dissecação do Timo transplantado e realizando análise fenotípica como descrito anteriormente^5,8,9.

Resultados

Aqui nós mostramos o e 18.5 Timo isolado que contem dois lóbulos completos (Figura 1). Além disso, mostramos a agulha da veia do couro cabeludo que foi cortada para formar um chanfro no tubo de infusão (Figura 2). Em seguida, também mostramos uma imagem representativa da posição do Timo que foi transplantado na cápsula renal (Figura 3a) e o Timo após 8 semanas de crescimento dentro dos camundongos receptores (

Discussão

A transplantação subcapsular renal do Timo embrionário é um método importante para estudar a função epithelial Thymic das pilhas e o processo da maturação das pilhas de T in vivo. Embora existam vários estudos experimentais sobre cultura e transplante de órgãos do Timo embrionário^6,7, nosso protocolo fornece um procedimento alternativo simples na cultura do Timo embrionário murino e subcapsular renal transplantação para o tecido mais velho do timo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use