Çıplak farelerde 2 '-Deoxyguanosine tedavi Murine embriyonik Thymus renal subkapsüler nakli

Özet

Biz transplantasyon için basit ve verimli bir yöntem sağlamak 2 '-deoxyguanosine bir çıplak fare renal kapsül içine e 18.5 timus tedavi. Bu yöntem, hem timik epitelyal hücreler fonksiyon ve T hücrelerinin olgunlaşma çalışmada Yardımcısı olmalıdır.

Özet

Timus, T hücrelerinin gelişiminde ve farklılaşması konusunda önemli bir rol oynayan büyük bir merkezi bağışıklık organıdır. Thymus transplantasyonu tymik epitelyal hücre fonksiyonunu ve T hücrelerinin olgunlaşma in vivo araştırılması için önemli bir yöntemdir. Burada laboratuvarımızda 2 '-deoksinozin (donör lenfositleri tüketmek için) nakli için kullanılan deneysel yöntemleri açıklayacağız bir korele çıplak fare renal kapsül içine embriyonik timus tedavi. Bu yöntem hem basit hem de etkilidir ve özel beceriler veya aygıtlar gerektirmez. Bu basit yöntem ile elde edilen sonuçlar, nakledilen timus 'un alıcının T hücrelerinin üretimini etkili bir şekilde destekleyebilildiğini göstermiştir. Ayrıca, protokole ilişkin birkaç önemli nokta daha da uzatın.

Giriş

Timus merkezi bağışıklık organı, timus timositleri içinde pozitif ve negatif seçim geçmesi, ve olgun T hücreleri olmak^1,2. Anormal pozitif veya negatif seçim sonucu immünyetmezlik veya otoimmün patolojiler sırasıyla^3,4. Bu nedenle, timus organ nakli, bağışçının timus 'ta T hücrelerinin seçimi sürecini incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Bu yöntem özellikle mutasyona uğramış embriyonik ölümcül fenotip neden gen mutasyonlar tarafından aracılı thymik epitelyal fonksiyon analiz ederken önemlidir⁵.

Nakledilen timus bir alıcının T hücrelerinin olgunlaşma incelemek için, timus içinde donör lenfositlerin tükenmesi gereklidir. Bu amaçla, embryonik 14-, 15-veya 16-gün (E14, E15, E16) timus genellikle^6,7seçilir. Daha olgun aşamalardan Thymus, 2 '-deoksiguanozin ile tedavi ederek donör lenfositlerinin de başarıyla tükenebilir. Ancak, lenfositlerin tüketen ve eski timus kültürünün kullanımı için ayrıntılı bir protokol daha önce^8,9tarif edilmedi. Transplantasyon protokolleri birkaç çalışmada^10,11, daha fazla değişiklik ve bu protokollerin iyileştirilmesi ile tanıtıldı iken gereklidir.

Protokolümüz iki bölüme ayrılır: (ı) geç gelişimsel aşama e 18.5 timus 'tan T lenfositlerinin 2 '-deoxyguanosine içeren medyada kültür tarafından tükenmesi. (ii) kültürlü timus 'un alıcılara nakli. Bu yordamda, renal kapsülün içine büyük doku (E 18.5 Thymus) teslim etmek için basit bir yol geliştirdik, böbrek yaralanması olasılığı azalır. Daha sonra aşama timus üzerinde odaklanırken, protokollerimiz de doğrudan veya çeşitli gelişimsel aşamalarında veya diğer benzer boyutlarda dokularda timus transplantasyonu için değişiklikler ile kullanılabilir.

Protokol

Sunulan protokol, Jinan Üniversitesi 'nin hayvan bakımıyla ilgili etik komitesinin yönergelerine bağlıdır.

Not: kullanılan malzemeler malzeme tablosunda listelenir.

1. embriyonik timus izolasyonu

1. Deney öncesi tüm cerrahi aletler otoklav ve 70% etanol ile Bench/Hood sterilize.
2. Karbondioksit kullanarak, anestezi ve hamile kadın fare ötenize (18,5 gün başarılı çiftleşme sonrası). Ardından karın bölgesini% 70 etanol ile silin.
   Not: burada Insm1^+/lacz kadın ve Insm1^+/lacz erkeklerde montaj ilişkili. Her embriyo için embriyonun uterusun izolasyonunda intraplacental enjeksiyonu yapıldı ve deapitasyon uygulandı.
3. Makası kullanarak, karnında mesane başlayan ve rahim her boynuz kadar çalışan bir "V" şeklinde kesilmiş olun.
4. Makas kullanarak, mesometrium ve serviks/vajina kesmek ve rahim toplamak. Buzun üzerinde soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) içeren bir petri tabak rahim yerleştirin. Sonra, bir uterus boynuz diğerine anterior uterus duvarı keserek, zarflı decidua olan embriyolar açığa. İnce Cımbız kullanarak, zarflı decidua dokularına geri soyma ve embriyoları serbest bırakmak için göbek kordonu kesti. Tüm embriyoları, Thymus izolasyonuna kadar buzda yeni bir petri tabağı içine yerleştirin.
5. % 70 alkol ile bir embriyo silin ve yeni bir petri çanak yerleştirin. Bu adımda, steril koşulların korunduğundan emin olun.
6. Makas ile alt çene yakın kesme, embriyonun kafasını çıkarın ve bir kağıt havlu ile kan drenaj. Sonra, aynı Petri tabağı üzerinde embriyo düzeltmek pozisyon.
   Not: Biz Insm1 ve lacz genotyping için her embriyo kuyruğu bir parça kesti.
7. Makas kullanarak, yan göğüs duvarı aksiller ön boyunca yatay olarak kesti ve sonra göğsü açmak için diyafram kesti. Timus şimdi trakea ve kalp bitişik önünde bulunan iki beyaz lob olarak görünür olmalıdır.
8. Timus arkasında bükülmüş uçlu forseps yerleştirin ve sonra yavaşça timus çekin. İki eklem lob içerdiğini onaylamak için timus bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun.
9. 1 PBS ile timus yıkayın ve bir stereomicroscope altında bağ dokularını ve kan damarlarını kırpın.

2. izole embriyonik timus kültürü

1. 500 μL kültür orta (RPMI1640 + 15% fetal sığır serumu (FBS) + 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) her bir 24-kuyu plakasının her bir kuyu ekleyin. İyi başına bir timus ile kuyuların içine temiz thymi aktarın. Şekil 1 , kültür medyasında yalıtılmış timus görüntüler.
2. Her Thymus-iyi içeren için 2 '-deoxygranosine son konsantrasyon 1,25 mM ekleyin.
3. Her iki günde bir kültür medyasını ve 2 '-deokgranosinin yenileniyor, sekiz gün boyunca izole timus kültürü.

3. böbrek kapsülünde subkapsülü alanı kurmak

1. İğne ve kırpılmış infüzyon tüpü hazırlamak için (Şekil 2), makas kullanarak 45 ° açı tüp kısmında kafa derisi ven iğne kes.
2. Çıplak fare tartmak ve sonra bir pentobarbital ile anestezize (1,5%) Enjeksiyon (75 μg/g vücut ağırlığı).
3. Parmak tutam takipte hiçbir refleks görülmez, fareyi çalışma masasına sağ lateral pozisyonda yerleştirin.
4. Bir 0,5% Povidon İyot Swab ile, cerrahi alanda vücudun dış iç iki kez cilt dezenfekte.
5. Makas kullanarak, sol böbrek alanında (son kaburga ve iliak arması arasında) omurga paralel bir 5 – 9 mm Cilt kesi olun. Sonra, subkutan doku ve kas yoluyla kesme ve böbrek maruz karın boşluğu açın.
6. Böbrek maruz, bir yandan bir çift cımbız kullanın kas ve omurga tarafı kesi kenarı kapalı yağ dokusu kaldırmak için. Öte yandan, yavaşça böbrek dışarı sıkmak (alternatif olarak, böbrek her iki elin parmaklarını kullanarak sıkılabilir).
7. Böbrek kapsülünün cerrahi sırasında nemli olduğundan emin olmak için böbreğin yüzeyini tuzlu (0,9% NaCl) ile ıslatın.
8. Böbrek kapsülü bir Nick oluşturun ve hafifçe adım 3,1 hazırlanan iğne ucu kullanarak sağ alt tarafında böbrek kapsülü çizilmeye. Nick büyüklüğü 1/2 – 2/3 böbrek genişlikleri olmalıdır; böbrek üzerinde çizik yok.
9. Böbrek kapsülü Nick içine adım 3,1 hazırlanmış infüzyon tüpü kaydırın. Böbreğin uzun tarafında böbrek kapsülü içinde 3 – 4mm 'ye ulaşıncaya kadar böbrek kapsülünü yavaşça DISSOCIATE edilir. İnfüzyon tüpü geri çizin; böbrek subkapsüler alanı kurulmuştur.

4. embriyonik murine timus nakli

1. Kültür medyasını tüketmek iki kez% 2,3 yılında kültürlü timus bitki yıkayın.
2. 3,1 adımda hazırlanan kırpılmış infüzyon tüpünü, şırınga bağlayan arayüzünde bir şırıngaya bağlayın. Hazırlanmış timus 'un infüzyon tüpünü yavaşça aspirate.
3. Yavaşça böbrek kapsülü içine kırpılmış infüzyon tüp yerleştirin ve üstün kutup ulaşmak. Timus böbrek kapsülü içine teslim; aynı anda hafifçe şırınga pistonu itmek sırasında yavaşça tüp geri çekin.
4. Bir alkol lambası kullanarak, adım 3,1 hazırlanmış iğne biraz ısı. Tüm timus subkapsüler alanı içinde olduğundan emin olduktan sonra, Nick dağlamak için ısıtmalı iğne kullanın.
5. Cauterization sonra, abdominal boşlukta böbrek geri. Periton ve kas sütür.
6. Modifiye kesilmiş dikey yatak sütür kullanarak, cilt kesi kapatın (en az üç knot kravat ve herhangi bir aşırı iplik kesti).
7. Bir Povidon İyot çubuğu kullanarak, kesi dezenfekte. Ağrıyı hafifletmek için, cerrahi sırasında ve sonra ameliyattan 3 gün sonra fluniksin (2 μg/g vücut ağırlığı) Subkutan Enjeksiyon yapıldı.
8. Tamamen anestezi kurtarılana kadar, kızılötesi lamba altında fare sıcak tutun.
9. Daha önce^5,8,9açıklandığı gibi nakledilen timus diseksiyon ve fenotipik Analizi yürüten önce 8 hafta boyunca alıcının böbrek kapsülünde timus tutun.

Sonuçlar

Burada iki tam lob (Şekil 1) içeren izole e 18.5 timus gösterir. Ayrıca, biz infüzyon tüpü üzerinde bir eğim oluşturmak için kırpılmış olan kafa derisi ven iğne göstermek (Şekil 2). Sonra, aynı zamanda böbrek Kapsülü (Şekil 3A) ve timus (şekil3B) alıcı fareler içinde büyüme 8 hafta sonra nakledilen timus konumunun temsili bir görüntü göstermektedir. T hücrelerinin bir t...

Tartışmalar

Embriyonik timus renal subkapsüler transplantasyonu, thymik epitelyal hücrelerin fonksiyonunun ve T hücrelerinin olgunlaşma sürecinin içinde vivo olarak incelenmesi için önemli bir yöntemdir. Embriyonik timus organ kültürü ve transplantasyon^6,7üzerinde çeşitli deneysel çalışmalar olmasına rağmen, protokolümüz, murin embriyonik timus kültürü ve renal subkapsüler üzerinde basit bir alternatif prosedür sağlar. Eski timus dokusu için tra...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use