ヌードマウスにおける2'-デオキシグアノシン処理マウス胚性胸腺の腎サブカプセル移植

要約

我々は、ヌードマウスの腎カプセルに2'-デオキシグアノシン処理E18.5胸腺を移植するための簡単かつ効率的な方法を提供する。この方法は、甲状腺上皮細胞機能とT細胞の成熟の両方の研究に付加されるべきである。

要約

胸腺は重要な中央免疫器官であり、T細胞の発達と分化に不可欠な役割を果たしている。胸腺移植は、生体内の甲状腺細胞機能およびT細胞の成熟を調るための重要な方法である。ここでは、2'デオキシグアノシン(ドナーのリンパ球を枯渇させる)をアチミックヌードマウスの腎カプセルに移植するために当研究室で使用される実験方法について説明します。この方法は、シンプルかつ効率的であり、特別なスキルやデバイスを必要としません。この簡易方法を用いられた結果は、移植された胸腺がレシピエントのT細胞産生を効果的にサポートできることを示した。さらに、プロトコルに関するいくつかの重要なポイントがさらに解明されます。

概要

胸腺は中央免疫器官であり、胸腺胸腺細胞内では陽性および陰性の選択を受け、成熟したT細胞1、2になる。異常な陽性または陰性の選択は、それぞれ3、4の免疫不全または自己免疫病理をもたらす。したがって、胸腺臓器移植は、ドナーの胸腺におけるT細胞選択の過程を研究するための重要なアプローチである。この方法は、変異時に胚致死表現型を引き起こす遺伝子変異によって媒介される胸腺上皮機能を分析する場合に特に重要^である5.

移植された胸腺におけるレシピエントのT細胞の成熟を研究するためには、胸腺内のドナーリンパ球の枯渇が必要である。この目的のために、胚14-、15-または16日(E14、E15、E16)胸腺は、通常6、7を選択^される。より成熟した段階からの胸腺はまた、2'-デオキシグアノシンで治療することによってドナーのリンパ球を正常に枯渇させることができる。しかし、リンパ球を枯渇させ、古い胸腺培養の使用のための詳細なプロトコルは、以前に記載されていない8,9.移植プロトコルは、いくつかの研究10、11によって導入されているが、これらのプロトコルのさらなる改変および改善が必要である。

我々のプロトコルは2つの部分に分かれています:(i)2'-デオキシグアノシン含有培地における培養による後期発達段階E18.5胸腺からのTリンパ球の枯渇。(ii) 培養胸腺をレシピエントに移植する。この手順では、腎臓損傷の可能性を減らした腎カプセルに大きな組織(E18.5胸腺)を届ける簡単な方法を開発しました。後の段階の胸腺に焦点を当てながら、私たちのプロトコルはまた、様々な発達段階または他の同様のサイズの組織で胸腺の移植のための変更で直接または使用することができます。

プロトコル

提示されたプロトコルは、動物のケアに関する済南大学の倫理委員会のガイドラインに準拠しています.

注:使用する材料は、材料の表に記載されています。

1.胚性胸腺の分離

1. 実験の前にすべての外科器具をオートクレーブし、70%のエタノールでベンチ/フードを殺菌する。
2. 二酸化炭素を使用して、妊娠中の雌マウスを麻酔し、安楽死させる(18.5日後に交配に成功した)。その後、70%のエタノールで腹部領域を拭きます。
   注:ここでは、Insm1^+/lacZメスとInsm1^+/lacZオスを合致しました。ペントバルビタールの内皮注射は、子宮からの胚の単離および各胚に対して切断が行われる前に行った。
3. はさみを使って、膀胱から始まり、子宮の各角まで走る腹部に「V」の形のカットを行います。
4. はさみを使って、体膜と子宮頸部/膣を切り、子宮を採取する。冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を含むペトリ皿に子宮を氷の上に置きます。次に、封入された決定器内にある胚を、一方の子宮角からもう一方の子宮角に切り取ることによって露出する。細かいピンセットを使用して、封筒に入れたデシドア組織を剥がし、臍帯を切って胚を放出する。胸腺の分離まで氷の上に新しいペトリ皿にすべての胚を置きます。
5. 70%のアルコールで胚を拭き、新しいペトリ皿に入れます。この手順から、滅菌条件が維持されていることを確認します。
6. はさみで下顎を切り取り、胚の頭部を取り除き、ペーパータオルで血液を排出します。次に、同じペトリ皿に胚を上の位置に固定します。
   注:Insm1とlacZジェノタイピングのために各胚の尾部を切り取りました。
7. はさみを使って、軸前に沿って横胸壁を水平に切り、横隔膜を切って胸を開きます。胸腺は気管の前にあり、心臓に隣接する2つの白い葉として見えるはずです。
8. 胸腺の後ろに曲がった先端の鉗子を置き、胸腺をそっと引き抜きます。胸腺の完全性を確認し、2つの接合葉が含まれていることを確認してください。
9. 胸腺を1x PBSで洗浄し、立体顕微鏡下で結合組織と血管を切り取ります。

2. 単離胚性胸腺の培養

1. 培養培地の500 μL(RPMI1640 + 15% 胎児ウシ血清(FBS)+100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。きれいな胸腺を井戸ごとに1つの胸腺で井戸に移します。図1は、培養培養培養における単離された胸腺を表示する。
2. 各胸腺含有によく1.25 mMの最終濃度に2'-デオキシグラノシンを追加します。
3. 単離された胸腺を8日間培養し、培養培養培養剤と2'-デオキシグラノシンの両方を2日ごとにリフレッシュする。

3. 腎カプセル内のサブカプセル空間の確立

1. 針と切り抜いた注入管(図2)を準備するには、はさみを使ってチューブ部分の頭皮静脈針を45°の角度で切ります。
2. ヌードマウスの重量を量り、ペントバルビタール(1.5%)で麻酔注入(75 μg/gのボディ重量)。
3. つま先のピンチに続く反射が見られなかった場合は、手術台の上にマウスを右横の位置に置きます。
4. 0.5%のポビドネヨウ素綿棒で、外科領域で内側から外側に2回皮膚を消毒する。
5. はさみを使用して、左腎領域(最後の肋骨と腸骨の頂点の間)の脊椎に平行な5〜9ミリメートルの皮膚切開を行います。次に、皮下組織と筋肉を切断して腹腔を開き、腎臓を露出させる。
6. 腎臓が露出したら、片手にピンセットを使用して、脊椎側切開エッジから筋肉と脂肪組織を持ち上げます。一方、腎臓をそっと絞り出す(あるいは、腎臓は両手の指を使って絞り出すことができる)。
7. 腎カプセルが手術中に湿っていることを確認するには、生理食液(0.9%NaCl)で腎臓の表面を濡らします。
8. 腎臓カプセルにニックを作成し、ステップ3.1で調製した針先を使用して、右下の腎カプセルを静かに傷つける。ニックのサイズは、腎臓の1/2-2/3幅でなければなりません。腎臓に傷をつけないで下さい。
9. ステップ3.1で調製した注入チューブを腎カプセルのニックにスライドさせます。腎臓カプセル内の3~4mmに達するまで、腎臓の長い側に沿って腎臓と腎臓を穏やかに解離します。注入チューブを引き戻します。腎臓のサブカプセル空間が確立される。

4. 胚性マウス胸腺移植

1. 培養物を枯渇させるために生理生理生理のためにステップ2.3で培養胸腺を2回洗う。
2. ステップ3.1で調製したクリップされた注入チューブを、シリンジ接続インターフェースの注射器に接続します。準備された胸腺を注入管にゆっくりと吸引する。
3. 切り抜いた注入管を腎カプセルにそっと挿入し、優れたポールに到達します。胸腺を腎カプセルに入れ、注射器のプランジャーを静かに押しながらチューブをゆっくりと引き込みます。
4. アルコールランプを使用して、ステップ3.1で調製した針をわずかに加熱します。胸腺全体がサブカプセル空間内であることを確認した後、加熱された針を使用してニックを焼きます。
5. 焼灼後、腹腔内の腎臓を復元する。骨膜と筋肉を縫合する。
6. 変更された中断された垂直マットレス縫合糸を使用して、皮膚切開を閉じます(少なくとも3ノットを結び、余分な糸を切り取ります)。
7. ポビドンヨウ素綿棒を用いて、切開部を消毒する。痛みを和らげるために、フラニキシン(体重2μg/g)の皮下注射を手術中に行い、手術後3日間行った。
8. 麻酔から完全に回復するまで、赤外線ランプの下でマウスを暖かく保ちます。
9. 移植された胸腺を解剖し、前述の5、8、9と同じように表現性分析を行う前に、8週間レシピエントの腎臓カプセルに胸腺を保管してください。

結果

ここでは、2つの完全な葉を含む単離されたE18.5胸腺を示します(図1)。さらに、注入管に斜地を形成するために切り取られた頭皮静脈針を示す(図2)。次に、レシピエントマウス内で8週間の増殖後に腎カプセル(図3A)と胸腺に移植した胸腺の位置の代表的な画像も示す(図3B)。胸腺を移植したヌードマウスでT...

ディスカッション

胚性胸腺の腎皮下移植は、子宮上皮細胞機能および生体内でのT細胞成熟の過程を研究する重要な方法である。胚性胸腺臓器培養と移植に関するいくつかの実験的研究があるが、我々のプロトコルは、マウス胚性胸腺培養および腎皮下に関する簡単な代替手順を提供する古い胸腺組織の移植。

私たちのプロトコルは、いくつか?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Povidone iodine	Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd	20171113
0.9% Sodium Chloride Injection	Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd	2C17112101
1 mL Sterile syringe	Solarbio	YA1090
2’-Deoxyguanosine	MEC	HY-17563	1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate	Corning Incorporated	Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread	NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China	YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish	Corning Incorporated	430166
70% ETOH	LIRCON	20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies	Biolegend	100711	1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1060	To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection	Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd	17062111 079	6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JC2303	To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS?	GIBCO	10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	JD1050	To sterilize before use
Flow cytometry	BD	FACSCanto II
Flunixin meglumine	MACLIN	F810147	1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Infrared lamp	OTLAN	MT-810
Needle holder, JZ 14 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J32010	To sterilize before use
PE anti-mouse CD4	Biolegend	100511	1:100
Penicillin-Streptomycin mixture	GIBCO	15140122	1:100
Pentobarbital sodium salt	Sigma	P3761	1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium	GIBCO	C14-11875-093
Scalp vein needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	XC001
Spring scissors	VANNAS	S11014-12	To sterilize before use
stereomicroscope	OLYMPUS	SZ61
Sterile 15cm cotton swab	Guangzhou Haozheng	20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P	Guangzhou Haozheng	20172640868
Sterile PBS (1x)	GENOM	GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm	Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd.	J41010	To sterilize before use