بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

Summary

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الليفية للبالغين في المرحلة الابتدائية بطريقة سهلة وسريعة وموثوق بها، يمكن تنفيذها من قبل المبتدئين (على سبيل المثال، الطلاب). يجمع الإجراء بين هضم الأنسجة الأنزيمية والهياج الميكانيكي مع الموجات فوق الصوتية للحصول على الخلايا الليفية الأولية. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع متطلبات تجريبية محددة (مثل الأنسجة البشرية).

Abstract

أصبحت الخلايا الليفية الأولية للبالغين أداة هامة لدراسة التليف والتفاعلات الليفية والالتهاب في جميع أنسجة الجسم. وبما أن الخلايا الليفية الأولية لا يمكن أن تقسم إلى أجل غير مسمى بسبب تمايز myofibroblast أو تحريض الحساسية، يجب إنشاء ثقافات جديدة بانتظام. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات التي يجب التغلب عليها خلال عمليات وضع بروتوكول عزل موثوق بها والعزلة الليفية الأولية نفسها: درجة صعوبة الأسلوب (وخاصة للمبتدئين)، وخطر التلوث البكتيري، و الوقت المطلوب حتى يمكن استخدام الخلايا الليفية الأولية للتجارب، ونوعية الخلايا اللاحقة وصلاحيتها. في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول سريع وموثوق به وسهل التعلم لعزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية للبالغين من قلب الماوس والرئة والكبد والكلى التي تجمع بين الهضم الأنزيمي والهياج بالموجات فوق الصوتية.

Introduction

الخلايا الليفية هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات ستيلات متعددة وreticulum endoplasmic واسعة النطاق^1،2. متوسط قياس الليفية 30 - 100 ميكرومتر ولها مدىالحياة من 57 ± 3 أيام 1،^3. متوسط مدة دورة الخلية من الخلايا الليفية البشرية تتراوح بين 16 - 48 ساعة اعتمادا على ظروف الثقافة⁴. هناك أدلة على أن القدرة المستنسخة والجودة الوظيفية للفليائيات الأولية المستزرعة ترتبط سلبا مع سن المانحين، مما يشير إلى أنه ينبغي تفضيل المانحين الأصغر سنا (الحيوانات أو المرضى) إذا كان ذلك ممكنا^5و6 .

تشكل الخلايا الليفية نوع الخلية السائد لمعظم أنسجة الجسم الثدييات. على الرغم من وجودها في كل مكان، وتحديد الجزيئية من الخلايا الليفية لا يزال تحديا⁷. تنتقل الخلايا الليفية إلى تطوير الأنسجة والأعضاء من مصادر مختلفة أثناء النمو الجنيني⁸. لهذا السبب، هناك عدد كبير من البروتينات علامة التي يمكن العثور عليها في الخلايا الليفية في حين أن البروتينات علامة فريدة من نوعها، والتي هي موجودة في كل السكان الأورام الليفية والحصرية للفليّة، لا تزال مفقودة. وهكذا، عادة ما تستخدم أنماط التعبير من عدة علامات معترف بها لتحديد الخلايا الليفية. من بين العلامات الأكثر شهرة هي فيمنتين، بروتين سطح الليفية البشرية (hFSP)، مستقبلات المجال المديسكوين 2 (DDR2) وألفا الأكتين العضلات الملساء (αSMA).

الخلايا الليفية هي المصفوفة الرئيسية خارج الخلية (ECM) المنتجة لنوع الخلية. وبالتالي، فإن الخلايا الليفية تحافظ علىبنية الأنسجة المنظمة وتوفر الدعم الميكانيكي للخلايا المجاورة 1. التوازن بين توليف إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور هو عملية منظمة تنظيماجيدا. التحولات نحو التوليف علامة على بداية الترسيب ECM المفرطالذي، إذا لم يتم إنهاؤه، يؤدي إلى التليف. يتم التوسط في التليف من قبل myofibroblasts، والتي تنشأ من الخلايا الليفية المنشطة التي تمر التغيرات الجزيئية والفيلونمطية. إحدى السمات المميزة للمقلبين هو تعزيز إفراز ECM والسيتوكينات والتعبير عن خيوط αSMA الدقيقة مرتبة بشكل منظم⁹.

وقد تم الخلايا الليفية الأولية في دائرة الضوء على البحوث الأخيرة التي تركز على التليف, التهاب الأنسجة والتفاعلات الليفية السرطان الخلية^10,11. ومع ذلك، لدراسة فعالة خصائص الخلايا الليفية في الصحة والمرض، فمن الضروري لعزل الخلايا الليفية الأولية القابلة للحياة الكبار على أساس منتظم. هناك العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الليفية^12،13،14. الطرق الرئيسية الثلاثة لعزل الليفية هي النمو من قطع الأنسجة¹²، هضم الأنسجة الأنزيمية¹⁵، والتسريب الأنزيمي للأعضاء جوفاء^9،13،16. ميزة النمو هو عملية عزل لطيف دون تدهور الخلايا الأنزيمية. ومن ناحية أخرى، عادة ما تتطلب ثقافات النمو فترات ثقافية مطولة حتى يمكن استخدام الخلايا للتجارب. الهضم الأنزيمي الشائع سريع ولكنه يحمل خطر التلوث مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، الخلايا البطانية) أو البكتيريا في عملية التحريض، وهو أمر ضروري لحل الأنسجة ميكانيكيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون مفصلة وتتطلب وقتا ومهارة للتعلم.

وفيما يتعلق بأهمية الخلايا الليفية الأولية في البحوث، لا تزال هناك حاجة إلى تحسين نُهج عزل الخلايا القائمة من حيث السرعة والبساطة والموثوقية. هنا، يتم توفير طريقة جديدة العزل الأورام الليفية الأنزيمية المستندة إلى الموجات فوق الصوتية تقديم خلايا عالية الجودة.

Protocol

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات من جامعة دريسدن التقنية، ألمانيا (رقم الملف: T 2014/4) وكذلك المبادئ التوجيهية المقبولة دوليا لرعاية الحيوانات (FELASA)¹⁷. يصور الشكل 1 عملية عزل الخلية.

1. إعداد الإعداد والمواد ووسائل الإعلام

1. إعداد ثقافة الخلية المتوسطة، حل PBS، كولاجيناز مزيج الأوراق المالية الحل (إعادة تشكيل 50 ملغ من مزيج الكولاجين الليوفيل في 12 مل من المياه المعقمة فائقة النقية)، و 0.25٪ تريبسين الحل.
2. الاحماء المتوسطة، وPBS والحل التربسين إلى 37 درجة مئوية.
3. سخن حمام الماء بالموجات فوق الصوتية إلى 37 درجة مئوية.
4. تطهير ملقط، ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ، مشرط (2X مشرط لكل جهاز) و2 أكواب زجاجية مع الإيثانول 70٪ ووضع هذه المواد تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
5. ملء كوب واحد مع الإيثانول 70٪ والآخر مع الماء المعقمة أو حل PBS. هذه الأكواب مطلوبة لتطهير وغسل الصك بعد كل موكب الجهاز.
6. وضع أنابيب بلاستيكية معقمة 15 مل تحتوي على PBS الباردة على الجليد الرطب. يعتمد عدد الأنابيب على عدد الأعضاء التي تريد عزل الخلايا الليفية منها.

2. تشريح الماوس وإزالة الأعضاء

1. ارتداء اثنين من أزواج من القفازات واحدة فوق الأخرى، لذلك يمكن إزالة الزوج الأول بمجرد تشريح الحيوان.
   ملاحظة: يمنع هذا الإجراء البكتيريا من فرو الحيوان وجلده من الانتشار على الأعضاء.
2. قتل الفأر (على سبيل المثال، خلع عنق الرحم) ودبوس الذبيحة مع الإبر إلى كل طرف إلى وسادة البوليسترين.
3. تطهير الذبيحة الماوس باستخدام رذاذ الإيثانول 70٪. تأكد من أن الفراء غارقة في الإيثانول حتى الشعر لن دوامة.
4. قطع الفراء الحق فوق الجهاز البولي التناسلي باستخدام ملقط الجراحية ومقص الصادم. قطع الجلد جنبا إلى جنب مع خط الوسط من نقطة الشق الأولي إلى الرقبة (3 - 4 سم) وإضافة قطع الإغاثة في الأطراف.
   تحذير: لا تثقب الطبقة العضلية في هذه الخطوة لتجنب التلوث البكتيري!
5. دبوس الجلد إلى وسادة رغوة البوليسترين للوصول الأمثل إلى العضلات التي تغطي تجويف البطن.
6. تطهير عضلات البطن مرتين باستخدام الإيثانول 70٪. دع الإيثانول يجف قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
7. إزالة الزوج الأول من القفازات. استخدام مجموعة جديدة، معقمة من ملقط ومقص.
8. فتح تجويف البطن والصدر عن طريق قطع الطبقة العضلية مع مقص الجراحية لإزالة بلطف الأعضاء المختارة. لذلك، عقد الجهاز بلطف مع ملقط الجراحية (لا تخترق الجهاز، واستخدام الحد الأدنى من الضغط) وقطع الأوعية الدموية توريد بالقرب من نقطة الدخول في الجهاز مع مقص.
9. وضع الأعضاء في أنابيب معقمة تحتوي على PBS الباردة. أغلق الأنابيب بإحكام. ضع الأنابيب على الجليد الرطب حتى تستمر مع الخطوة 3.1.

3. الأنسجة الفرم والهضم واستخراج الخلايا

1. نقل الأنابيب تحت غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة.
   تحذير: ارتداء زوج جديد من القفازات وتطهير الأنابيب مع الإيثانول 70٪ قبل نقلها تحت غطاء محرك السيارة!
2. إخراج الجهاز من أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقمة. ضع الجهاز على نصف طبق بيتري معقم 6 سم واغسل الجهاز لفترة وجيزة مع PBS لإزالة الدم الزائد. نقل الجهاز إلى النصف الثاني من طبق بيتري، وإزالة PBS الزائدة.
3. يُمْكِنُ أَنْ يَكُونَ يَستعملَ مشرطان معقمة. يجب ألا تكون شظايا الأنسجة المتبقية أكبر من 1 - 2 مم.
4. نقل الأنسجة المفرومة في أنبوب جديد معقم 15 مل باستخدام ملعقة معقمة وإضافة 2 مل من 0.25٪ محلول التربسين. ضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. دوامة الأنبوب بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
6. وقف رد فعل التربسين تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية عن طريق إضافة 4 مل FCS التي تحتوي على خلية الثقافة المتوسطة (دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM)، على سبيل المثال).
7. إضافة 250 ميكرولتر من محلول مزيج الكولاجين إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة القلب أو الرئة و 100 ميكرولتر للكلى أو الكبد، على التوالي.
8. وضع الأنابيب في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية (37 درجة مئوية) وتفعيل sonicator بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: حمام المياه بالموجات فوق الصوتية المستخدمة في هذا البروتوكول لديه تردد التشغيل من 35 كيلوهرتز وقوة قصوى من 320 W.
9. دوامة الأنابيب بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
10. وضع الأنابيب مرة أخرى في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة.
11. دوامة بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
12. تطهير الأنابيب مع الإيثانول 70٪ ونقلها تحت غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة.
13. قم بتصفية الحل باستخدام شبكة بـ 40 درجة في أنبوب جديد معقم بـ 15 مل.
14. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
15. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من المتوسطة الطازجة.
16. نقل الخلايا إلى وعاء ثقافة الخلية مناسبة (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) ووضع السفينة في حاضنة ثقافةالخلية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
17. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة، وغسل 3 مرات مع PBS، ثم إضافة المتوسطة الطازجة (حجم المضافة يعتمد على السفينة ثقافة الخلية من الاختيار، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا الخ).
18. تغيير المتوسط كل يومين.
    ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا الليفية بعد الوصول إلى التقاء بصري من 90٪ (عادة بعد 5-7 أيام).

النتائج

وقد ثبت قدرة هذا البروتوكول على عزل الخلايا الليفية للبالغين من أنسجة المورين الصلبة. تم الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة التي يمكن استخدامها للتجارب اللاحقة مثل تلطيخ المناعة أو تجارب الانتشار (الشكل2D-F، الشكل 5A).

Discussion

بالمقارنة مع خطوط الخلايا الليفية الخالدة، تقدم الخلايا الليفية الأولية العديد من المزايا. ويمكن عزلها من حيث التكلفة بشكل فعال في نوعية عالية وكمية. وعلاوة على ذلك، توفر الثقافات الأولية إمكانية دراسة الخلايا من أفراد متعددين، مما يزيد من موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها ويقلل من ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577