超声波增强原成人成纤维细胞隔离

摘要

我们提出了一种方案,以简单、快速和可靠的方式分离主要成人成纤维细胞,由初学者(例如学生)执行。该程序结合酶组织消化和机械搅拌与超声波获得原成纤维细胞。该协议可以很容易地适应特定的实验要求(例如,人体组织)。

摘要

原发性成人成纤维细胞已成为研究所有身体组织纤维化、成纤维细胞相互作用和炎症的重要工具。由于原纤维细胞不能由于肌纤维细胞分化或衰老诱导而无限期分裂,因此必须定期建立新的培养物。然而,在制定可靠的隔离协议和初级成纤维细胞隔离过程中,有几个障碍需要克服:该方法的难度程度(尤其是初学者),细菌污染的风险,所需时间,直到原纤维细胞可用于实验,以及随后的细胞质量和生存能力。在这项研究中,提供了一种快速、可靠和易于学习的协议,从小鼠心脏、肺、肝脏和肾脏中分离和培养原发性成人成纤维细胞,结合酶消化和超声波搅拌。

引言

纤维细胞是扁平的,主轴状细胞,具有多个硬质处理和广泛的粗糙内质视网膜1,2。平均成纤维细胞测量30-100μm,寿命为57~3天1,3。人类成纤维细胞的平均细胞周期持续时间范围为16-48小时,取决于培养条件4。有证据表明,培养的原纤维细胞的复制能力和功能质量与捐赠年龄呈负相关,这表明,如果可能的话,应优先考虑较年轻的捐赠者(动物或患者).

纤维细胞是大多数哺乳动物身体组织的主要细胞类型。尽管成纤维细胞无处不在,但成纤维细胞的分子识别仍然是一^个挑战。在胚胎发育期间,纤维细胞从不同来源迁移到发育中的组织和器官8。因此,在成纤维细胞中可以找到过多的标记蛋白,而独特的标记蛋白,存在于每个成纤维细胞种群中,并且独有成纤维细胞,仍然缺失。因此,几个识别标记的表达模式通常用于识别成纤维细胞。其中最知名的标记物包括维他命素、人纤维细胞表面蛋白(hFSP)、迪斯科丁域受体2(DDR2)和α平滑肌活动素(αSMA)。

纤维细胞是主要的细胞外基质(ECM)产生细胞类型。因此,成纤维细胞维持有序的组织结构,并为邻近^细胞1提供机械支持。ECM 合成和降解之间的平衡是一个调节良好的过程。转向合成标志着过度ECM沉积的开始,如果不终止,会导致纤维化。纤维化由肌纤维细胞介导,肌纤维细胞起源于经过分子和表型变化的活化成纤维细胞。肌纤维细胞的一个标志是增强ECM和细胞因子的分泌和有序排列的表达[SMA微丝9。

原纤维细胞一直是最近研究的焦点,重点是纤维化,组织炎症和成纤维细胞-癌症细胞相互作用10,11。然而,为了有效地研究成纤维细胞在健康和疾病的特性,有必要定期分离可行的原发成人成纤维细胞。有几种方法可以分离成纤维细胞12,13,14。成纤维细胞分离的三种主要方法是从组织块12、酶组织^消化15和中空器官的酶灌注9、13、16中生长。生长的优点是温和的隔离过程,没有酶细胞降解。另一方面,生长外培养物通常需要较长的培养期,直到细胞可用于实验。常见的酶消化是快速的,但承担与其他细胞类型(例如,内皮细胞)或细菌在搅拌过程中的污染风险,这是机械溶解组织所必需的。此外,这些方法往往是复杂的,需要时间和技能来学习。

关于原成纤维细胞在研究中的重要性,仍然需要在快速性、简单性和可靠性方面优化现有的细胞隔离方法。这里提供了一种提供高质量细胞的新型超声波酶成纤维细胞分离方法。

研究方案

以下协议遵循德国德累斯顿理工大学的机构动物护理指南(文件号:T 2014/4)以及国际公认的动物护理指南(FELASA)¹⁷。图 1可视化细胞分离过程。

1. 准备设置、材料和介质

1. 制备细胞培养基、PBS溶液、胶原酶混合库存溶液(在12 mL无菌超纯水中重组50mg冻胶酶混合物)和0.25%胰蛋白酶溶液。
2. 将介质、PBS 和胰蛋白酶溶液预热至 37°C。
3. 将超声波水浴预热至37°C。
4. 消毒钳子、不锈钢铲、手术刀(每个器官 2x 手术刀)和 2 个玻璃烧杯,70% 乙醇,并将这些材料置于细胞培养罩下。
5. 将一个烧杯装满 70% 乙醇,另一个用无菌水或 PBS 溶液填充。这些烧杯需要消毒和清洗仪器后,每个器官游行。
6. 将含有冷PBS的无菌15 mL塑料管放在湿冰上。管的数量取决于你想从中分离成纤维细胞的器官数量。

2. 小鼠解剖和器官切除

1. 戴两副手套,一双手套,一旦动物被解剖,就可以取出第一副手套。
   注:此程序可防止动物毛皮和皮肤的细菌扩散到器官上。
2. 将小鼠安乐死(例如,宫颈脱位),用针头将尸体固定在聚苯乙烯垫上。
3. 使用 70% 乙醇喷雾对小鼠尸体进行消毒。确保毛皮浸泡在乙醇中,这样头发就不会旋转。
4. 使用手术钳和创伤性剪刀将皮毛切到泌尿生殖道上方。从最初切口到颈部(3 - 4 厘米)的中线处切皮肤,并在四肢上添加松流。
   注意:不要穿孔肌肉层在此步骤,以避免细菌污染!
5. 将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫垫上,以最佳地接触覆盖腹腔的肌肉。
6. 使用70%乙醇对腹部肌肉消毒两次。在继续下一步之前,先让乙醇干燥。
7. 取下第一副手套。使用一套新的无菌钳子和剪刀。
8. 用手术剪刀切开肌肉层,轻轻去除选择的器官,打开腹腔和胸腔。因此,用手术钳轻轻握住器官(不要刺穿器官,使用最小压力),用剪刀在器官进入点附近切开供供血管。
9. 将器官放入含有冷PBS的无菌管中。紧闭管子。将管子放在湿冰上,直到继续执行步骤 3.1。

3. 组织切碎、消化和细胞提取

1. 将管子转移到无菌细胞培养罩下。
   注意:戴上一双新鲜的手套,用70%乙醇对管子进行消毒,然后再将其转移到引擎盖下!
2. 使用无菌钳子将器官从 15 mL 管中取下。将器官放在无菌 6 厘米培养皿的一半上,用 PBS 短暂清洗器官以去除多余的血液。将器官转移到培养皿的后半部分,去除多余的PBS。
3. 使用两个无菌手术刀切碎组织。剩余的组织碎片不应大于 1 - 2 mm.
4. 使用无菌铲将切碎的组织转移到新的无菌 15 mL 管中,并加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶溶液。将管子放入37°C的细胞培养箱中5分钟。
5. 轻轻旋转管(约 1400/分钟)10 秒。
6. 通过添加4mL FCS含有细胞培养基(Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM),停止细胞培养罩下的胰蛋白酶反应。
7. 在每个含有心脏或肺组织的管中加入250μL胶原酶混合溶液,分别为肾脏或肝脏添加100μL。
8. 将管子放入超声波水浴(37°C)中,激活超声波声波器10分钟。
   注:本协议中使用的超声波水浴工作频率为35 kHz,最大功率为320 W。
9. 轻轻旋转管子(约 1400/分钟)10 秒。
10. 将管子再次放入超声波水浴中 10 分钟。
11. 涡旋轻轻(约1400/分钟)为10秒。
12. 用70%乙醇消毒管子,并将其转移到无菌细胞培养罩下。
13. 用40μm网格过滤溶液,放入新的无菌15 mL管中。
14. 将管在 500 x g下离心 5 分钟。
15. 去除上清液,在1mL的新鲜介质中重新悬浮颗粒。
16. 将细胞转移到合适的细胞培养容器(例如6孔板),并在37°C和5%CO2下将细胞培养箱置于细胞培养箱中过夜。
17. 第二天,取出介质,用PBS洗涤3次,然后添加新鲜的介质(添加的体积取决于选择的细胞培养容器,6孔板每孔2mL等)。
18. 每隔一天更改一次媒体。
    注:纤维细胞在达到90%的光学汇合后(通常在5-7天后)可以分裂。

结果

证明了该方案从固体鼠组织中分离成人成纤维细胞的能力。获得了可行的成纤维细胞,可用于后续实验,如免疫荧光染色或增殖实验(图2D-F,图5A)。

成人成纤维细胞是扁平主轴状细胞,具有多个细胞过程,通常在单层12、18中生长。所得结果反映了这些形态特征,表明不?...

讨论

与不朽的成纤维细胞系相比,原纤维细胞具有几个优点。它们可以以高质量和数量经济高效地隔离。此外,初级培养物提供了研究来自多个个体的细胞的可能性,从而提高了获得的结果的可靠性,并降低了仅仅研究细胞培养物的可能性。持续产生新的初级文化可以防止基因改变,这通常发生在反复^传递21之后。此外,细胞衰老22,23或增加的肌纤维细胞分化在高

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577